本发明属于生物防治领域，具体地说，涉及枯草芽孢杆菌tkm-1及其应用。
背景技术
据联合国粮农组织(fao)统计，从1988年开始，中国苹果的栽培面积就占居了世界第一位，栽培面积和总产量约占世界苹果栽培总面积和总产量的2/5和1/3。随着产量增加及连年种植，导致苹果各种病害频繁发生，其中苹果腐烂病是其中发病广泛、危害严重的真菌性病害之一。
苹果腐烂病俗称臭皮病、烂皮病、串皮病，东亚地区的病原菌为苹果黑腐皮壳菌(valsamalimiyabeetyamada)，属子囊菌亚门真菌。秋季形成子囊壳，子囊孢子无色，单胞无性世代为苹果干腐烂壳蕉孢菌(cytosporamandshuricamiura)，属半知菌亚门真菌。于树皮下形成分生孢子座(小黑粒点)，产生多个分生孢子器。分生孢子无色，单胞，腊肠形。苹果树腐烂病主要侵害苹果树的主枝、主干、果实等多个部位,导致枝干残缺，树势衰弱、产量下降,是一种分布广、危害重的苹果病害。严重时造成枝枯，结果能力下降，甚至整株死亡。幼树和苗木也可被害，但发病较少。发病初期从外表不易识别，如果掀开枝干的表皮，可见到暗褐色或红褐色湿润的小斑或黄褐色的干斑，或者内部病变严重，外部仍不好识别。受害较重时，皮层腐烂坏死，用手指按下即下陷。病皮极易剥离，烂皮层红褐色，湿腐状时有酒糟味。发病后期，病部失水干缩变黑褐色下陷，并在表皮产生黑褐色小点粒，即分生孢子器，成为再发病的传染源。
果树腐烂病是真菌引致的植物病害，通常在果树进入结果期后，开始发生，随着树龄的增加和产量的不断提高，腐烂病会逐年增多，持续低温、冻害，夏季高温、干燥及管理粗放等都会导致树势衰弱，致使腐烂病成为果树进入盛果后发病面积最广、危害最严重的病害。
目前对果树腐烂病的防治主要以化学防治为主，防治成本高且不彻底，长期反复和大量使用化学农药会引起土壤、水体和大气污染，农药残留增加，食品安全性问题日益严重；并且化学农药在杀灭病原菌的同时也容易破坏周边生态环境。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一株对苹果腐烂病具有显著防治效果的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)tkm-1。
本发明的另一目的是提供枯草芽孢杆菌tkm-1在防治植物病害中的应用。
为了实现本发明目的，发明人从河北省平泉市小寺沟镇某苹果种植园，在分离苹果腐烂病病菌的过程中，从病斑样本上通过常规方法分离纯化得到一株对苹果腐烂病具有显著防治效果的菌株tkm-1，根据菌株tkm-1的菌学特征及16srdna测序结果(seqidno:1)，将其鉴定为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)。菌株tkm-1现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号cgmccno.14950，保藏日期2017年11月22日。
菌株tkm-1具有较强的抑制病原菌生长的能力，通过无毒性试验、溶血性试验等，证明该菌对人体无毒无害，溶血阴性。
本发明还提供一种病原菌抑制剂，其活性成分为枯草芽孢杆菌tkm-1和/或其代谢产物。
所述病原菌抑制剂对苹果黑腐皮壳菌(valsamalimiyabeetyamada)、镰刀菌属(fusarium)真菌，如香蕉巴拿马病原菌尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)具有抑制作用。此外，tkm-1对大多数真菌具有生防效果。
本发明还提供一种植物病害抑制剂，其活性成分为枯草芽孢杆菌tkm-1和/或其代谢产物。
所述植物病害包括苹果腐烂病、香蕉巴拿马病、植物根腐病。
其中，所述苹果腐烂病是由苹果黑腐皮壳菌引起的。
本发明还提供所述枯草芽孢杆菌tkm-1的下述任一种应用：
1)枯草芽孢杆菌tkm-1在抑制病原菌中的应用；
2)枯草芽孢杆菌tkm-1在制备病原菌抑制剂中的应用；
3)枯草芽孢杆菌tkm-1在抑制植物病害中的应用；
4)枯草芽孢杆菌tkm-1在制备植物病害抑制剂中的应用。
1)-4)中，所述病原菌包括苹果黑腐皮壳菌、镰刀菌属(fusarium)真菌；所述植物病害包括苹果腐烂病、香蕉巴拿马病、植物根腐病。
通过发酵培养方式，可将菌株tkm-1制成富含活菌、酶和代谢产物的发酵粉剂、发酵液或菌粉粉剂及田间扩繁产物。
具体应用时，可将所述枯草芽孢杆菌的发酵液按照每100ml发酵液与0.6-2.0kg红糖、0.3-1.5kg复合肥、100-500g虾蟹粉和200kg水进行混合，于25℃-30℃培养，每隔1h搅拌一次，培养至活菌数为100-500亿cfu/ml，将菌剂稀释100-1000倍喷施于患病部位。
所述枯草芽孢杆菌发酵液的制备方法为：将枯草芽孢杆菌接种至lb培养基中，30-32℃发酵培养24-48h后，经浓缩后得到。
其中，所述lb培养基成分：酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠10g/l、葡萄糖20g/l。
所述复合肥中n:p2o5:k2o质量比为15-17:15-17:15-17，优选15:15:15。
优选地，喷施前，还包括向所述稀释后的菌剂中加入终浓度0.0005％-0.001％无患子提取液的步骤。
所述无患子提取液的制备方法为：将无患子种皮烘干粉碎，加水提取，60℃回流2h，提取3次，过滤，将过滤后的提取液混合均匀后进行浓缩，获得浓缩后的无患子提取液；其中，提取液与原料的质量比为4:1。
本发明通过在苹果腐烂病病株上通过筛选得到的一种具有对腐烂病病原菌具有拮抗作用的枯草芽孢杆菌tkm-1。将该菌制成菌剂或田间扩大培养，采用对果、枝干喷洒、涂抹的方式对腐烂病进行预防和控制。实验证明，本方法能够有效地防止腐烂病斑扩大，促生患病部位干化、愈合，病斑变小，同时对人畜无害，环境友好，不易产生抗药性，伤口愈合快，病疤复发率低，可有效避免化学农药过多应用带来的一系列问题，在农业生产中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌tkm-1对腐烂病病原菌的抑制效果；其中，a、b分别为a为枯草芽孢杆菌tkm-1对病原菌的抑菌圈，b为空白对照。
图2为枯草芽孢杆菌tkm-1菌落形态。
图3为枯草芽孢杆菌tkm-1镜检图片。
图4为枯草芽孢杆菌tkm-1对病原菌的抑菌圈。
图5为枯草芽孢杆菌tkm-1代谢产物对病原菌的抑菌圈。
图6为病原菌受枯草芽孢杆菌tkm-1抑制和对照组在显微镜下的图片；其中，a为受到枯草芽孢杆菌tkm-1抑制后，苹果腐烂病病原菌的菌丝图，b为正常无干涉情况下菌丝显微镜下图片。
图7为枯草芽孢杆菌tkm-1对苹果腐烂病治愈后的病斑图片。
图8为无患子提取液稀释倍数与表面张力值变化曲线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中涉及的百分含量，若无特殊说明，均为质量百分含量。
实施例1枯草芽孢杆菌tkm-1的分离和鉴定
1、本发明可防治苹果腐烂病的细菌菌株tkm-1采自河北省平泉市小寺沟镇某苹果种植园，是在分离苹果腐烂病病菌的过程中，从病斑样本上通过常规方法分离得到的。选取带病斑组织块，利用酒精和盐水进行表面消毒后，无菌水清洗几遍，待组织表面水分晾干后，将组织菌液放在pda平板表面，在28℃培养箱中进行培养，每天观察一次，记录平板表面变化。在生长过程中，真菌菌丝和细菌同时出现，挑取其中对真菌抑制且形成抑制圈的细菌菌落进行纯化培养，并利用lb培养基活化，置于4℃冰箱内，备用。
其中，pda培养基的配制方法如下：去皮土豆200g，水煮过滤，留滤液，向土豆滤液中加入葡萄糖20g,硫酸镁1.5g,维生素b1100mg，磷酸二氢钾3g,利用蒸馏水定容至1l。lb固体培养基的配方为：酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠10g/l、葡萄糖20g/l、琼脂粉20g，定容至1000ml。
2、枯草芽孢杆菌tkm-1的筛选
将苹果腐烂病病原菌接种于pda平板上，在28℃下培养3-5天，取2个菌饼(菌饼直径2-3mm)点接于pda平板上，菌饼均匀分布在平板中心点两侧，三点在一线；在十字垂直方向分别利用滤纸片接种纯化后的菌株培养液(活菌数为2×108-10×108cfu/ml)，空白为直接病原菌为对照，每个处理3个重复，28℃进行培养。
待空白对照平板上真菌菌落长满平皿后，观察抑菌圈的大小和有无，通过测量病原菌和细菌菌落的最近距离(抑菌透明圈)作为抑菌强弱的标志，这个距离与对照组菌落的半径比例可作为抑菌率参考。
抑菌率＝(对照菌落半径-处理菌落半径)/(对照平板菌落半径-菌饼半径)×100％。
试验表明：枯草芽孢杆菌tkm-1对苹果腐烂病病原菌的抑制效果最好，透明区域最大，抑制率可达76.1％(图1)。
3、抗腐烂病枯草芽孢杆菌的鉴定
图2为本发明菌株枯草芽孢杆菌tkm-1菌落形态图。对步骤2选出的菌落进行革兰氏染色后，显微镜下观察菌体的形态特征，图3为枯草芽孢杆菌tkm-1的革兰氏染色后形态图。
通过观察，枯草芽孢杆菌tkm-1为杆状细菌，革兰氏染色阳性，单菌落未圆形，乳白色、奶油状、不透明，中间隆起粗糙，边缘不完整。
通过生理生化特征测定方法得到，菌株tkm-1最适宜培养基为lb-培养基，最适合生长温度为28℃-37℃，适合生长ph为5-9；为好氧菌，厌氧条件下生长较慢；可利用丙二酸盐及柠檬酸盐做碳源；菌株过氧化氢试验阳性；甲基红试验呈阳性反应；v-p试验阳性；溶血试验阴性。
进一步对枯草芽孢杆菌tkm-1进行16srdna鉴定(测序结果见seqidno:1)，确定该菌为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)。
实施例2枯草芽孢杆菌对腐烂病病原菌的抑制率测定
通过平板对峙法，检测枯草芽孢杆菌tkm-1对苹果腐烂病病原菌的抑制效果，测定方法与实施例1中步骤2方法相同。苹果腐烂病病原菌苹果黑腐皮壳属真菌valsamali为病株样本筛选。通过多次平行试验，得出菌种枯草芽孢杆菌tkm-1对苹果腐烂病的抑制率如表1所示。枯草芽孢杆菌tkm-1对病原菌的抑菌圈见图4。
表1通过三次平行试验得到对苹果腐烂病病原菌的抑制率
实施例3枯草芽孢杆菌tkm-1无菌滤液对腐烂病病原菌的抑制率测定
发酵滤液的制备：将枯草芽孢杆菌tkm-1接种于含有100mllb液体培养基的250ml三角瓶中，于30℃振荡24-48h至od600＝2.65，获得的发酵液经10000r/min离心10min后，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，既得无菌滤液。
利用牛津杯在pda平皿上留出两孔，两孔间距和病原菌接种方式均与实施例1中步骤2相同，取100μl无菌滤液加入孔中，对照试验用无菌水代替滤液，28℃培养4天，观察滤液抑菌效果，测量菌落直径计算抑菌率。设置三组平行试验，计算方式同实施例1中步骤2。
结果表明，枯草芽孢杆菌tkm-1的无菌发酵滤液对苹果腐烂病病原菌有明显的抑制效果。拮抗效果如图5所示，抑菌率达到64％。
实施例4枯草芽孢杆菌tkm-1培养液对腐烂病病原菌的抑制作用
将苹果黑腐皮壳属真菌valsamali接种至pda平板上，28℃培养3天，得到病原菌的pda培养物，取菌饼(菌饼直径2-3mm)点接于另一pda培养基中心两侧位置，然后将枯草芽孢杆菌tkm-1培养液(活菌数＞6×108cfu/ml)浸湿无菌滤纸片后，呈十字垂直方向，对称放两个滤纸片。培养3-5天后，镜检观察菌丝情况。菌丝生长情况与镜检图片如图6所示。
通过镜检发现，离无菌滤纸片较近的病原体的菌丝呈稀疏线型，无节状突起，无孢子，而空白对照的菌丝体，长势旺盛茂密，菌丝体上有很多节状突起，有孢子出现。说明无菌滤液对病原菌的繁殖起到了很好的抑制作用。
实施例5与化学防治苹果腐烂病方法的比较
将菌株tkm-1培养液与其他几种常见的苹果腐烂病化学防治方法进行了横向比较，结果如表2所示。
表2
结果表明，利用tkm-1培养液进行处理后，苹果腐烂病病斑明显变小，同时与其他几个处理组相比，复发率最低，通过叶面喷施、灌根处理后，苹果病株免疫力增强，长势良好。
实施例6田间应用实例
将枯草芽孢杆菌tkm-1发酵液按照每100ml发酵液与1kg红糖、1kg复合肥、200g虾蟹粉和100kg水进行混合，于25℃-30℃培养，每隔1h搅拌一次，培养至活菌数为100-500亿cfu/ml，将菌剂稀释100-1000倍喷施于患病部位。结果表明，苹果腐烂病部位病斑不再扩大，表层慢慢变干，同时病斑面积有变小趋势。腐烂病治愈后的病斑如图7所示。
其中，所述枯草芽孢杆菌发酵液的制备方法为：将枯草芽孢杆菌接种至lb培养基中，32℃发酵培养36h后，经浓缩后得到。
所述lb培养基成分：酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠10g/l、葡萄糖20g/l。
所述复合肥购自施可丰化工股份有限公司(鲁)xk13-001-00005，所述复合肥中n:p2o5:k2o质量比为15:15:15。
实施例7提高枯草芽孢杆菌tkm-1培养液传质能力的方法
无患子提取液是一种从无患子植物果皮或种皮中提取的一种天然皂素，这种皂素也是一种表面活性剂，无患子提取液与tkm-1培养液联合使用，可降低培养液的表面张力，从而使得培养液中的成分扩散更快。
根据实施例6，喷施前，还包括向所述稀释后的菌剂中加入终浓度0.0005％-0.001％无患子提取液的步骤。
无患子提取液的制备方法为：将无患子种皮烘干粉碎，加水提取，60℃回流2小时，提取3次，过滤，将多次过滤后的提取液混合均匀后进行浓缩，获得浓缩后的无患子提取液。提取液与原料的质量比为4:1。
利用表面张力仪检测无患子提取液的表面张力值，将无患子提取液进行梯度稀释，稀释倍数分别为5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5000倍和10000倍，其相对于无患子提取液原液的浓度分别为0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.002、0.001、2e-4、1e-4，然后利用所得数值绘制曲线(图8)。
由图8可看出，无患子提取液浓度越高，其表面张力越小，从10倍到10000倍时，其表面张力由30mn/m提高至55mn/m左右，稀释倍数高于10000倍以上时，表面张力趋于稳定。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>北京泰克美高新技术有限公司
<120>枯草芽孢杆菌tkm-1及其应用
<130>khp181113428.9
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1494
<212>dna
<213>枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)
<400>1
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