纤维素酶-金属有机框架复合催化剂及其制备方法和用途与流程

本发明属于催化剂技术领域，具体涉及一种纤维素酶-金属有机框架复合催化剂及其制备方法和用途。

背景技术

纤维素酶能够催化断裂纤维素中的β-(1-4)糖苷键，是生物能源转化利用等生化精炼行业的重要催化剂。虽然纤维素酶能够高效水解纤维素，理论上完全可以实现生物质乙醇行业的大规模应用，然而其脆弱的蛋白质本质极大限制了其实际应用价值。面临复杂多变的应用环境，例如ph波动、高温及、化学试剂等，纤维素酶非常容易失去活性，即便在严格的低温环境下储存，纤维素酶也在不可逆的逐渐失活。此外，单一纤维素酶在应用时为均相环境，其回收再利用几乎难以实现，这也对未来的大规模应用提出了更高的成本要求。虽然纤维素酶本身的水解活性足以成为未来生物新能源领域的重要担当，然而脆弱的特性成为其商业应用的坚实壁垒。开发一种新型的技术手段，构建基于纤维素酶的复合稳定催化体系，全面提升纤维素酶的稳定性及可回收利用性，以满足经济性和稳定性的需求，这对于未来生物能源行业的发展具有举足轻重的意义。

负载法是经过众多研究证明的高效酶修饰法，通过物理吸附作用或者化学键合手段将酶与特定载体结合，利用载体为酶提供保护，以获得高稳定性的复合酶催化体系。化学键合法能够牢固的将酶与载体结合，但在合成过程中酶首先就要经受化学试剂的侵蚀，活性受到极大影响，而且化学键合法的操作复杂，难以适应大规模应用对方法简易操作性的需求。相反地，物理负载法操作及其简便，负载量中等，同样可以为酶提供稳定性保护支持，而且其可逆的吸附作用为特定蛋白质结构的展开和折叠提供了可能，在实际应用中往往表现出优于化学负载法的效果。物理负载法的限制在于寻找合适的载体，以满足稳定性及催化活性的多重要求。

金属-有机框架(mofs)材料是过去二十年里冉冉升起的明星材料，其具有周期性的多孔骨架结构，孔隙率和功能性均可以进行人为目标调控，结合其高度结晶化的本质，在催化、传感及光电等领域发挥着重要作用。在众多被报道的mofs材料中，基于zr基无机节点的mofs材料以其超高的孔隙率、热稳定性及化学稳定性而受到广泛关注。zr基mofs材料的热稳定性高达500℃以上，在常见的各类有机、无机溶剂中均不溶解，在ph值＝1-11的超广范围内具有极强的耐受性，合成方法简单高效，适宜大规模操作，并可以通过成熟的纳米化策略方便地从纳米到毫米尺度精准调控材料的粒径尺度。此外，系统可替换的功能配体单元为zr基mofs材料的多功能性提供了有力保障。因此，zr基mofs材料可以作为负载纤维素酶的潜在有效载体。

技术实现要素：

本发明的目的是解决单一纤维素酶所存在的低稳定性和不可回收利用性，提供一种纤维素酶-金属有机框架复合催化剂及其制备方法和用途。

纤维素酶-金属有机框架复合催化剂，是以zr基mofs材料作为载体，将纤维素酶负载在其表面得到。

进一步地，所述zr基mofs材料为uio-66或uio-66-nh2。

上述纤维素酶-金属有机框架复合催化剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，制备zr基mofs材料；

步骤2，将zr基mofs材料加至醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，在搅拌条件下加入纤维素酶冻干粉末，继续搅拌反应12h，得到含有纤维素酶-金属有机框架复合催化剂的反应液；

步骤3，将步骤2的反应液离心，底部的产品先后分别用醋酸-醋酸钠缓冲溶液和蒸馏水洗涤，晾干，得到纤维素酶-金属有机框架复合催化剂；

其中，醋酸-醋酸钠缓冲溶液的ph为4.8。

进一步地，所述zr基mofs材料为uio-66或uio-66-nh2。

进一步地，步骤2中纤维素酶和uio-66-nh2的用量比为5-25mg：20mg。

进一步地，所述醋酸-醋酸钠缓冲溶液的浓度为50mm。

进一步地，步骤3中离心条件为4000rpm、10min。

进一步地，uio-66-nh2的制备过程为：将zrcl4与2-氨基-1,4-对苯二甲酸溶于dmf中，在120℃反应24h后，冷却到室温，过滤，用dmf、乙醇分别洗涤，于70℃烘箱放置12h烘干后，获得平均粒径为52nm的uio-66-nh2。

进一步地，uio-66的制备过程为：将zrcl4与1,4-对苯二甲酸溶于dmf中，在120℃反应24h后，冷却到室温，过滤，用dmf、乙醇分别洗涤，于70℃烘箱放置12h烘干后，获得平均粒径为50nm的uio-66。

上述纤维素酶-金属有机框架复合催化剂在催化降解纤维素中的应用。

本发明选择典型的代表性zr基mofs材料(uio-66和uio-66-nh2)作为载体，利用mofs中丰富裸露的-nh2等基团与纤维素酶中的羟基、羧基等建立多重氢键，以实现高效物理负载，首次实现了基于物理吸附作用的高效稳定非均相纤维素酶-金属有机框架复合催化剂(cellulase@uio-66和cellulase@uio-66-nh2)。特别地，在cellulase@uio-66-nh2中，纤维素酶通过稳定而可逆的氢键作用，牢牢负载在uio-66-nh2纳米粒子表面，同时，载体分布在酶的周围，通过空间限域作用减缓由于温度、ph值等变化对酶结构的影响，从而提升复合催化体系的稳定性和催化活性，研究表明在40-80℃范围内cellulase@uio-66-nh2均可以保持80％以上的催化活性，其ph耐受程度也可以提高到3-6，而且可以储存长达3个月以上仍保持原有65％以上的催化活性。同时，由于uio-66-nh2的非均相本质，复合酶催化体系可以方便地从水解反应中通过离心而实现多次的回收利用，在经过循环使用10次后，仍可以保持不低于70％的催化活性。

附图说明

图1为实施例1中cellulase@uio-66-nh2的扫描电子显微镜照片。

图2为实施例1中cellulase@uio-66-nh2和实施例2中cellulase@uio-66的xrd衍射图谱，a为cellulase@uio-66、b为cellulase@uio-66-nh2、c为cellulase@uio-66-nh2在30℃催化测试后、d为cellulase@uio-66-nh2在80℃催化测试后、e为cellulase@uio-66-nh2在ph＝3催化测试后、f为cellulase@uio-66-nh2在ph＝7催化测试后、g为cellulase@uio-66-nh2在第10次循环催化测试后。

图3为实施例1中cellulase@uio-66-nh2的红外图谱，a为h2n-h2bdc、b为游离纤维素酶、c为uio-66-nh2、d为cellulase@uio-66-nh2。

图4为实施例3中cellulase@uio-66-nh2和cellulase@uio-66的有效纤维素酶负载量对比。

图5为实施例3中cellulase@uio-66-nh2纤维素酶有效负载量与纤维素酶浓度的关系。

图6为实施例3中cellulase@uio-66-nh2催化活性与纤维素酶浓度的关系。

图7为实施例3中cellulase@uio-66-nh2催化活性与温度的关系。

图8为实施例3中cellulase@uio-66-nh2催化活性与ph值的关系。

图9为实施例3中cellulase@uio-66-nh2的循环催化活性。

图10为实施例3中cellulase@uio-66-nh2和游离纤维素酶储存稳定性比较。

具体实施方式

实施例1

纤维素酶-金属有机框架复合催化材料cellulase@uio-66-nh2

uio-66-nh2的合成方法在参照文献基础上做了一些改变，具体如下：1.4914g的zrcl4(6.4mmol)与1.1464g的2-氨基-1,4-对苯二甲酸(h2n-h2bdc,5.85mmol)溶于100ml的dmf中，在120℃反应24h后，然后经120min冷却到室温，得到淡黄色粉末。经简单过滤，用dmf、乙醇分别洗涤3次，于70℃烘箱放置12h烘干后，获得平均粒径为52nm的uio-66-nh2，约1.5g。

cellulase@uio-66-nh2的制备方法：称取20mg新鲜制备的uio-66-nh2，加入到5ml的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(ph＝4.8,50mm)中，在搅拌下分别加入5mg、10mg、15mg、20mg、25mg纤维素酶冻干粉末(1u/g)，并继续在室温下搅拌反应12h，以获得具有不同负载量的复合催化剂。反应结束后，以4000rpm转速离心10min，底部的产品用ph＝4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液洗涤三次，蒸馏水洗涤三次，自然晾干，得到负载有纤维素酶的uio-66-nh2，即cellulase@uio-66-nh2，通过扫描电子显微镜照片(图1)、xrd衍射图谱(图2)、红外图谱(图3)充分证实获得了纤维素酶-金属有机框架复合催化剂。

实施例2

纤维素酶-金属有机框架复合催化材料cellulase@uio-66

uio-66的合成方法在参照文献基础上做了少许改变，具体如下：0.053g的zrcl4(0.227mmol)与0.034g的1,4-对苯二甲酸(h2bdc,0.227mmol)溶于20.5ml的dmf中，在120℃反应24h后，然后经120min冷却到室温，得到淡黄色粉末。经简单过滤，用dmf、乙醇分别洗涤3次，于70℃烘箱放置12h烘干后，获得平均粒径为50nm的uio-66，约0.5g。

cellulase@uio-66的制备方法：

称取20mg新鲜制备的uio-66，加入到5ml的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(ph＝4.8,50mm)中，在搅拌下分别加入5mg、10mg、15mg、20mg、25mg纤维素酶冻干粉末(1u/g)，并继续在室温下搅拌反应12h，以获得具有不同负载量的复合催化剂。反应结束后，以4000rpm转速离心10min，底部的产品用ph＝4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液洗涤三次，蒸馏水洗涤三次，自然晾干，得到负载有纤维素酶的uio-66，即cellulase@uio-66，通过扫描xrd衍射图谱(图2)充分证实获得了纤维素酶-金属有机框架复合催化剂。

实施例3

纤维素酶-金属有机框架复合催化材料的性能测试

1、cellulase@uio-66和cellulase@uio-66-nh2纤维素酶负载量的测定

采用考马斯亮蓝法(bradford法)，以牛血清白蛋白为参比，利用uv-vis分光光度计(unicouv-2802)测定zr基mofs材料上纤维素酶的负载量(elc，mg·g^-1)，使用以下公式确定elc：

elc是zr基mofs材料上负载纤维素酶的量(mg·g^-1)，ce是通过吸光度值计算出的纤维素酶浓度(mg·ml^-1)，v是反应液的体积(ml)，w是载体zr基mofs材料的重量(g)。

图4为cellulase@uio-66和cellulase@uio-66-nh2的有效纤维素酶负载量对比结果。结果显示，在纤维素酶浓度为2mg/ml时，uio-66-nh2对纤维素酶的最大负载量为290mg/g，uio-66的纤维素酶的最大负载量为135mg/g。这是由于氨基化的zr基mofs材料能够更好的与纤维素酶形成氢键造成的。因此，优选cellulase@uio-66-nh2做下一步研究。图5为cellulase@uio-66-nh2纤维素酶有效负载量与纤维素酶浓度的关系，结果表明在纤维素酶浓度为1mg/ml时，uio-66-nh2的纤维素酶的负载量为130mg/g；纤维素酶浓度为3mg/ml时，uio-66-nh2的纤维素酶的负载量为350mg/g；纤维素酶浓度为4mg/ml时，uio-66-nh2的纤维素酶的负载量为325mg/g；纤维素酶浓度为5mg/ml时，uio-66-nh2的纤维素酶的负载量为330mg/g。

2、cellulase@uio-66-nh2的催化活性测试

利用羧甲基纤维素(cmc)测定法测定cellulase@uio-66-nh2的催化活性，具体如下：量取2ml浓度为1％的cmc醋酸-醋酸钠缓冲溶液(ph＝4.8,50mm)，加入5.8mgcellulase@uio-66-nh2，在50℃下搅拌反应30min。反应结束后，通过二硝基水杨酸(dns)比色法测定测定水解产生葡萄糖的量，根据540nm处的吸光度值，通过标准工作曲线计算转化率。水解效率的计算方法为：计算每克纤维素酶每分钟产生的还原性糖类的摩尔数。

如图6所示，当纤维素酶浓度为2mg/ml时，cellulase@uio-66-nh2的催化活性是最高的，可达47u/g；当纤维素酶浓度提高到3mg/ml以上时，尽管cellulase@uio-66-nh2负载了更多的纤维素酶，但是cellulase@uio-66-nh2却表现出较低的活性，这可能是由于纤维素酶的密集负载导致其构象变化是引起的。

3、cellulase@uio-66-nh2对反应温度(30-80℃)和ph值(3-7)的耐受性测试

测试方法同催化活性测试，仅需改变相应的反应温度或者改变缓冲溶液的ph值，其它条件不变。

如图7所示，与游离的纤维素酶相比，cellulase@uio-66-nh2表现出明显的优势：在温度超出55℃时，游离纤维素酶的活性迅速降低，在80℃时，游离纤维素酶的最大活性损失约60％，而cellulase@uio-66-nh2表现出非常高的热稳定性，在80℃时仍保持其最大活性的85％。

如图8所示，在ph范围3-6之间，cellulase@uio-66-nh2保持了其最大活性(ph＝5)的90％，而游离纤维素酶只在ph＝5表现出较高活性，在其他的ph范围内活性显著下降。

4、cellulase@uio-66-nh2循环催化性能测试

量取2ml浓度为1％的cmc醋酸-醋酸钠缓冲溶液(ph＝4.8,50mm)，加入20mgcellulase@uio-66-nh2，在50℃下搅拌反应30min。反应结束后，以4000rpm转速离心10min得到cellulase@uio-66-nh2，然后用缓冲溶液洗涤三次。将回收的cellulase@uio-66-nh2加入到新鲜的cmc溶液中，在相同条件下进行重复催化cmc水解实验10次，测定每次循环后cellulase@uio-66-nh2的催化活性。如图9所示，在第一次循环，cellulase@uio-66-nh2的催化活性为88％，在第二次循环，cellulase@uio-66-nh2的催化活性为84％，在循环使用10次后，cellulase@uio-66-nh2仍表现出超过70％的催化活性。在每次循环中，主要是由于负载在uio-66-nh2表面的纤维素酶会有部分脱落，导致起活性稍有所下降。

5、cellulase@uio-66-nh2储存稳定性测试

在4℃下，分别将游离纤维素酶和cellulase@uio-66-nh2放于醋酸-醋酸钠缓冲溶液30天来研究其储存稳定性，间隔5天测试其催化活性。如图10所示，游离纤维素酶在储存30天后几乎丧失其所有活性，cellulase@uio-66-nh2在4℃条件下其催化活性保持约65％。这表明，uio-66-nh2载体能够有效地阻止纤维素酶的变性，显著增加了其耐久性和稳定性。