查尔酮类荧光探针在检测水溶液中苯硫酚类化合物的应用的制作方法

本发明属于分析技术领域，具体地说，涉及分子荧光探针的设计合成以及对于苯硫酚化合物的识别与响应。该探针分子可以用于实验条件下对苯硫酚化合物的识别，并且可以在海水样本中检测低浓度条件下的苯硫酚化合物，具有实际的应用价值。

背景技术：

苯硫酚是一种有窒息性气味的高毒性无色液体，在医药、农药、化工及高分子材料等领域有着广泛的应用，如制取医用药剂，农药，工业添加剂等。在自然界中，剧毒性的苯硫酚危害着水生生物和动物的生存环境。苯硫酚对鱼类的半致死浓度(lc50)范围为0.01～0.4mm，对小鼠的半致死剂量(ld50)为46.2mg/kg.因此苯硫酚已被美国环境保护局列入最重要的污染物类别(epawastecodep014)中。

苯硫酚类化合物的结构通式为(其中r基团可为烷基，氨基，甲氧基，氟，氯等基团)：

我国的海洋生态系统复杂，蕴藏了非常庞大数量的海洋资源。沿海地区经济发展较快，在发展中也产生了大量的工业和环境的污水，有大量的污水未经处理或者经过简易的处理就排入到海洋之中，严重的污染了海水，因此导致了严重的海洋污染。因此设计得到一种专一性的并应用于海洋体系中检测有毒的苯硫酚化合物的分子探针具有实际的应用价值。

有机荧光染料因其容易获得，价格低廉，多功能性等有优点，在荧光检测中是最常用的。本发明涉及“关-开”型查尔酮类荧光探针probe-kcn1的设计合成，在实验条件下以及在海水样本中对低浓度苯硫酚的识别检测。现有的分子探针的报道中，并没有将探针应用于海水样本中检测苯硫酚化合物的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于设计合成得到一种“关-开”型查尔酮类荧光探针probe-kcn1并应用于海水样本中苯硫酚化合物的识别与检测；

本发明所得到的“关-开”型查尔酮类荧光探针probe-kcn1是本实验室化学合成所得，其化学结构式如下：

本发明将上述“关-开”型探针probe-kcn1进行了在实验条件下以及在海水样本中对低浓度苯硫酚化合物的选择性实验。实验结果表明，所述的“关-开”型探针probe-kcn1其本身对于苯硫酚类化合物具有良好的选择性和较高的检测灵敏度等性质，可以用于实际水样(四处近海水域的海水样本)中苯硫酚类化合物的检测。其次，细胞毒性实验中可得知该“关-开”型探针probe-kcn1本身无细胞毒性，用于实际的海水水样中对于水生动植物及水生环境皆无影响。

所述的“关-开”型探针probe-kcn1可以作为一种新型的分子探针，用于海水水样中对苯硫酚化合物的检测。本发明提供了一种用于海水样本中快速准确检测苯硫酚类有毒物质的方法，具有良好的研究前景。

查尔酮类荧光探针在检测水溶液中苯硫酚类化合物的应用

所述查尔酮类荧光探针probe-kcn1可以用来识别和检测苯硫酚类化合物，

所述苯硫酚类化合物的结构通式如下，

其中r基团可为烷基，氨基，甲氧基，氟，氯等基团中的一种、二种、三种、四种或五种，其个数为1-5个。

所述探针分子为“关-开”型查尔酮类荧光探针，可以应用于海水样本或海水域中来检测低浓度条件下的苯硫酚化合物。

所述探针上可定性或定量检测水溶液中苯硫酚类化合物。

检测下限为：0.040μm。

：所述探针上可定量检测水溶液中苯硫酚类化合物，苯硫酚类化合物的浓度为0-45μm，荧光强度y与浓度x的线性响应公式为:

所述探针上可定量检测水溶液中苯硫酚类化合物，苯硫酚类化合物的浓度为0-10μm,荧光强度y与浓度x的线性响应公式为:

y＝226.1377*x+78.4583。

所述查尔酮类荧光探针probe-kcn1可以用来识别和检测苯硫酚类化合物，并且具有灵敏度高，选择性好，操作方便以及响应时间短等优点。

同时探针分子可以应用于海水样本中来检测低浓度条件下的苯硫酚化合物，具有实际的应用价值。

本发明具有如下优点：

本发明实验验证，此次设计合成得到的“关-开”型探针probe-kcn1本身无细胞毒性，不会对水生动植物及水生环境有影响。探针probe-kcn1对于苯硫酚类化合物具有良好的选择性和较高的检测灵敏度等性质，可以用于实际水样(三处近海水域的海水样本)中苯硫酚类化合物的检测，实验方法简便快速准确。

附图说明

图1探针probe-kcn1结构式。

图2为探针分子probe-kcn1的光谱性质。

图3为探针分子probe-kcn1的荧光强度与4-甲氧基苯硫酚浓度的响应曲线。

图4为荧光探针probe-kcn1加入各种分析物后荧光强度的变化。

图5为探针分子probe-kcn1对细胞活性的影响。

图6为海水中主要阴离子及金属阳离子(模拟海水中浓度)对探针分子probe-kcn1荧光强度的影响。

图7为探针分子probe-kcn1在不同海水样本中的荧光强度随4-甲氧基苯硫酚的浓度变化线性响应曲线。

具体实验方式

实施例1探针分子probe-kcn1的设计合成

往probe-oh(0.5mmol)的二氯甲烷(20ml)溶液中加入cs2co3(1mmol)室温搅拌30min,向上述溶液中加入2,4-二硝基氟苯(0.625mmol),室温搅拌过夜，有固体析出。过滤抽干溶剂，用乙酸乙酯：石油醚(v:v＝2:8)重结晶，得到黄色粉末状固体。产率为：85％.probe-kcn1:¹hnmr(500hz,dmso-d6)δ9.03(s,1h),8.96(d,j＝2.7hz,1h),8.77(s,1h),8.49(dd,j＝9.2,2.8hz,1h),8.37(d,j＝8.9hz,1h),8.25(d,j＝7.9hz,2h),8.16(d,j＝15.4hz,1h),8.08(d,j＝8.7hz,2h),8.05(d,j＝15.5hz,1h),7.89(d,j＝2.1hz,1h),7.73(d,j＝8.6hz,1h),7.67(d,j＝8.2hz,1h),7.60(dd,j＝8.9,2.3hz,1h),7.52(t,j＝7.7hz,1h),7.40(d,j＝9.2hz,1h),7.29(t,j＝7.4hz,1h),4.51(q,j＝6.9hz,2h),1.35(t,j＝7.1hz,3h)ppm；¹³cnmr(125hz，dmso-d6)δ188.89(s),154.79(s),154.14(s),146.37(s),142.41(s),141.63(s),140.60(s),140.30(s),136.46(s),135.91(s),133.24(s),130.76(s),130.41(s),130.21(s),128.58(s),127.46(s),126.84(s),126.18(s),125.96(s),123.19(s),122.73(s),122.45(s),121.06(d,j＝12.0hz),120.06(s),119.11(s),116.74(s),110.11(s),37.71(s),14.27(s)ppm.hrms(esi)m/zcalcdforc33h23n3o6([m+]):557.1587,found558.1662.

注：probe-oh由我们实验室自己合成并通过核磁及质谱确认结构。

实施例2探针分子probe-kcn1的光谱性质

实验方法为：将探针分子probe-kcn1溶解于dmso中得到5mm的探针母液，4℃保存。实验测定中用dmso/pbsbuffer(1:1,v/v,20mm,ph＝7.4)的缓冲溶液稀释成5μm的标准溶液。4-甲氧基苯硫酚溶解与dmso溶剂中，配成5mm的母液，4℃保存，实验测定中用dmso/pbsbuffer(1:1,v/v,20mm,ph＝7.4)的缓冲溶液稀释成0-30μm的标准溶液，设定2.5μm为一个浓度梯度。向96孔黑板中加入100μl的探针溶液与不同浓度苯硫酚待测液混合摇匀，37℃培养静置60min后测定其光谱，结果如图2与图3所示：probe-kcn1溶液中加入苯硫酚，其荧光强度增强了40倍。荧光强度随苯硫酚的浓度的增加而增大，当苯硫酚的浓度为30μm时，增加到最大值并保持稳定。苯硫酚的浓度为0-10μm时，荧光强度与苯硫酚的浓度呈现出良好的线性关系(r²＝0.9948),检测下限为：0.040μm.如图3所示在苯硫酚的浓度为0-45μm之间，probe-kcn1的荧光强度与硫酚的浓度响应曲线的r²＝0.9978.

苯硫酚的浓度为0-10μm,荧光强度与浓度的线性响应公式为:

y＝226.1377*x+78.4583

苯硫酚的浓度为0-45μm，荧光强度与浓度的线性响应公式为:

注：dmso/pbsbuffer(1:1,v/v,20mm,ph＝7.4)的缓冲溶液是dmso与磷酸盐平衡生理盐水(pbsbuffer)等体积混合，磷酸盐平衡生理盐水的浓度为20mm,检测时混合溶剂的ph为7.4.

实施例3探针分子probe-kcn1的选择性实验。

实验方法为：将探针分子probe-kcn1溶解于dmso中得到5mm的探针母液，4℃保存。实验测定中用dmso/pbsbuffer(1:1,v/v,20mm,ph＝7.4)的缓冲溶液稀释成5μm的标准溶液。4-甲氧基苯硫酚，4-氟苯硫酚，4-甲基苯硫酚溶解于dmso溶剂中，配成2.5mm的母液，4℃保存，实验测定中用dmso/pbsbuffer(1:1,v/v,20mm,ph＝7.4)的缓冲溶液稀释成30μm的标准溶液。氨基酸如：gsh,cys,hcy,ala,gly,thr和ser；一般干扰物质如：ph-nh2,ph-oh,nash和c2h5sh；常见无机盐如：ki,(aco)2co,nahso3,kbr,sncl2,fecl3,cuso4.5h2o,pb(aco)4,cui,cacl2,kf,nacl,mgso4,feso4和niso4溶于去离子水中，配置成5mm的母液，4℃保存，实验测定中用dmso/pbsbuffer(1:1,v/v,20mm,ph＝7.4)的缓冲溶液稀释成100μm的标准溶液。向96孔黑板中分别加入100μl的探针溶液与100μl分析物，37℃培养静置60min后测定其光谱，结果如图4所示：探针对其他分析物几乎无响应，对4-甲氧基苯硫酚，4-氟苯硫酚，4-甲基苯硫酚等苯硫酚类化合物具有选择专一性，可适用于对苯硫酚类化合物的识别与检测。

实施例4探针分子probe-kcn1的细胞毒性实验

采用四甲基偶氮唑盐(mtt)法检测probe-kcn1对人胚肺成纤维细胞helf和人脐静脉内皮细胞huvec增值活性的影响。分别取对数期的helf和huvec细胞，胰酶消化重悬，调整细胞浓度为5×10⁴/ml，以100μl/孔接种96孔板，贴壁生长24h后，吸弃培养基，加入不同浓度的probe-kcn1(0,2.5,5,10,20,50μg/ml)，每个浓度设置三个复孔，并设定相应浓度的pbs溶媒对照及无细胞调零组。细胞在37℃、5％co2条件下培养48h，然后加入20μl，5mg/ml的mtt，于37℃、5％co2条件下孵育4h，吸弃上清，每孔加入150μldmso，震荡10分钟，酶标仪490nm波长下检测od值。并计算细胞抑制率和半数抑制浓度(ic50)。

实验结果如图5所示：探针分子probe-kcn1在0-50μm的浓度时，对人胚肺成纤维细胞helf和人脐静脉内皮细胞huvec无毒性，该探针为无细胞毒性的化合物，使用于环境水样中，对水生动植物及水生环境无影响。

实施例5海水中不同离子对探针分子probe-kcn1荧光强度的影响

实验方法为：将探针分子probe-kcn1溶解于dmso中得到5mm的探针母液，4℃保存。实验测定中用dmso/pbsbuffer(1:1,v/v,20mm,ph＝7.4)的缓冲溶液稀释成5μm的标准溶液。4-甲氧基苯硫酚溶解于dmso溶剂中，配成2.5mm的母液，4℃保存，实验测定中用dmso/pbsbuffer(1:1,v/v,20mm,ph＝7.4)的缓冲溶液稀释成30μm的标准溶液。海水中主要无机盐按照nationalstandardgb/t17848-1999的要求分别配置成不同浓度的溶液，4℃保存。nacl,mgcl2,naf,nahco3,na2so4,h3bo3,srcl2,na2sio3,nano3,kcl,cacl2,kbr；氨基酸如glu,asn,gly,ala,ser.向96孔黑板中分别加入100μl的探针溶液与100μl分析物，37℃培养静置60min后测定其光谱；向上述反应液中继续加入30μm的4-甲氧基苯硫酚100μl，混匀后37℃培养静置60min后测定其光谱。结果如图6所示：海水中存在的无机盐和氨基酸对probe-kcn1检测苯硫酚的实验结果几乎无影响，说明该探针具有在海水样本中检测苯硫酚化合物可能性。

实施例6探针分子probe-kcn1在不同海水样本中检测苯硫酚实验。

实验方法为：将探针分子probe-kcn1溶解于dmso中得到5mm的探针母液，4℃保存。实验测定中用dmso/pbsbuffer(1:1,v/v,20mm,ph＝7.4)的缓冲溶液稀释成5μm的标准溶液。4-甲氧基苯硫酚溶解于dmso溶剂中，配成2.5mm的母液，4℃保存。从大连，烟台，胶州湾和舟山四处近海水域取海水样本，过滤泥沙后4℃保存待用。使用外标法，分别向各个海水样本中加入适量4-甲氧基苯硫酚溶液，将其配成2.0μm,4.0μm,6.0μm,8.0μm和10.0μm不同浓度的海水-硫酚待测液。向96孔黑板中分别加入100μl的探针溶液与100μl海水-硫酚待测液，混匀后37℃培养静置60min后测定其光谱。结果如图7所示：当苯硫酚的浓度在0-10μm范围时，probe-kcn1的荧光强度与苯硫酚的浓度呈现出良好的线性关系，即该探针分子可以应用于海水样本中来检测低浓度条件下的苯硫酚化合物。

图1探针probe-kcn1结构式。

图2.探针分子probe-kcn1的光谱性质。(a)探针分子probe-kcn1荧光光谱变化图。探针分子probe-kcn1(5μm)的荧光光谱为黑色曲线，加入4-甲氧基苯硫酚(30μm)为红色曲线。(b)探针分子probe-kcn1(5μm)的荧光光谱随4-甲氧基苯硫酚(0-30μm)浓度的变化。(c)探针分子probe-kcn1的荧光强度随4-甲氧基苯硫酚(0-30μm)的浓度变化线性响应曲线。(d)探针分子probe-kcn1的荧光强度随ph变化图。每个谱图在dmso/pbsbuffer(1:1,v/v,20mm,ph＝7.4)的缓冲溶液中测得。37℃培养60min后，记录数据变化。激发波长为420nm，发射波长为550nm.

图3.探针分子probe-kcn1的荧光强度随4-甲氧基苯硫酚(0-45μm)的浓度变化线性响应曲线。

图4.荧光探针probe-kcn1(5μm)加入各种分析物后荧光强度的变化。每个谱图在dmso/pbsbuffer(1:1,v/v,20mm,ph＝7.4)缓冲溶液中测得。(1)blank；(2)gsh；(3)cys；(4)hcy；(5)ala；(6)gly；(7)thr；(8)ser；(9)ki,(10)(aco)2co,(11)nahso3,(12)kbr,(13)sncl2,(14)fecl3,(15)pb(aco)4,(16)cui,(17)cuso4,(18)cacl2,(19)kf,(20)nacl,(21)mgso4,(22)feso4and(23)niso4,(24)ph-nh2,(25)ph-oh,(26)nash,(27)c2h5sh,(28)4-toluenethiol(30μm),(29)4-fluorothiophenol(30μm),(30)4-methoxythiophenol(30μm).硫酚化合物的检测浓度为30μm，同时其他分析物的检测浓度为100μm.向探针溶液中加入不同分析物，37℃培养60min后，记录荧光强度变化。激发波长为420nm，发射波长为550nm。

图5.探针分子probe-kcn1对细胞活性的影响。(a)人胚肺成纤维细胞helf(b)人脐静脉内皮细胞huvec。

图6.海水中主要阴离子及金属阳离子(模拟海水中浓度)对探针分子probe-kcn1(5μm)荧光强度的影响。探针分子probe-kcn1(5μm)中加入不同浓度的分析物时，其荧光光谱为黑色曲线；加入4-甲氧基苯硫酚(30μm)为红色曲线。(1)nacl(24.53g/l),(2)mgcl2(5.20g/l),(3)naf(0.003g/l),(4)nahco3(0.201g/l),(5)na2so4(4.09g/l),(6)h3bo3(0.027g/l),(7)srcl2(0.025g/l),(8)na2sio3(0.15g/l),(9)nano3(0.11g/l),(10)kcl(0.695g/l),(11)cacl2(1.16g/l),(12)kbr(0.695g/l).(13)glu(5μm),(14)asn(5μm),(15)gly(5μm),(16)ala(5μm),(17)ser(5μm).每个数据在dmso/pbsbuffer(1:1,v/v,20mm,ph＝7.4)的缓冲溶液中测得。37℃培养60min后，记录数据变化。激发波长为420nm，发射波长为550nm。

图7.探针分子probe-kcn1在不同海水样本中的荧光强度随4-甲氧基苯硫酚(0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0μm)的浓度变化线性响应曲线。(a)在不同海水样本中测得探针分子probe-kcn1的荧光强度随4-甲氧基苯硫酚(0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0μm)的浓度变化；(b)大连近海水域(辽宁)；(c)胶州近海水域(山东)；(d)舟山近海水域(浙江).每个数据在dmso/pbsbuffer(1:1,v/v,20mm,ph＝7.4)的缓冲溶液中测得。37℃培养60min后，记录数据变化。激发波长为420nm，发射波长为550nm。