发明领域本发明涉及结构生物学领域。更具体地，本发明涉及新的抗原结合嵌合蛋白，其在大分子的三维结构分析(如x射线晶体学和高分辨率冷冻电镜)中的用途和方法，及其作为治疗、诊断或成像工具的用途。甚至更具体地，本发明涉及支架蛋白和抗原结合结构域的融合体，其中所述融合体中的支架蛋白干扰免疫球蛋白域拓扑结构以形成刚性嵌合体，其保留了抗原结合能力。背景蛋白质及其复合物在生命的各个方面中都起着至关重要的作用，但是这些大分子成分中的许多的3d结构分析仍然很困难。衍射质量晶体的制备仍然是大分子x射线晶体学的主要瓶颈。一种有前途的方法是使用结晶伴侣蛋白(hunte&michel，2002)。这些结晶伴侣蛋白以已经工程化来特异性地结合给定的大分子靶标的抗体片段或其他蛋白质的形式出现。该策略的基础是通过首先结合特定构象来最小化靶标中的构象异质性，其次是增加可以促进晶格中的分子之间的主要接触的蛋白质表面的量，从而增加获得良序晶体的可能性。结晶伴侣蛋白方法中固有的另一个特性是伴侣蛋白可以提供最初的基于模型的定相信息(koide，2009)。已被广泛用作结构分析的辅助剂，尤其是用于其靶标的晶体学，因为它们可以稳定特定的构象(pardon等，2014；rostislavleva等，2015)。一个实例是在gpcr结晶中使用功能强大的纳米抗体技术，这证明了这些工具如何推动结构研究(manglick等，2017；staus等，2016)。然而，x射线晶体学固有地具有若干缺点，如高质量的纯化蛋白的先决条件，所需的相对大量的蛋白质以及难以获得许多蛋白的衍射质量晶体。单颗粒电子低温显微术(冷冻电镜(cryo-em))最近已经发展成为一种可替代的且通用的技术，用于在原子分辨率下对大分子复合物进行结构分析(nogales，2016)。尽管用于数据分析的仪器和方法稳步改进，但我们缺少高分辨率地分析小尺寸、低对称性和高柔性颗粒的工具。除了给定样品的先决条件均质性之外，3d重建最高可实现的分辨率很大程度上取决于将每个单个颗粒的定向参数迭代精细到高精度的能力。由于大分子的表面性质导致特定区域优先附着在空气-水界面或基质支持物上，因此优选的颗粒取向代表了冷冻电镜中反复出现的问题。因此，大分子在冷冻的水合样品的低剂量噪声图像中相对容易识别，并且这些颗粒具有足够的结构特征，以助于准确确定其取向参数(henderson，1995年)，但是收集和处理小颗粒图像的过程要困难得多。一个基本的限制是包埋在玻璃冰中的小蛋白质或复合物的图像没有包含足够的特征来进行精确的图像比对，这主要是因为图像中的信噪比随颗粒大小而降低。已经进行了通过创建融合蛋白或向这些蛋白质添加化学接头来克服这些限制的努力。例如，靶蛋白和形成多聚体的谷氨酰胺合成酶之间的优化连接被用作均聚物，以实现对称性，从而在冷冻电镜中允许这些较小靶蛋白的纳米级分辨率(coscia等，2016)。此类融合体的问题在于它们是由柔性接头制成的，导致缺乏刚性和有限的构象同质性。zhang等(2015)已经报道了人源化抗体与细胞因子的更刚性的融合产生了人源化激动剂。刚性融合是通过使用卷曲螺旋(coiled-coil)的“茎”基序进行正确折叠而完成的，所述基序基于牛fab结构基序。与抗体的互补决定区(cdr)的融合体中这样的茎基序偶联的细胞因子似乎保留了细胞因子的折叠和生物活性，但是丧失了抗体的抗原结合能力。如fabs(～50kda)之类的抗体片段已用于通过冷冻电镜阐明小蛋白的结构(wu等，2012；lin等，2013)。使用fab的一个缺点是它们还结合线性表位，已知其导致较低的刚性，因此需要适当选择获得刚性结合和结构促进所需的fab。而且，fab具有内部柔性(在其可变结构域和恒定结构域之间)，并且尺寸上仍然相对小，并且与纳米抗体(nanobody)相比更难以生产。尽管纳米抗体是减少结构分析中构象异质性的出色工具，但nbs(15kda)还是小蛋白质，并且不补充大量蛋白质表面来促进晶格中分子间的主要接触。由于它们是如此之小，因此它们也不太适合满足小蛋白高分辨率冷冻电镜的尺寸相关要求。为了通过x射线晶体学或冷冻电镜进行准确的结构分析，需要刚性伴侣蛋白的通用原型解决方案。因此，以刚性方式融合而不是通过柔性接头的新型嵌合体的设计可能对于构建大型构象稳定的蛋白质结构是有利的。综上所述，显然需要下一代伴侣蛋白，其能够通过结晶或单颗粒分析，尤其是冷冻电镜，对较小的蛋白质或蛋白质复合物进行结构分析，甚至进行蛋白质-蛋白质相互作用的分析。通过通用方法设计和产生这种伴侣蛋白以降低靶标的构象柔性将是有利的。首先，作为一种辅助工具，以向靶标增加质量和/或添加定义的特征以提高分辨率，从而获得高分辨率结构。因此，这对于基于结构的药物设计是有益的，并且有助于发现和开发新化合物。其次，还提供一种新型的用于生物物理、医学以及作物保护应用的活性剂，包括可从提高的刚性受益的诊断或治疗产品。发明概述本发明涉及新的功能性抗原结合嵌合蛋白的设计和产生及其用途，如它们作为下一代伴侣蛋白在结构分析中的作用，以及它们作为治疗和诊断分子的用途。特别地，通过结合免疫球蛋白或免疫球蛋白样结构域的有利功能特征，包括抗原结合特性以及对结合靶标上的构象表位的特异性，已经设计了包含免疫球蛋白或免疫球蛋白样结构域和支架蛋白的抗原结合嵌合蛋白，具有免疫球蛋白结构域的有利结构特征，其允许支架蛋白以多种方式与免疫球蛋白结构域融合，以使其在不干扰其折叠或功能的情况下干扰免疫球蛋白结构域的拓扑结构。通过表达所述抗原结合结构域和支架蛋白之间的基因融合体获得了所得的抗原结合嵌合蛋白，所述基因融合体经设计使得支架或其片段插入抗原结合结构域的拓扑结构内。令人惊讶地显示出，所得的新的抗原结合嵌合蛋白的特征在于其融合区的高刚性，并且令人惊讶地保留了其典型的折叠和功能，即它们保持了结合其抗原或靶蛋白的高亲和力。实际上，在抗原结合结构域和支架蛋白之间进行的遗传融合不会干扰或改变用于抗原结合的互补决定区(cdr)结构。因此，本发明通过在抗原结合结构域内的暴露区域中具有完美选择的位点，提供了新的且独特类型的抗原结合嵌合蛋白，以允许与支架蛋白的刚性非柔性融合，其设计起来并不简单。抗原结合嵌合蛋白因此提供了一种新的工具，其通过增加质量和提供结构特征来促进小蛋白的高分辨率冷冻电镜和x射线晶体学结构分析。的确，在冷冻电镜中，均质样品的主要的大尺寸和中等尺寸的大分子装配体仍可在原子级表征。因此，本发明的抗原结合嵌合蛋白将有助于提高颗粒大小，以处理优选的颗粒取向(还取决于支架)，并允许更好的片段比对，从而导致尺寸极限的降低和分辨率的提高。因此，这些用于对任何可能的抗原或靶标的结构分析的下一代伴侣蛋白的设计和产生允许将抗原结合嵌合蛋白用作支持工具，以向目标靶标增加质量和/或添加定义的特征，以这种方式提高分辨率以获得高分辨率结构。实际上，抗原结合嵌合蛋白因此作为结构分析中的工具是有利的，而且在基于结构的药物设计和筛选中也是作为工具有利的，并且成为发现和开发新的生物学和小分子活性剂的附加值。此外，当进行这种刚性融合时，并且根据支架的类型，例如，其自身包含抗原结合或ig结构域的支架，在医学领域出现了将抗原结合嵌合体用作活性成分的新应用，例如作为新的刚性融合治疗分子，或在作物保护领域中，提供保护剂。用标记的支架甚至标记的抗原结合结构域制备抗原结合嵌合体时，本发明还包括一种新的诊断工具，其通过对靶标的非共价探测来加速例如体内成像的技术改进。本发明的第一个方面涉及包含与支架或融合配偶蛋白连接的抗原结合结构域的抗原结合嵌合或融合蛋白，其中所述支架蛋白在所述结构域的表面可及或暴露的一个或多个氨基酸位点与所述抗原结合结构域偶联，导致所述抗原结合结构域的拓扑结构干扰。所述抗原结合嵌合蛋白的特征还在于，与未与所述支架蛋白融合的抗原结合结构域相比，其保留了其抗原结合功能。另一个实施方案公开了本发明的抗原结合嵌合蛋白，其中支架蛋白和抗原结合结构域的融合导致抗原结合结构域的一级拓扑结构干扰，允许保留所述抗原结合结构域的折叠，如与未与另一种蛋白融合的抗原结合蛋白的折叠相比。在本发明的特定实施方案中，融合体可以是直接融合体，或通过接头或接头肽产生的融合体，所述融合位点被完美地设计以产生刚性的、非柔性的融合蛋白。优选，接头包含十个，九个，八个，七个，六个，五个，四个，三个，或更优选两个，甚至更优选一个氨基酸残基，或为直接融合(无接头)。在另一个实施方案中，所述抗原结合嵌合蛋白在暴露区域存在的至少一个或多个可及位点融合，所述暴露区域优选是抗原结合结构域的beta转角(β转角)或环。所述具有在抗原结合结构域表面的一个或多个可及或暴露的位点与抗原结合结构域偶联的支架蛋白的抗原结合嵌合蛋白的特征还在于所述可及或暴露的位点不同于抗原结合环或cdr环，以保留其抗原结合功能。在一个实施方案中，所述抗原结合嵌合蛋白包含具有至少7个反平行β链和至少3个连接所述β-链的β-转角的抗原结合结构域，如根据全球参考命名法所定义的(lefranc，2014年；图25)。在特定的实施方案中，所述抗原结合嵌合蛋白的所述抗原结合结构域包含免疫球蛋白(ig)结构域或ig折叠。在具体的实施方案中，抗原结合嵌合蛋白的ig结构域衍生自vhh，或更优选衍生自免疫球蛋白单可变结构域(isvd)或纳米抗体。在特定的实施方案中，根据imgt的命名法，抗原结合嵌合蛋白的所述抗原结合结构域的暴露区域特别涉及β-转角ab、cc'、c”d、de或ef(图25，改编自lefranc，2014年)。因此，将支架蛋白如下插入抗原结合结构域内：在连接所述抗原结合结构域的β链a和β链b的第一个β-转角中；或在连接所述抗原结合结构域的β链c和β链c’的β转角中；或在连接所述抗原结合结构域的β链c”和β链d的β转角中；或在连接所述抗原结合结构域的β链d和β链e的β转角中；或在连接所述抗原结合结构域的β-链e和β-链f的β-转角中(其中所述β-转角由imgt定义，lefranc2014)。在具体的实施方案中，抗原结合嵌合蛋白是通过将支架蛋白与所述结构域的暴露区域中的可及位点融合而产生的，所述结构域涉及β-转角ab，其连接所述抗原结合结构域的β-链a和β-链b。在本发明的另一个实施方案中，用于产生抗原结合嵌合蛋白的支架蛋白是环状排列的蛋白，更具体地说，可以在所述支架蛋白的n-和c-末端之间进行环状排列。在某些实施方案中，在所述支架蛋白的另一个可及位点切割环状排列的支架蛋白，以提供与ig结构域的可及位点融合的位点。另一个实施方案涉及抗原结合嵌合蛋白，其中支架蛋白是单体蛋白。在备选的实施方案中，支架蛋白具有对称结构，如多聚体或寡聚体形成蛋白或是二十面体结构的一部分或形成二十面体结构的蛋白，如病毒样颗粒(vlp)。在特定的实施方案中，其中支架是多聚体的所述抗原结合嵌合蛋白通过所述多聚支架的每个单体与ig结构域的可及位点连接或融合。在另一个实施方案中，抗原结合嵌合蛋白的抗原结合结构域和支架蛋白还通过二硫键另外连接，该二硫键在存在于抗原结合结构域和支架蛋白上的两个半胱氨酸残基之间共价形成。本发明的另一个实施方案涉及抗原结合嵌合蛋白，其中所述支架蛋白的总分子量为至少30kda。本发明的特定实施方案涉及抗原结合嵌合蛋白，其中支架蛋白包含抗原结合。特别地，所述支架蛋白包含免疫球蛋白结构域，或更特别地，vhh、isvd或纳米抗体。或者，所述支架蛋白包含免疫球蛋白样结构域，更具体地，monobody。更具体地，提供了抗原结合嵌合蛋白，其中抗原结合结构域以及含抗原结合结构域的支架在特异性结合其抗原靶标中保留功能。在具体的实施方案中，所述含抗原结合结构域的支架结合与融合至支架蛋白的抗原结合结构域不同的靶标。在一个可替代的实施方案中，支架蛋白的抗原结合结构域的抗原靶标与融合至所述支架蛋白的抗原结合蛋白结构域的抗原靶标相同。甚至更具体地，抗原靶标对于抗原结合嵌合蛋白的两个抗原结合结构域涉及相同的蛋白，但它们在抗原靶标上的表位是不同的。在另一个实施方案中，抗原结合嵌合蛋白的支架蛋白是标记的蛋白。在具体的实施方案中，标记是可检测标记。在另一个实施方案中，抗原结合嵌合蛋白的抗原结合结构域是标记的抗原结合结构域。更具体地，由抗原结合结构域或由支架蛋白融合或连接和/或提供的所述标记允许在体内和/或非共价检测或标记新的抗原结合嵌合蛋白的抗原结合结构域的抗原靶标。在特定的实施方案中，所述标记的抗原结合嵌合蛋白可以包含有毒标记，并且其适用于治疗用途。本发明的再一个方面涉及编码上述任一种抗原结合嵌合蛋白的核酸分子。或者，在一个实施方案中，提供了嵌合基因，其具有至少一个启动子、所述编码抗原结合嵌合蛋白的核酸分子和含有转录终止信号的3’端区域。另一个实施方案涉及编码所述抗原结合嵌合蛋白的表达盒，或包含编码所述抗原结合嵌合蛋白的核酸分子或嵌合基因的表达盒。更多实施方案涉及包含编码本发明的抗原结合嵌合蛋白的所述表达盒或核酸分子的载体。在特定的实施方案中，所述载体适用于在大肠杆菌中表达，或用于酵母、噬菌体、细菌或病毒(表面)展示。在另一个实施方案中，公开了包含本发明的抗原结合嵌合蛋白的宿主细胞。或者，公开了一种宿主细胞，所述抗原结合嵌合蛋白及其靶抗原在其中共同表达。本发明的另一个方面涉及包含所述抗原结合嵌合蛋白及其靶蛋白的复合物，其中所述靶蛋白特异性地结合所述抗原结合嵌合蛋白。更特别地，其中所述靶蛋白结合所述抗原结合嵌合蛋白的抗原结合结构域，甚至更特别地，结合ig结构域，或甚至更特异性的，结合所述抗原结合嵌合蛋白的ig结构域的cdr。另一个实施方案提供了包含所述抗原结合嵌合蛋白的组合物，或更具体地，提供了所述抗原结合嵌合蛋白的药物组合物。本发明的另一个实施方案涉及包含在根据本发明的第一和第二抗原结合嵌合蛋白之间形成的复合物的组合物，其中所述第二抗原结合嵌合蛋白的抗原结合结构域特异性地结合或识别第一抗原结合嵌合蛋白的支架蛋白。另一个方面涉及本发明的抗原结合嵌合蛋白的用途或核酸分子、嵌合基因、表达盒、载体、复合物或组合物的用途，用于靶标或抗原蛋白的结构分析。特别地，在抗原结合嵌合蛋白的用途中，其中所述靶蛋白是结合所述抗原结合嵌合蛋白的蛋白。具体地，一个实施方案涉及抗原结合嵌合蛋白在包括单颗粒冷冻电镜或包括晶体学的结构分析中的用途。另一个实施方案提供了所述抗原结合嵌合蛋白的用途，其中支架蛋白，或甚至抗原结合结构域是标记的，用于诊断工具，或更具体地用于体内成像。备选的实施方案提供了如上所述的抗原结合嵌合蛋白，或本发明中提供的核酸分子、表达盒、载体、复合物或组合物，用作药物。特定的实施方案涉及包含本发明的抗原结合嵌合蛋白的病毒样颗粒(vlp)。本发明的最后一个方面涉及一种测定靶标或抗原蛋白或目标蛋白的三维结构的方法，包括步骤：(i)提供本发明的抗原结合嵌合蛋白，或包含本发明的抗原结合嵌合蛋白的复合物的组合物，和靶蛋白，以形成复合物，其中所述靶蛋白特异性地结合抗原结合嵌合蛋白或抗原结合嵌合蛋白的组合物，或者，提供本发明的复合物；(ii)并且在合适的条件下展示所述混合物或复合物，用于结构分析，其中在高分辨率下测定所述抗原或靶蛋白的3d结构。附图描述所述附图仅是示意性的而非限制性的。在附图中，出于说明性的目的，一些元件的尺寸可能被放大并且未按比例绘制。图1.与刚性抗原结合嵌合蛋白相比的柔性融合蛋白(a)仅使用一个直接融合体或接头在抗原结合结构域和支架蛋白的n-或c-末端的柔性融合或接头体。(b)抗原结合结构域和支架蛋白的刚性融合体，其中通过连接抗原结合结构域与支架的至少两个直接融合体或接头将抗原结合结构域与支架蛋白融合。图2.由插入连接纳米抗体的β链a和b的第一个β-转角中的支架蛋白的环状排列变体构建的抗原结合嵌合蛋白的工程化原理。该方案显示了如何通过连接抗原结合结构域与支架的两个肽键或两个短接头将纳米抗体(nb)嫁接到大型支架蛋白上。剪刀表示哪些暴露的转角必须在纳米抗体和支架中切割。虚线表示如何必须使用肽键或短肽接头将nb和支架的其余部分连接起来以构建抗原结合嵌合蛋白。根据imgt定义nb的cdr、框架残基和β-转角区域(改编自lefranc的图25，2014)。图3.由插入连接gfp特异性纳米抗体的β链a和b的第一个β-转角中的hopq的环状排列变体构建的58kdgfp结合嵌合蛋白的模型。(a)通过连接纳米抗体与支架的两个肽键或接头融合gfp特异性纳米抗体(顶部)和幽门螺杆菌(h.pylori)hopq粘附素结构域的环状排列变体(底部)制得的抗原结合嵌合蛋白的模型。(b)将编码幽门螺杆菌株g27的1型hopq黏附素结构域的环状排列基因(底部，pdb5lp2，seqidno：19，chopq)插入gfp特异性纳米抗体的连接β-链a和β-链b的第一个β-转角(β-转角ab)(顶部，seqidno：1)中。(c)所得抗原结合嵌合蛋白的氨基酸序列(mbnb207chopq，seqidno：20)。源自纳米抗体的序列以粗体显示。下划线的是源自hopq的序列。连接hopq的n-末端和c-末端以形成环状排列的肽用斜体表示。c-末端标签包括6xhis和epea。图4.eby100酵母细胞表面上的抗原结合嵌合蛋白mbnb207chopq展示的流式细胞仪分析单参数直方图显示了与未转化的eby100酵母细胞(底部)相比，用编码与aga2p和acp融合的抗原结合嵌合蛋白mbnb207chopq的pctcon2衍生物(seqidno:22)转化的eby100酵母细胞(顶部)的相对荧光强度。使用sfp合酶(1μm)，用coa-647(2μm)对转化的和未转化的酵母细胞进行正交染色。图5.eby100酵母细胞表面上展示的抗原结合嵌合蛋白mbnb207chopq的功能的流式细胞仪分析与未转化的eby100酵母细胞(底部)相比，用编码与aga2p和acp融合的mbnb207chopq的pctcon2衍生物(seqidno:22)转化的单个eby100酵母细胞的相对荧光强度的点图表示(顶部)。使用sfp合酶(1μm)，用coa-647(2μm)对转化的和未转化的酵母细胞进行正交染色，并与100nmgfp孵育。图6.通过大小排阻色谱和sds-page分析抗原结合嵌合蛋白mbnb207chopq和gfp之间的复合物的形成superdex75pg色谱柱(16/90，gehealthcare)上的分析性凝胶过滤实验，以证实mbnb207chopq(seqidno：20)和绿色荧光蛋白(gfp)之间稳定复合物的形成(scholz等，2000)。(a)通过sec分析复合物的形成。灰线：通过uv280nm吸收测量的仅包含gfp的样品的凝胶过滤模式。黑色虚线：通过uv280nm吸收测量的含有1:4摩尔比的mbnb207chopq和gfp的样品的凝胶过滤模式。黑线：通过uv488nm吸收测量的含有1:4摩尔比的mbnb207chopq和gfp的样品的凝胶过滤模式。(b)通过sdspage证实抗原结合嵌合蛋白mbnb207chopq和gfp之间形成了稳定的复合物。将含有1:4摩尔比的mbnb207chopq和gfp的样品上样至superdex75pg色谱柱，并通过sds-page分析了相关级分。图7.由插入连接gfp特异性纳米抗体的β链a和b的第一个β-转角中的hopq的环状排列变体构建的58kdgfp结合嵌合蛋白的x-射线晶体结构。(a)10个gfp结合嵌合蛋白在不对称单元中的排列(卡通表示)。58kd抗原结合嵌合蛋白mbnb207chopq(seqidno：20)在空间群p1中结晶，其中不对称单元中有10个分子。用作支架的的hopq黏附素结构域(pdb5lp2)用红色表示，gfp特异性nb用绿色表示。(b)连接纳米抗体与支架(分子a)的肽在2fo-fc电子密度图中以1.0σ轮廓清晰地定义。(c)不对称单元中包含的所有抗原结合嵌合蛋白mbnb207chopq的结构比对。不对称单元中不同分子之间的rmsd范围为0.3至图8.用于优化连接支架蛋白hopq与纳米抗体的接头肽的组成和长度的酵母展示载体(a)展示载体的示意图。ls：酵母α因子的工程化分泌信号，apps4(rakestraw等，2009)，其指导酵母中的胞外分泌。n：抗gfp-纳米抗体的β链a(seqidno:1的1-13)，纳米抗体：抗gfp-纳米抗体的β链b至g(seqidno:1的残基16-126)，aga2：酵母凝集素蛋白aga2p的aga2p黏附素亚基，其通过aga1p蛋白的二硫键附着在酵母细胞壁上(chao等，2006)，acp：用于展示的抗原结合嵌合蛋白的正交标记的酰基载体蛋白，以监测其表达水平(johnsson等，2005)。(b)展示的抗原结合嵌合蛋白的序列多样性(seqidno:34-37)：正常打印的apps4前导序列，粗体显示的具有随机接头的megabodychopqnbgfp207，是可变长度(1或2个氨基酸)和混合组成的短肽接头，柔性(gggs)n多肽接头以斜体表示，下划线的是aga2p蛋白序列，cmyc标签。(c)通过使用2个正向(seqidno:126，seqidno:127)和2个反向(seqidno:128，seqidno:129)pcr引物的等摩尔混合物引入可变长度(1或2个氨基酸)和混合组成的短肽接头，生成了抗原结合嵌合蛋白序列的4个库(每个表示库的25％)，编码总共184.000个aa序列变体。图9.通过体外选择由插入gfp特异性纳米抗体的第一个暴露的β-转角(连接β链a和b)中的ygjk的环状排列变体构建的100kd抗原结合嵌合蛋白的模型。(a)通过gfp特异性纳米抗体(顶部)和大肠杆菌k12ygjk(底部)的融合制得的抗原结合嵌合蛋白的模型。(b)融合编码大肠杆菌k12ygjk的环状排列基因(pdb3w7s，seqidno:38)，使得ygjk蛋白插入gfp特异性纳米抗体(顶部，seqidno:1)的连接β链a和β链b的第一个β-转角(β-转角ab)中，使用可变长度(1或2个氨基酸)和混合组成的短肽接头。(c)100kda抗原结合嵌合蛋白的氨基酸序列(seqidno:39-42)。nbgfp207序列以粗体表示，环状排列接头以斜体表示，下划线的是ygjk序列，是可变长度(1或2个氨基酸)和混合组成的短肽接头。c-末端标签包括6xhis和epea。图10.通过连接纳米抗体与支架的工程化二硫键将由插入连接gfp特异性纳米抗体的β链a和b的第一个β-转角中的hopq的环状排列变体构建的58kd抗原结合嵌合蛋白进一步刚化。为了进一步提高由插入gfp特异性纳米抗体的连接β链a与β链b的第一个β-转角(abβ-转角)(seqidno:1)中的幽门螺杆菌株g27的1型hopq的黏附素结构域(底部，pdb5lp2，seqidno:19)构建的抗原结合嵌合蛋白的刚性，我们使用定点诱变来工程化一个额外的连接纳米抗体与支架的二硫键。(a)在c357和c425之间含有工程化二硫桥的抗原结合嵌合蛋白mbnb207chopq的突变体的模型(seqidno:48)。(b)在c358和c488之间含有工程化二硫桥的mbnb207chopq的突变体的模型(seqidno:49)。(c)在c359和c490之间含有工程化二硫桥的mbnb207chopq的突变体的模型(seqidno:50)。(d)在c15和c534之间含有工程化二硫桥的mbnb207chopq的突变体的模型(seqidno:51)。图11.通过连接免疫球蛋白与支架的三个肽键或短接头由插入纳米抗体的第一个暴露的β-转角(连接β-链a和b)中的支架蛋白构建的抗原结合嵌合蛋白的工程化原理。抗原结合结构域可以通过三个直接融合体或通过接头形成的3个融合体在暴露区域或β-转角内的一个或多个可及位点和/或在蛋白质末端的可及位点与支架蛋白融合。在该方案中，我们使用纳米抗体的β-转角ab和c-末端来通过三个肽键或短接头连接ig结构域与支架。剪刀表示哪些暴露的转角必须在纳米抗体和支架中切割。虚线表示如何必须使用肽键或短肽接头将nb和支架的其余部分连接起来以构建这样的抗原结合嵌合蛋白。根据imgt定义nb的cdr、框架残基和β-转角区域(改编自lefranc的图25，2014)。图12.通过连接免疫球蛋白与支架的三个肽键或短接头由插入gfp特异性纳米抗体的连接β-链a和b的第一个β-转角中的cu++-结合蛋白azurin构建的抗原结合嵌合蛋白的模型(a)通过三个肽接头连接铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)azurin(底部，pdb2tsa，seqidno:52)的gfp特异性纳米抗体(顶部，seqidno:1)的融合制得的抗原结合嵌合蛋白的模型。铜离子用蓝色表示。(b)纳米抗体的第一条β-链(β-链a)后面接着支架蛋白(azurin)的n-末端部分，接着是免疫球蛋白的c-末端部分，接着是支架(azurin)的c-末端部分。(c)所得抗原结合嵌合蛋白的氨基酸序列(seqidno:53-60)：nbgfp207序列以粗体表示，下划线的是azurin序列，(x)1-2是可变长度(1或2个氨基酸)和混合组成的短肽接头。c-末端标签包括6xhis和epea。图13.通过连接免疫球蛋白与支架的三个肽键或短接头由插入gfp特异性纳米抗体的第一个暴露的β-转角(连接β-链a和b)中的反向糖苷水解酶支架蛋白susb构建的具有双重对称的二聚抗原结合嵌合蛋白的模型。(a)通过三个肽接头连接多形拟杆菌(bacteroidesthetaiotaomicron)susb的反向糖苷水解酶(底部，pdb3wfa，seqidno:69)的gfp特异性纳米抗体(顶部左和右，seqidno:1)的融合制得的抗原结合嵌合蛋白的模型。susb是具有双重对称的专性二聚体。(b)纳米抗体的第一条β-链(β-链a)后面接着支架蛋白(susb)的n-末端部分，然后接着是免疫球蛋白的c-末端部分，然后接着是支架的c-末端部分。(c)所得抗原结合嵌合蛋白的氨基酸序列。nbgfp207序列以粗体表示，(x)1-2是可变长度(1或2个氨基酸)和混合组成的短肽接头，下划线的是susb序列。c-末端标签包括6xhis和epea。图14.纳米抗体在衍生自细菌噬菌体(bacteriophage)pp7的二十面体vlp上的刚性展示。(a)二十面体vlp(内部分子)的示意图，以规则且刚性的阵列刚性地展示了纳米抗体(外部分子)的90个拷贝。野生型二十面体pp7病毒具有由180个相同的pp7衣壳蛋白拷贝组成的t＝3壳，但是可以将两个衣壳蛋白n融合到c上以生成由90个共价衣壳蛋白二聚体组成的vlp(o'rourke等，2015年)。(b)包含连接铜绿假单胞菌的细菌噬菌体pp7的共价衣壳蛋白二聚体的环状排列变体(底部，pdb1dwn)的gfp特异性纳米抗体(顶部，seqidno:1)的抗原结合嵌合蛋白的模型。(c)纳米抗体与pp7的排列衣壳蛋白二聚体的连接方案。将编码pp7的这个共价衣壳蛋白二聚体的环状排列基因插入连接β-链a与β-链b的纳米抗体的第一个β-转角中(seqidno:3-6)。(d)抗原结合嵌合衣壳蛋白的氨基酸序列。源自纳米抗体的残基以粗体显示。(x)1-2是可变长度(1或2个氨基酸)和混合组成的短肽接头。用下划线标出对应于pp7衣壳蛋白的序列。c-末端标签包括6xhis和epea。图15.纳米抗体在衍生自细菌噬菌体ms2的二十面体vlp上的刚性展示(a)二十面体vlp(内部分子)的示意图，以规则且刚性的阵列刚性地展示了纳米抗体(外部分子)的90个拷贝。野生型ms2病毒形成由180个相同的ms2衣壳蛋白拷贝组成的二十面体壳，但是可以将两个衣壳蛋白n融合到c上以生成由90个共价衣壳蛋白二聚体组成的vlp(o'rourke等，2015年)。(b)包含连接大肠杆菌的细菌噬菌体ms2的共价衣壳蛋白二聚体的环状排列变体(底部，pdb2ms2)的溶菌酶特异性纳米抗体(顶部，seqidno:7)的抗原结合嵌合蛋白的模型。(c)纳米抗体与ms2的排列衣壳蛋白二聚体的连接方案。将编码ms2的这个共价衣壳蛋白二聚体的环状排列基因插入连接β-链a与β-链b的纳米抗体的第一个β-转角中(seqidno:9)。(d)抗原结合嵌合衣壳蛋白的氨基酸序列。源自纳米抗体的残基以粗体显示。(x)1-2是可变长度(1或2个氨基酸)和混合组成的短肽接头。用下划线标出对应于ms2衣壳蛋白的序列。c-末端标签包括6xhis和epea。图16.通过连接抗原结合结构域与acp的两个肽键或短接头由插入gfp特异性纳米抗体的连接β-链a和b的第一个β-转角中的酰基载体蛋白构建的抗原结合嵌合蛋白的模型(a)通过两个肽接头连接来自大肠杆菌的酰基载体蛋白(底部，pdb1t8k，seqidno:86)的gfp特异性纳米抗体(顶部，seqidno:1)的融合制得的抗原结合嵌合蛋白的3d模型。在这个特定的抗原结合嵌合蛋白中，不需要支架蛋白的环状排列，因为野生型acp的n-末端和c-末端彼此接近并且对于工程化连接纳米抗体与acp的两个短多肽连接位置良好。反应性丝氨酸位于所示的左侧底部。(b)纳米抗体的第一条β-链(β-链a)后面接着acp，然后接着是纳米抗体的c-末端部分。(c)所得抗原结合嵌合蛋白的氨基酸序列。nbgfp207序列以粗体表示，(x)1-2是可变长度(1或2个氨基酸)和混合组成的短肽接头，下划线的是acp序列。c-末端标签包括6xhis和epea。图17.通过连接两个免疫球蛋白结构域的三个肽键或短接头由插入另一个纳米抗体中的纳米抗体构建的抗原结合嵌合蛋白的工程化原理。该方案显示了如何通过连接一个抗原结合结构域与另一个的三个肽键或三个短接头将一个纳米抗体(nb)与另一个纳米抗体融合。剪刀表示哪些暴露的转角必须在待连接的纳米抗体中切割。虚线表示如何必须使用肽键或短肽接头将两个纳米抗体的其余部分连接起来以构建这些抗原结合嵌合蛋白。根据imgt定义nb的cdr、框架残基和β-转角区域(图25，改编自lefranc，2014)。图18：nano2bodies抗原结合嵌合蛋白的模型(a)根据图17通过三个肽接头连接溶菌酶结合纳米抗体(纳米抗体a，seqidno:7)的gfp特异性纳米抗体(纳米抗体b，seqidno:1)的融合制得的抗原结合嵌合蛋白的3d模型。(b)纳米抗体a与纳米抗体b的连接方案。(c)所得抗原结合嵌合蛋白的氨基酸序列(seqidno:14)。nbgfp207序列以粗体表示，下划线的是溶菌酶结合纳米抗体。c-末端标签包括6xhis和epea。图19.nano2bodies抗原结合嵌合蛋白的模型(a)根据图17通过三个肽接头连接fedf结合纳米抗体(纳米抗体a，seqidno:17)的gfp特异性纳米抗体(纳米抗体b，seqidno:1)的融合制得的抗原结合嵌合蛋白的3d模型。(b)纳米抗体a与纳米抗体b的连接方案。(c)所得抗原结合嵌合蛋白的氨基酸序列(seqidno:18)。nbgfp207序列以粗体表示，下划线的是fedf结合纳米抗体。c-末端标签包括6xhis和epea。图20.用于产生和选择通过噬菌体展示或酵母展示衍生自纳米抗体免疫文库的抗原结合嵌合蛋白的代表性载体。此处显示的载体编码抗原结合嵌合蛋白，其中纳米抗体通过连接抗原结合结构域与支架的两个肽键或通过两个短接头将纳米抗体与大的(任选，环状排列的)支架蛋白融合。ls：前导序列。piii：丝状噬菌体m13的附着蛋白。aga2：从酵母细胞表面突出的aga2p交配蛋白。acp：酰基载体蛋白，用于展示的抗原结合嵌合蛋白的正交标记，以监控其表达水平。可以通过从抗原结合结构域编码基因的集合中克隆c-末端部分(包括β链b至g)来构建大型的抗原结合嵌合蛋白展示文库，所述集合，例如，在纳米抗体的情况中，可以从免疫的美洲驼克隆，或从合成文库收集。图21.衍生自纳米抗体免疫文库并通过酵母展示接着facs选择的gfp特异性抗原结合嵌合蛋白的序列分析通过酵母展示接着facs从抗原结合嵌合蛋白文库选择的九种gfp特异性抗原结合嵌合蛋白(seqidno:95-103)的多重氨基酸序列比对，所述文库从纳米抗体开始构建，所述纳米抗体从用gfp免疫的美洲驼的血样克隆并接着与hopq融合。仅显示了包括β链b到β链g的纳米抗体的c-末端部分。图22.由插入连接gfp特异性纳米抗体的β-链c和c’的β-转角中的hopq的环状排列变体构建的58kdgfp结合嵌合蛋白的模型。(a)通过连接β-链c和c'的β-转角将支架嫁接到纳米抗体上的工程化原理。剪刀表示哪些暴露的转角必须在纳米抗体和支架中切割。虚线表示如何必须使用肽键或短肽接头将纳米抗体和支架的其余部分连接起来以构建抗原结合嵌合蛋白。根据imgt定义nb的cdr、框架残基和β-转角区域(图25，改编自lefranc，2014)。(b)通过两个肽接头连接hopq(底部)的gfp特异性纳米抗体(顶部)的融合制得的抗原结合嵌合蛋白的3d模型。(c)纳米抗体的第三条β-链(β-链c)接着是支架的环状变体，然后接着是gfp特异性纳米抗体的β-链c'至g。(d)所得抗原结合嵌合蛋白的氨基酸序列。nbgfp207序列以粗体表示，(x)1-2是可变长度(1或2个氨基酸)和混合组成的短肽接头，环状排列接头以斜体表示，下划线的是hopq序列。图23.由插入连接单体ns1的β-链a和b的第一个β-转角中的hopq的环状排列变体构建的58kdgfp结合嵌合蛋白的模型。(a)通过连接纳米抗体与支架的两个肽键或接头融合k-ras特异性monobodyns1(顶部)和幽门螺杆菌hopq粘附素结构域的环状排列变体(底部)制得的抗原结合嵌合蛋白的模型。(b)将编码幽门螺杆菌株g27的1型hopq黏附素结构域的环状排列基因(底部，pdb5lp2，seqidno:19)插入k-ras特异性monobody的连接β-链a与β-链b的第一个β-转角(β-转角ab)(顶部，seqidno:112)中。(c)由ns1和hopq构建的抗原结合嵌合蛋白的氨基酸序列。源自纳米抗体的序列以粗体显示。下划线的是源自hopq的序列。连接hopq的n-末端和c-末端以形成环状排列的肽用斜体表示，(x)1-2是可变长度(1或2个氨基酸)和混合组成的短肽接头。图24.在octet上分析了抗原结合嵌合蛋白mbnb207chopq和mbnb207cygjke2与gfp相互作用的动力学特征。通过生物层干涉法进行了gfp结合纳米抗体nbgfp207(seqidno:1)、抗原结合嵌合蛋白mbnb207chopq(seqidno:20)和mbnb207cygjke2(seqidno:141)与gfp的实时动力学分析。将包被有链霉亲和素的生物传感器用于捕获生物素化的gfp(0.75μg/ml)，并与几个浓度(60-2.22nm范围)的nbgfp207(a)、mbnb207chopq(b)和mbnb207cygjke2(c)结合。将测得的响应(黑线)拟合到单相1:1结合模型(红线)。在10mmtris-hcl，140mmnacl，ph7.3，0.05％tween20和1mg/mlbsa中进行测定。(d)计算的动力学值显示为来自n＝3次独立实验的平均的平均标准误差(s.e.m.)。图25.根据imgt的免疫球蛋白可变结构域结构和拓扑结构，如改编自lefranc(2014)。(a)具有imgt链和环定界的3d结构带表示(lfranc等，2003)。(b)imgtcollierdeperles在具有氢键的两层上。两层上的imgtcollierdeperles在最前面显示gfcc’c”链(形成位于ig的vh/vl界面的层)，并且在背面显示abed链。具有氢键的imgtcollierdeperles(绿线在线上，此处仅显示gfcc0c00层)是由imgt/3d结构-db中集成的imgt/collier-de-perles工具从实验3d结构数据生成的(kaas等，2004；ehrenmann等，2010；ehrenmann和lefranc，2011)。图26.结合并延伸其他抗原结合嵌合蛋白的抗原结合嵌合蛋白的示意图。(a)mbnb60c7hopqmut2(seqidno:134)或mbnb60c7hopqmut3(seqidno:134)结合并延伸另一个mbnb207chopq(seqidno:20)，以产生116kda的延伸的抗原结合嵌合蛋白。(b)mbnb60cygjk(seqidno:135)结合并延伸mbnb207chopq(seqidno:20)，以产生分子量为168kda的延伸的抗原结合嵌合蛋白。图27.与mbnb207chopq复合的nb60的晶体结构揭示了在mbnb207chopq的chopq中包含的支架蛋白上的nb60的表位。图28.抗原结合嵌合蛋白的示意图，使用整合的化学接头单元将抗原结合结构域连接支架蛋白。图29.在octet上分析了称为多体(polybodies)的抗原结合嵌合蛋白与mbnb207chopq相互作用的动力学特征。通过生物层干涉法进行了hopq-特异性纳米抗体nb60(seqidno:132)、hopq-特异性mbnb60chopqmut2(seqidno:133)、hopq-特异性mbnb60chopqmut3(seqidno:134)和hopq-特异性mbnb60cygjk(seqidno:135)与mbnb207chopq(seqidno:20)结合的实时动力学分析。将包被有链霉亲和素的生物传感器用于捕获生物素化的mbnb207chopq(0.25μg/ml)。监测几个浓度(1.67至500nm范围)下的nb60(a)、mbnb60chopqmut2(b)、mbnb60chopqmut3(c)和mbnb60cygjk(d)的结合和解离等温线。在10mmtris-hcl，140mmnacl，ph7.3，0.05％tween20和1mg/mlbsa中进行全部测定。图30.在eby100酵母细胞的表面上展示的mbnb207chopq变体的功能的流式细胞术分析。mbnb207chopq(seqidno:22)和酵母展示选择的mbnb207chopq变体的代表(表2)作为aga2p和acp融合体在eby100细胞上展示。分别诱导单个酵母克隆，并使用sfp合酶(1μm)用coa-647(2μm)正交染色，并与100nmgfp孵育。点图表示用编码mp1331_a9megabody变体(a)和mbnb207chopq(b)的pctcon2衍生物转化的单个eby100酵母细胞的相对荧光强度。使用prism7软件(graphpad)计算每个单个酵母克隆的相对coa-647荧光(megabody展示水平)和相对gfp荧光(gfp结合)的平均荧光强度(mfi)。(c)图表表示计算的mbnb207chopq(seqidno:22)和每个单个mbnb207chopq变体(表2)的相对coa-647和gfp荧光的平均荧光强度(mfi)。图31.大肠杆菌表达和镍亲和色谱纯化后mbnb207c7hopq和四个酵母展示选择的mbnb207c7hopq变体的大小排阻色谱表征。通过酵母展示选择的具有1-1氨基酸肽接头的大肠杆菌表达的mbnb207c7hopq变体在superdex200pg色谱柱(10/300，gehealthcare)上的制备性凝胶过滤实验。mbnb207c7hopq(seqidno:136)克隆代表野生型连接变体，而mbnb207c7hopqa5(seqidno:137)、mbnb207c7hopqa12(seqidno:138)、mbnb207c7hopqb7(seqidno:139)、mbnb207c7hopqg10(seqidno:140)分别代表来自表2的mp1331_a5、mp1331_a12、mp1331_b7、mp1331_g10克隆。图32.通过elisa的mbnb207c7hopq和四个酵母展示选择的变体的gfp结合分析。在含有固定的gfp的孔上或在未包被的孔上孵育大小排阻纯化的mbnb207c7hopq(seqidno:136)，四个酵母展示选择的mbnb207c7hopqa5、mbnb207c7hopqa12、mbnb207c7hopqb7、mbnb207chopqg10变体(seqidno:137-140)和mbnb38c7hopq(seqidno:131)。使用与链霉亲和素-碱缀合物混合的生物素化抗epea(捕获选择c-标签)抗体检测存在于megabodies的c-末端上的epea标签。与4-硝基苯基磷酸二钠盐六水合物底物(dnpp)孵育后，测量了405nm处的吸光度(od405)。数据显示为以一式三份(n＝3)进行的实验的平均的平均标准误差(s.e.m)。图33.在eby100酵母细胞的表面上展示的mbnb207cygjk变体的功能的流式细胞术分析。酵母展示选择的mbnb207cygjk变体(表3)的代表作为aga2p和acp融合体在eby100细胞上展示。分别诱导单个酵母克隆，并使用sfp合酶(1μm)用coa-647(2μm)正交染色，并与100nmgfp孵育。(a)点图表示用编码mp1332_a2megabody变体的pctcon2衍生物转化的单个eby100酵母细胞的相对荧光强度。使用prism7软件(graphpad)计算每个单个酵母克隆的相对coa-647荧光(megabody展示水平)和相对gfp荧光(gfp结合)的平均荧光强度(mfi)。(b)图表表示计算的每个单个mbnb207cygjk变体(表3)的相对coa-647和gfp荧光的平均荧光强度(mfi)。图34.通过elisa分析的四个酵母展示选择的mbnb207cygjk变体的gfp结合。将含有不同mbnb207cygjk变体(seqidno:141-144)：mbnb207cygjke2、mbnb207cygjka2、mbnb207cygjkc4、mbnb207cygjkf5变体的周质提取物与mbnb38chopq(seqidno:131)相比。在含有固定的gfp的孔上或在未包被的孔上孵育所有样品。使用与链霉亲和素-碱缀合物混合的生物素化抗epea(捕获选择c-标签)抗体检测存在于megabodies的c-末端上的epea标签。与4-硝基苯基磷酸二钠盐六水合物底物(dnpp)孵育后，测量了405nm处的吸光度(od405)。图35.在大肠杆菌中表达的并通过镍亲和色谱通过大小排阻色谱纯化的mbnb207cygjke2变体的表征。(a)在制备性superdex200pg凝胶过滤柱(16/26，gehealthcare)上对在大肠杆菌的周质中表达并通过镍亲和色谱纯化的mbnb207cygjke2(seqidno:141)的分析。(b)来自(a)中所述的大小排阻实验的级分“峰1”中的mbnb207cygjke2megabody的纯度的sds-page分析。将纯化的mbnb207cygjke2样品(左线：“峰1”)加到8％sds-page凝胶中，并通过与分子量标记物(右线：m)比较，确认了分子量约为100kda。图36.通过连接纳米抗体与支架的工程化二硫键进一步刚化的mbnb207chopq变体的功能和生物物理表征。通过elisa分析了十个mbnb207chopq变体的gfp结合分析。(a)将大小排阻纯化的mbnb207chopq(seqidno:20)和四个mbnb207chopqcys1-4变体(seqidno:48-51，参见图10)在含有固定的gfp的孔上或在未包被的孔上孵育。(b)将大小排阻纯化的mbnb207c7hopq(seqidno:136)和四个mbnb207c7hopqcys5-10变体(seqidno:145-150)在含有固定的gfp的孔上或在未包被的孔上孵育。使用与链霉亲和素-碱缀合物混合的生物素化抗epea(捕获选择c-标签)抗体检测存在于megabodies的c-末端上的epea标签。与4-硝基苯基磷酸二钠盐六水合物底物(dnpp)孵育后，测量了405nm处的吸光度(od405)。数据显示为以一式三份(n＝3)进行的实验的平均的平均标准误差(s.e.m)。(c)通过热位移分析(tsa)进行了mbnb207chopq变体的热稳定性分析。图表表示mbnb207c7hopq(seqidno:136)、mbnb207chopqcys4(seqidno:51)、mbnb207c7hopqcys4(seqidno:145)、mbnb207c7hopqcys6(seqidno:146)和mbnb207chopqcys10(seqidno:150)变体的标准化解链曲线。计算的解链温度(tm)值列于表4中。图37.在eby100酵母细胞的表面上展示的mbnb207azurin变体的功能的流式细胞术分析。酵母展示选择的mbnb207azurin变体(表5)的代表作为aga2p和acp融合体在eby100细胞上展示。分别诱导单个酵母克隆，并使用sfp合酶(1μm)用coa-647(2μm)正交染色，并与100nmgfp孵育。(a)点图表示用编码mp1304_b2megabody变体的pctcon2衍生物转化的单个eby100酵母细胞的相对荧光强度。使用prism7软件(graphpad)计算每个单个酵母克隆的相对coa-647荧光(megabody展示水平)和相对gfp荧光(gfp结合)的平均荧光强度(mfi)。(b)图表表示计算的每个单个mbnb207azurin变体(表5)的相对coa-647和gfp荧光的平均荧光强度(mfi)。图38.通过elisa的八个酵母展示选择的mbnb207aruzin变体的gfp结合分析。将八个含有不同mbnb207aruzin变体(seqidno:151-158)的周质提取物和一个含有mbnb38chopq(seqidno:131)的提取物在含有固定的gfp的孔上或在未包被的孔上孵育。使用与链霉亲和素-碱缀合物混合的生物素化抗epea(捕获选择c-标签)抗体检测存在于megabodies的c-末端上的epea标签。与4-硝基苯基磷酸二钠盐六水合物底物(dnpp)孵育后，测量了405nm处的吸光度(od405)。数据显示为以一式三份(n＝3)进行的实验的平均的平均标准误差(s.e.m)。图39.通过elisa的gfp结合分析将含有不同的mbnb207cpp7×2l嵌合蛋白(seqidno:3-6)的周质提取物在固定的gfp(0.1μg/孔)或未包被的孔上孵育。使用与链霉亲和素-碱缀合物混合的生物素化抗epea(捕获选择c-标签)抗体检测存在于嵌合cppt二聚体的c-末端上的epea标签。与4-硝基苯基磷酸二钠盐六水合物底物(dnpp)孵育后，测量了405nm处的吸光度(od405)。图40：源自细菌噬菌体ap205的二十面体vlp上的纳米抗体的刚性展示(a)二十面体vlp(内部分子)的示意图，以规则且刚性的阵列刚性地展示了纳米抗体(外部分子)的90个拷贝。(b)抗原结合嵌合蛋白的模型，该蛋白包含连接不动杆菌属细菌二十面体rna细菌噬菌体ap205的共价衣壳蛋白二聚体(底部，pdb5fs4)的gfp特异性纳米抗体(顶部，seqidno:1)。(c)纳米抗体与ap205的衣壳蛋白的连接方案。(d)抗原结合嵌合衣壳蛋白的氨基酸序列(seqidno:167)。源自纳米抗体的残基以粗体显示。x是1个氨基酸的短随机肽接头。下划线的是对应于ap205衣壳蛋白的序列。c末端标签包括6xhis和epea。图41.通过elisa的372个克隆的gfp结合分析将含有mbnb207ap205×2xx二聚体(seqidno:167)的周质提取物(表示为mp数)在固定的gfp(0.1μg/孔)或未包被的孔上孵育。使用与链霉亲和素-碱缀合物混合的生物素化抗epea(捕获选择c-标签)抗体检测存在于嵌合ap205二聚体的c-末端上的epea标签。与4-硝基苯基磷酸二钠盐六水合物底物(dnpp)孵育后，测量了405nm处的吸光度(od405)。图42：纳米抗体在二聚抗原结合嵌合蛋白上的刚性展示(a)具有β链a交换的二聚抗原结合嵌合蛋白的模型。ap205单体装配成二聚体。为了获得功能性抗原结合嵌合体，第一个单体的gfp结合纳米抗体的β链a需要组合第二个单体的gfp结合纳米抗体的β链b到g以及第二个单体的gfp结合纳米抗体的β链b到g需要组合第一个单体的gfp结合纳米抗体的β链a，以装配成二聚抗原结合的嵌合蛋白。(b)包含两个gfp特异性纳米抗体(顶部，seqidno:1)的相同二聚抗原结合嵌合蛋白(变成90°)的模型，所述纳米抗体各自连接ap205的衣壳蛋白单体。(c)纳米抗体与ap205的衣壳蛋白的连接方案。(d)抗原结合嵌合衣壳蛋白的氨基酸序列(seqidno:173)。源自纳米抗体的残基以粗体显示。x是1个氨基酸的短随机肽接头。下划线的是对应于ap205衣壳蛋白的序列。c末端标签包括6xhis和epea。图43.通过elisa的372个克隆的gfp结合分析将含有mbnb207ap205xx二聚体(seqidno:173)的周质提取物(表示为mp数)在固定的gfp(0.1μg/孔)或未包被的孔上孵育。使用与链霉亲和素-碱缀合物混合的生物素化抗epea(捕获选择c-标签)抗体检测存在于ap205二聚体的c-末端上的epea标签。与4-硝基苯基磷酸二钠盐六水合物底物(dnpp)孵育后，测量了405nm处的吸光度(od405)。图44.在eby100酵母细胞的表面上展示的mbnb207acpnanotool变体的功能的流式细胞术分析。酵母展示选择的mbnb207acpnanotool变体(表9)的代表作为aga2p和acp融合体在eby100细胞上展示。分别诱导单个酵母克隆，并使用sfp合酶(1μm)用coa-647(2μm)正交染色，并与100nmgfp孵育。(a)点图表示用编码mp1302_d10nanotool变体的pctcon2衍生物转化的单个eby100酵母细胞的相对荧光强度。使用prism7软件(graphpad)计算每个单个酵母克隆的相对coa-647荧光(nanotool展示水平)和相对gfp荧光(gfp结合)的平均荧光强度(mfi)。(b)图表表示计算的每个单个mbnb207acpnanotool变体(表9)的相对coa-647和gfp荧光的平均荧光强度(mfi)。图45.通过elisa的六个酵母展示选择的mbnb207acpnanotool变体的gfp结合分析。将含有六个mbnb207acp变体(seqidno:178-183)和mbnb38chopq(seqidno:131)的周质提取物在含有固定的gfp的孔上或在未包被的孔上孵育。使用与链霉亲和素-碱缀合物混合的生物素化抗epea(捕获选择c-标签)抗体检测存在于megabodies的c-末端上的epea标签。与4-硝基苯基磷酸二钠盐六水合物底物(dnpp)孵育后，测量了405nm处的吸光度(od405)。数据显示为以一式三份(n＝3)进行的实验的平均的平均标准误差(s.e.m)。图46.nano2bodies抗原结合嵌合蛋白的模型。(a)根据图17通过三个肽接头连接fedf结合纳米抗体(纳米抗体a，seqidno:17)的gfp特异性纳米抗体(纳米抗体b，seqidno:1)的融合制得的大力改善的抗原结合嵌合蛋白的3d模型。(b)纳米抗体a与纳米抗体b的连接方案。(c)所得抗原结合嵌合蛋白的氨基酸序列(seqidno:184-185)。nbgfp207序列以粗体表示，下划线的是fedf结合纳米抗体。c-末端标签包括6xhis和epea。图47.通过elisa的代表性克隆的gfp和fedf结合分析将半纯化的n2body样品(seqidno:186-191)在固定的gfp(0.5μg/孔)、固定的fedf(0.5μg/孔)或未包被的孔上孵育。使用与链霉亲和素-碱缀合物混合的生物素化抗epea(捕获选择c-标签)抗体检测存在于nano2bodies的c-末端上的epea标签。与4-硝基苯基磷酸二钠盐六水合物底物(dnpp)孵育后，测量了405nm处的吸光度(od405)。图48.在eby100酵母细胞的表面上展示的chopqnbgfp207cc’megabody变体的功能的流式细胞术分析。酵母展示选择的chopqnbgfp207cc’megabody变体(表11)的代表作为aga2p和acp融合体在eby100细胞上展示。分别诱导单个酵母克隆，并使用sfp合酶(1μm)用coa-647(2μm)正交染色，并与100nmgfp孵育。(a)点图表示用编码mp1327_d5megabody变体的pctcon2衍生物转化的单个eby100酵母细胞的相对荧光强度。使用prism7软件(graphpad)计算每个单个酵母克隆的相对coa-647荧光(megabody展示水平)和相对gfp荧光(gfp结合)的平均荧光强度(mfi)。(b)图表表示计算的每个单个chopqnbgfp207cc’megabody变体(表11)的相对coa-647和gfp荧光的平均荧光强度(mfi)。图49.在eby100酵母细胞的表面上展示的mbns1chopq变体的功能的流式细胞术分析。酵母展示选择的mbns1chopq变体(表12)的代表作为aga2p和acp融合体在eby100细胞上展示。分别诱导单个酵母克隆，并使用sfp合酶(1μm)用coa-488(2μm)正交染色，并与100nmdylight-647标记的k-ras孵育。(a)点图表示用编码mp1326_a11megabody变体的pctcon2衍生物转化的单个eby100酵母细胞的相对荧光强度。使用prism7软件(graphpad)计算每个单个酵母克隆的相对coa-488荧光(megabody展示水平)和相对dylight-647荧光(k-ras结合)的平均荧光强度(mfi)。(b)图表表示计算的每个单个mbns1chopq变体(表12)的相对coa-488和dylight-647荧光的平均荧光强度(mfi)。图50.纳米抗体在来自结核分枝杆菌(m.tuberculosis)的dodecinrv1498a上的刚性展示(a)dodecinrv1498a(内部分子)的示意图，以规则且刚性的阵列刚性地展示了纳米抗体(外部分子)的12个拷贝。(b)抗原结合嵌合蛋白的3d模型，该蛋白通过两个肽接头由连接rv1498a单体(底部，seqidno:192)的gfp特异性纳米抗体(顶部，seqidno:1)的融合制得。在这个特别的抗原结合嵌合蛋白中，不需要支架蛋白的环状排列，因为野生型rv1498a的n-末端和c-末端彼此接近并且对于工程化连接纳米抗体与rv1498a的两个短多肽连接位置良好。(c)纳米抗体的第一条β-链(β-链a)后面接着rv1498a，然后接着是纳米抗体的c-末端部分。(d)所得抗原结合嵌合蛋白的氨基酸序列。nbgfp207序列以粗体表示，(x)1是1个氨基酸长度和混合组成的短肽接头，下划线的是rv1498a序列。c-末端标签包括6xhis和epea。图51.通过elisa对六个选择的mbnb207dodecin变体的gfp结合分析将含有六个mbnb207dodecin变体(表13)和nbgfp207纳米抗体(seqidno:1)的周质提取物在含有固定的gfp的孔上或在未包被的孔上孵育。使用与链霉亲和素-碱缀合物混合的生物素化抗epea(捕获选择c-标签)抗体检测存在于megabodies的c-末端上的epea标签。与4-硝基苯基磷酸二钠盐六水合物底物(dnpp)孵育后，测量了405nm处的吸光度(od405)。数据显示为以一式三份(n＝3)进行的实验的平均的平均标准误差(s.e.m)。图52.纳米抗体在来自b.cenocepacia的二硫化物桥接的同型二聚体上的刚性展示。(a)通过两个肽接头与gfp特异性纳米抗体(外部分子，seqidno:1)刚性融合的4qyb的同型二聚体(内部分子，seqidno:200)的示意图。(b)纳米抗体的第一条β-链(β-链a)后面接着4qyb，然后接着是纳米抗体的c-末端部分。(c)所得抗原结合嵌合蛋白的氨基酸序列。nbgfp207序列以粗体表示，(x)1-2是可变长度(1或2个氨基酸)和混合组成的短肽接头，下划线的是4qyb序列。c-末端标签包括6xhis和epea。图53.β2ar-wt在mbnb80chopq的存在或不存在下的配体结合特性与存在nb80的β2ar-wt(黑色正方形)，以及单独的β2ar-wt(灰色圆形)或存在无关的mbnb207chopq(灰色三角形)相比，mbnb80chopq存在下(黑色向上的三角形)不同配体与[3h]-二氢阿普洛尔([3h]-dha)竞争结合β2ar-wt的放射性配体位移测定。分别使用天然激动剂肾上腺素(a)和激动剂(-)-异丙肾上腺素(b)作为竞争配体，对β2ar-wt受体进行竞争测定。使用graphpadprism的标准设置，通过非线性回归将曲线拟合到竞争结合模型。发明详述将根据具体实施方案并参考某些附图来描述本发明，但是本发明不限于此，而是仅由权利要求书来限定。权利要求中的任何附图标记不应被解释为限制范围。当然，应当理解，根据本发明的任何具体实施方案，并无必要可以实现所有方面或优点。因此，例如，本领域技术人员将认识到，本发明可以以实现或优化本文所教导的一个优点或一组优点的方式实施或实现，而不必实现本文所教导或建议的其他方面或优点。当结合附图阅读下面的详细描述时，可以最好地理解本发明的组织和操作方法以及其特征和优点。参考下文描述的实施方案，本发明的各方面和优点将变得显而易见并得到阐明。在整个说明书中，提到“一个实施方案”或“实施方案”，是指结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性将包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在整个说明书中各处出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”无需，但可以，均指相同实施方案。类似地，应当理解，在本发明的示例性实施方案的描述中，有时将本发明的多种特征组合在单个实施方案、附图或其描述中，以简化公开并帮助理解多个发明方面中的一个或多个。然而，该公开方法不应解释为反映了这样一种意图，即所要求保护的发明需要比每个权利要求中明确叙述的特征更多的特征。相反，如所附权利要求所反映的，发明方面具有的特征可以少于单个之前公开的实施方案的所有特征。定义在提及单数名词时使用不定冠词或定冠词的地方，例如“一”或“一个”，“该”，除非特别说明，否则包括该名词的复数形式。在本说明书和权利要求书中使用术语“包括”时，其不排除其他元素或步骤。此外，说明书和权利要求书中的术语第一，第二，第三等用于区分相似的元件，而非一定用于描述顺序或时间顺序。应当理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，并且本文描述的本发明的实施方案能够以不同于本文描述或示出的其他顺序来操作。提供以下术语或定义仅用于帮助理解本发明。除非本文特定限定，否则本文使用的所有术语具有与本发明领域的技术人员所理解的相同的含义。本领域技术人员尤其可以参考sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》，第四版，冷泉港出版社，纽约州普莱恩斯维尤(2012年)；和ausubel等人，《现代分子生物学实验方案》(增刊114)，约翰·威利父子出版社，纽约(2016年)，以了解本领域的定义和术语。本文所提供的定义不应被解释为具有小于本领域普通技术人员所理解的范围。当涉及诸如量、持续时间之类的可测量值时，本文所用的“约”意在包括距规定值±20％或±10％，更优选±5％，甚至更优选±1％，且还更优选±0.1％的变化，只要这样的变化适合于执行所公开的方法。如本文所用的，“相似的”与一样、类似、相当、相应和如同可互换，并且意指具有相同或共同的特征，和/或以可量化的方式显示相当的结果，即具有20％、10％，更优选5％或甚至更优选1％或更少的最大变化。如本文所用的，“核苷酸序列”、“dna序列”或“核酸分子”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。该术语仅指分子的一级结构。因此，该术语包括双链和单链dna以及rna。它还包括已知类型的修饰，例如甲基化，一个或多个天然存在的核苷酸被类似物“加帽”取代。“核酸构建体”是指已经构建来包含一个或多个自然界中未一起发现的功能单元的核酸序列。实例包括环状、线性、双链、染色体外dna分子(质粒)、粘粒(含有来自λ噬菌体的cos序列的质粒)、包含非天然核酸序列的病毒基因组等。“编码序列”是置于适当调控序列的控制下时被转录成mrna和/或翻译成多肽的核苷酸序列。编码序列的边界由5'-末端的翻译起始密码子和3'-末端的翻译终止密码子确定。编码序列可以包括但不限于mrna、cdna、重组核苷酸序列或基因组dna，而在某些情况下内含子也可以存在。如本文所用的，“基因的启动子区”是指功能性dna序列单元，可操作地连接编码序列并可能置于适当的诱导条件下时，该单元足以促进所述编码序列的转录。“可操作地连接”是指一种并置，其中所述的组分处于允许它们以其预期的方式起作用的关系中。启动子序列“可操作地连接”编码序列是以在与启动子序列相容的条件下实现编码序列表达的方式连接。如本文所用的，“基因”包括基因的启动子区域以及编码序列。它既指基因组序列(包括可能的内含子)，也指可操作地连接启动子序列的衍生自剪接信使的cdna。术语“终止子”或“转录终止信号”包括其是在转录单元末端的dna序列的控制序列，其指示初级转录物的3'加工和聚腺苷酸化以及转录终止。终止子可以衍生自天然基因、各种其他植物基因或t-dna。待添加的终止子可以衍生自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因，或替代地衍生自另一种植物基因，或更优选地衍生自任何其他真核基因。“嵌合基因”或“嵌合构建体”或“嵌合基因构建体”是指其中启动子或调控核酸序列可操作地连接或结合编码mrna的核酸序列的重组核酸序列，使得调控核酸序列能够调控相关核酸编码序列的转录或表达。嵌合基因的调控核酸序列不与天然发现的相关核酸序列可操作地连接。“表达盒”包含能够指导目的基因/编码序列表达的任何核酸构建体，所述目的基因/编码序列可操作地连接表达盒的启动子。表达盒通常是dna构建体，其优选包括(在转录方向上的5'至3')：启动子区，与转录起始区可操作地连接的多核苷酸序列、其同源物、变体或片段，以及包括用于rna聚合酶的终止信号和聚腺苷酸化信号的终止序列。应当理解，所有这些区域都应该能够在待转化的生物细胞(如原核或真核细胞)中起作用。包含转录起始区的启动子区(优选包括rna聚合酶结合位点)和聚腺苷酸化信号对于待转化的生物细胞可以是天然的，或者可以源自其中该区域在生物细胞中起作用的其他来源。这样的盒可以被构造成“载体”。本文所用的术语“载体”、“载体构建体”、“表达载体”或“基因转移载体”旨在指能够运输与其连接的另一核酸分子的核酸分子，并且包括本领域技术人员已知的任何载体，包括任何合适的类型，包括但不限于质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体(如λ噬菌体)，病毒载体(如腺病毒、aav或杆状病毒载体)或人工染色体载体(如细菌人工染色体(bac)、酵母人工染色体(yac)或p1人工染色体(pac))。表达载体包括质粒以及病毒载体，并且通常含有所需的编码序列以及在特定宿主生物(例如细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物)中或在体外表达系统中表达可操作地连接的编码序列所必需的合适的dna序列。表达载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有在宿主细胞中起作用的复制起点的载体)。在将其他载体引入宿主细胞时，其可以整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。合适的载体根据需要并根据特定的宿主生物(例如细菌细胞、酵母细胞)具有调控序列，如启动子、增强子、终止子序列等。克隆载体通常用于工程化和扩增某些所需的dna片段，并且可能缺少表达所需dna片段需要的功能序列。用于转染原核细胞的表达载体的构建在本领域中也是公知的，并且因此可以通过标准技术来完成(参见，例如，sambrook等，molecularcloning:alaboratorymanual，第4版，coldspringharborpress，plainsview，newyork(2012)；和ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology(增补114)，johnwiley&sons，newyork(2016)，以获取本领域的定义和术语。“宿主细胞”可以是原核或真核的。细胞可以是瞬时或稳定转染的。可以通过本领域已知的任何技术将表达载体转染到原核和真核细胞中，包括但不限于标准细菌转化、磷酸钙共沉淀、电穿孔或脂质体介导-、deae葡聚糖介导-、聚阳离子介导-或病毒介导的转染。对于所有标准技术，参见，例如，sambrook等，molecularcloning:alaboratorymanual，第4版，coldspringharborpress，plainsview，newyork(2012)；和ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology(增补114)，johnwiley&sons，newyork(2016)。在本文中，重组宿主细胞是已经被遗传修饰以含有本发明分离的dna分子、核酸分子或表达构建体或载体的那些。可以通过本领域已知的适合特定细胞类型的任何方式引入dna，包括但不限于转化、脂转染、电穿孔或病毒介导的转导。通过本领域已知的技术，如克隆、杂交筛选和聚合酶链反应(pcr)，可以容易地制备能够表达本发明的嵌合蛋白的dna构建体。用于克隆、dna分离、扩增和纯化，用于涉及dna连接酶、dna聚合酶、限制性核酸内切酶等的酶促反应的标准技术，以及各种分离技术是本领域技术人员已知的和常用的那些技术。sambrook等(2012)，wu(编辑)(1993)和ausubel等(2016)描述了许多标准技术。可用于本发明的代表性宿主细胞包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、植物细胞和动物细胞。适用于本发明的细菌宿主细胞包括埃希氏菌属(escherichia)细胞、芽孢杆菌属(bacillus)细胞、链霉菌属(streptomyces)细胞、欧文氏菌属(erwinia)细胞、克雷伯菌属(klebsiella)细胞、沙雷氏菌属(serratia)细胞、假单胞菌属(pseudomonas)细胞和沙门氏菌属(salmonella)细胞。适用于本发明的动物宿主细胞包括昆虫细胞和哺乳动物细胞(最特别地衍生自中国仓鼠(例如cho)，以及人类细胞系，例如hela。适用于本发明的酵母宿主细胞包括酵母属(saccharomyces)、裂殖酵母属(schizosaccharomyces)、克鲁维酵母属(kluyveromyces)、毕赤酵母属(pichia)(例如巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris))、汉逊酵母属(hansenula)(例如多形汉逊酵母(hansenulapolymorpha))、yarowia、施氏酵母属(schwaniomyces)、裂殖酵母属(schizosaccharomyces)、接合酵母属(zygosaccharomyces)等内的种。酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、卡尔酵母(s.carlsbergensis)和乳酸克鲁维酵母(k.lactis)是最常用的酵母宿主，并且是常规的真菌宿主。宿主细胞可以以悬浮或烧瓶培养物、组织培养物、器官培养物等形式提供。或者，宿主细胞也可以是转基因动物。术语“蛋白质”、“多肽”、“肽”可互换地在本文中进一步用来指氨基酸残基及其变体和合成性类似物的聚合物。因此，这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸(如相应天然存在的氨基酸的化学类似物)的氨基酸聚合物以及天然存在的氨基酸聚合物。这个术语还包含多肽的翻译后修饰，如糖基化、磷酸化和乙酰化。基于氨基酸序列和修饰，多肽的原子或分子量或重量以(千)道尔顿(kda)表示。“重组多肽”意指使用重组技术(即，通过表达重组或合成性多核苷酸)产生的多肽。当重组地产生嵌合多肽或其生物学活性部分时，它还优选地基本上不含培养基，即，培养基占所述蛋白质制备物的体积少于约20％、更优选小于约10％并且最优选小于约5％。“分离的”意指这样的材料，所述材料大体上或基本上不含其天然状态下通常伴随它的组分。例如，“分离的多肽”指这样的多肽，所述多肽已经从天然存在状态侧接其的分子纯化，例如，抗原结合嵌合蛋白，其已经从生产宿主中存在的与所述多肽毗邻的分子中取出。也可以通过氨基酸化学合成法产生或通过重组产生法产生这种分离的嵌合体。表述“异源蛋白质”可以表示该蛋白质不是来自用于展示或表达该蛋白质的相同物种或品系。蛋白质的“同源物(homologue，homologues)”包括相对于所讨论的未修饰的蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入并且与衍生它们的未修饰的蛋白质具有相似的生物学和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶。如本文所用的，术语“氨基酸同一性”是指在比较窗口中，在氨基酸对氨基酸的基础上，序列相同的程度。因此，通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列，确定两个序列中均出现的相同氨基酸残基(例如，ala、pro、ser、thr、gly、val、leu、ile、phe、tyr、trp、lys、arg、his、asp、glu、asn、gln、cys和met，在本文中也用一个字母代码表示)，以产生匹配的位置数，将匹配的位置数除以比较窗口中的位置总数(即窗口大小)，然后将结果乘以100，获得序列同一性的百分比，从而计算“序列同一性的百分比”。与亲本蛋白质或其片段的氨基酸序列或核苷酸序列相比，本文所用的“取代”或“突变”是分别由一个或多个氨基酸或核苷酸被不同的氨基酸或核苷酸替换引起的。可以理解，蛋白质或其片段可以具有保守的氨基酸取代，其对蛋白质的活性基本上没有影响。术语“野生型”是指从天然产生来源分离的基因或基因产物。野生型基因是在群体中最常观察到的基因，因此该基因的“正常”或“野生型”形式被任意设计。相反，术语“修饰的”、“突变体”或“变体”是指与野生型基因或基因产物相比时，在序列、翻译后修饰和/或功能特性(即改变的特征)上显示出修饰的基因或基因产物。应当指出，可以分离天然存在的突变体；通过与野生型基因或基因产物相比，它们具有改变的特征这一事实来鉴定它们。“蛋白质结构域”是蛋白质中不同的功能和/或结构单元。通常，蛋白质结构域负责特定功能或相互作用，有助于蛋白质的整体作用。结构域可以存在于多种生物环境中，其中在具有不同功能的蛋白质中可以发现相似的结构域。蛋白质二级结构元件(sse)通常在蛋白质折叠成其三维三级结构之前自发地作为中间体形成。蛋白质的两种最常见的二级结构元件是α螺旋和beta(β)折叠，尽管也会出现β-转角和ω环。β折叠由通过至少两个或三个骨架氢键侧向连接的beta链(也称为β链)组成，形成了大致扭曲的褶状片层。β-链是一条通常3至10个氨基酸长的多肽链，其主链呈延伸构象。β-转角是蛋白质中一种不规则的二级结构，其引起多肽链方向的变化。bata转角(β转角、β-转角、β-弯头、紧弯、反向弯头)是蛋白质和多肽中非常常见的基序，主要用于连接β-链。有关可变结构域中存在的β-转角的定义，另请参见lefranc(2014)和图25。β-转角通常由四个氨基酸残基组成(标记的i、i+1、i+2和i+3)，并以两种方式定义：或通过在残基i的co和残基i+3的nh之间具有主链内氢键；或者，通过使残基i和i+3的cα原子之间的距离小于氢键标准是最适合日常使用的标准，部分原因是它产生了四个不同的类别。术语“蛋白质的环状排列”或“环状排列的蛋白质”是指与野生型蛋白质序列相比，其氨基酸序列中的氨基酸顺序改变的蛋白质，因此获得具有不同的连接性，但总体上三维(3d)形状相似的蛋白质。蛋白质的环状排列类似于环状排列的数学概念，从某种意义上说，野生型蛋白质的第一部分的序列(与n-末端相邻)与所得的环状排列蛋白质的第二部分的序列(接近其c-末端)有关，如例如bliven和prlic(2012)中所述的。通过蛋白质序列的遗传或人工工程化，获得与其野生蛋白质相比的蛋白质环状排列，其中野生型蛋白质的n-和c-末端“相连”，并且蛋白质序列在另一个位点被干扰，以形成所述蛋白质的新的n-和c-末端。本发明的环状排列支架蛋白是野生型蛋白序列连接的n-和c-末端以及所述支架蛋白的可及或暴露位点(优选β-转角或环)处切割或干扰序列的结果，从而与野生型蛋白的折叠相比，环状排列的支架蛋白的折叠得以保留或相似。所述环状排列的支架蛋白中n-和c-末端的所述连接可以是肽键连接或引入肽接头的结果，或者如果是野生型蛋白，是缺失原始n-和c-末端附近的肽段，接着是肽键或其余氨基酸的结果。如本文所用的，术语“融合”，以及在本文中可互换地用作“结合”，“缀合”，“连接”，尤其是指“遗传融合”，例如通过重组dna技术，以及是指导致稳定的共价连接的“化学和/或酶结合”。术语“嵌合多肽”、“嵌合蛋白”、“嵌合体”、“融合多肽”、“融合蛋白”或“非天然存在的蛋白”在本文中可互换使用，并且是指包含至少两个可能来自或可能不来自同一蛋白质的单独的且不同的多肽组分。该术语还指非天然存在的分子，这意味着它是人造的。涉及嵌合多肽(如本文所定义的)时，术语“融合”和其他语法等同形式，如“共价连接”，“结合”，“附上”，“连接”，“缀合”，是指连接两个或多个多肽成分的任何化学或重组机制。两个或更多个多肽组分的融合可以是序列的直接融合，或者可以是间接融合，例如使用插入氨基酸序列或接头序列或化学接头。如本文所述，两个多肽或抗原结合结构域与支架蛋白的融合也可以指通过化学连接获得的非共价融合。例如，抗原结合结构域的a链的c-末端和b链的n-末端都可以连接化学单元，该化学单元能够在暴露或可及的位置结合互补化学单元或结合与部分或全长(环状排列)支架蛋白连接或融合的口袋(如图28所示)。如本文所用的，术语“蛋白质复合物”或“复合物”或“装配的蛋白质”是指一组两个或更多个结合的大分子，其中至少一个大分子是蛋白质。如本文所用的，蛋白质复合物通常是指可以在生理条件下形成的大分子缔合。蛋白质复合物的各个成员通过非共价相互作用连接。蛋白质复合物可以是仅蛋白质的非共价相互作用，因此被称为蛋白质-蛋白质复合物；例如，两种蛋白质、三种蛋白质、四种蛋白质等的非共价相互作用。更具体地，是抗原结合嵌合蛋白和抗原本身的复合物。如本文所用的，蛋白质复合物也可以是至少一种蛋白质与至少其他大分子(如核酸)的非共价相互作用，因此被称为蛋白质-核酸复合物；例如，一种蛋白质和一种核酸、两种蛋白质和一种核酸、两种蛋白质和两种核酸的非共价相互作用等。应当理解，蛋白质复合物可以是多聚的。蛋白质复合物装配可导致同型多聚或杂多聚复合物的形成。此外，相互作用可以是稳定的或短暂的。术语“多聚体”、“多聚复合物”或“多聚蛋白质白”包括多个相同或异源的多肽单体。多肽能够自装配成由多个单个多肽单体自装配形成的多聚装配体(即：二聚体、三聚体、六聚体、五聚体、八聚体等)(即“同型多聚装配体”)。如本文所用的，“多个”是指2个或更多个。多聚装配体包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个的多肽单体。多聚装配体可用于任何目的，并提供一种开发多种蛋白质“纳米材料”的方式。除了有限的、笼状或壳状蛋白装配体之外，还可以通过选择适当的靶标对称结构来设计它们。本发明的单体和/或多聚装配体可以用于高级装配体的设计中，伴有有分层装配的优点。所得的多聚装配体是具有优良刚性和单分散性的高度良序材料，并且可以构成高级功能材料和具有广泛应用范围的定制设计分子机制的基础。如本文所用的，术语“确定”、“测量”、“评估”和“测定”可互换使用，并且包括定量和定性测定。术语“合适的条件”是指环境因素，如温度、运动、其他组分和/或“缓冲条件”，其中，“缓冲条件”具体是指在其中进行测定的溶液的组成。所述组合物包括缓冲溶液和/或溶质，如ph缓冲物质、水、盐水、生理盐溶液、甘油、防腐剂等，本领域技术人员知道将其合适地用于获得最佳测定性能。“结合”意指任何相互作用，无论它是直接或间接的。直接相互作用提示结合配偶体之间的接触。间接相互作用意指任何相互作用，其中借此相互作用配偶体在多于两种分子的复合体中相互作用。这种相互作用可以借助一个或多个桥接分子而是完全间接的，或是部分间接的，其中在配偶体之间仍存在直接接触，所述直接接触借助一种或多种分子的附加相互作用稳定化。通常，结合结构域可以是基于免疫球蛋白的或免疫球蛋白样的，或者可以基于蛋白质中存在的结构域，包括但不限于微生物蛋白、蛋白酶抑制剂、毒素、纤连蛋白、脂质运载蛋白、单链反平行卷曲螺旋蛋白或重复基序蛋白。如本文就抗原结合、免疫球蛋白、免疫球蛋白样结构域或抗体结构域所用的术语“特异性结合”意指识别特定抗原，但基本上不识别或不结合样品中其他分子的结合结构域，并且也被称作为“抗原结合结构域”或“抗原结合蛋白”。例如，与来自一个物种的抗原特异性结合的抗体还可能与来自一个或多个物种的这种抗原结合。但是，这类跨物种反应性本身不改变抗体划分为特异性。在一些情况下，在指抗体、蛋白质或肽与第二化学物质相互作用时，术语“特异的结合”或“特异性结合”可以用来意指这种相互作用依赖于特定结构(例如，抗原决定簇或表位)在这种化学物质上的存在；例如，抗原结合蛋白识别并且结合于特定的蛋白结构而非总体结合于蛋白质。如果抗原结合蛋白对表位“a”是特异的，则含有表位a的分子(或游离、未标记的a)在含有标记的“a”和这种抗原结合蛋白的反应中的存在将减少与抗原结合蛋白结合的标记a的量。如本文所用的，术语“特异性”是指结合结构域，特别是抗原结合结构域、免疫球蛋白或免疫球蛋白样结构域，或免疫球蛋白片段，如vhh或纳米抗体，与不同抗原相比，优先结合一种抗原的能力，但并不一定意味着高亲和力。抗原结合蛋白的更多实例还包括合成的结合蛋白、抗体模拟物，或更具体地还包括monobodies(例如，对于综述，参见sha等，2017)。这样的monobodies被定义为包含iii型纤连蛋白结构域的结合蛋白，由于与免疫球蛋白折叠相比它们具有相似的整体折叠，它们以与骆驼科单结构域抗体(vhh)相似的方式特异性地结合靶蛋白。monobodies涉及最广泛使用的非抗体支架，由于其纤连蛋白iii型结构域代表免疫球蛋白样折叠，涉及7条反平行的β链，如抗体的可变结构域，通过fn3环或β转角连接在结构域的一侧，表示抗原结合区，与抗体的cdr相似，而另一侧通过β转角连接，其可以用作融合支架蛋白的的可及位点，以形成本发明的抗原结合嵌合蛋白。如本文所用的，“表位”是指多肽的抗原决定簇。表位可以在空间构象中包含3个氨基酸，这是该表位所独有的。通常，表位由至少4、5、6、7个这样的氨基酸组成，并且更常见地，由至少8、9、10个这样的氨基酸组成。确定氨基酸的空间构象的方法是本领域已知的，并且包括例如x射线晶体学和多维核磁共振。如本文所用的，“构象表位”是指包含在空间构象中的氨基酸的表位，其对于多肽的折叠3维构象是独特的。通常，构象表位由在线性序列中不连续但在蛋白质折叠结构中结合在一起的氨基酸组成。然而，构象表位也可以由氨基酸的线性序列组成，其采用对于多肽的折叠3维构象独特的构象(并且不以变性状态存在)。在蛋白质复合物中，构象表位由一个或多个多肽的线性序列中不连续的氨基酸组成，这些氨基酸在不同折叠的多肽折叠时结合在一起并且以独特的四级结构缔合。相似地，构象表位在这里也可以由一个或多个多肽的氨基酸线性序列组成，所述多肽结合在一起并采用四极结构独特的构象术语。蛋白质的“构象”或“构象状态”通常是指蛋白质在任何瞬间都可以采用的结构范围。本领域技术人员将认识到，构象或构象状态的决定簇包括如蛋白质的氨基酸序列(包括修饰的氨基酸)所反映的蛋白质的一级结构和蛋白质周围的环境。蛋白质的构象或构象状态还涉及结构特征，如蛋白质二级结构(例如，α-螺旋、β-折叠等)、三级结构(例如，多肽链的三维折叠)和四级结构(例如，多肽链与其他蛋白质亚基的相互作用)。多肽链的翻译后修饰和其他修饰，如配体结合、磷酸化、硫酸化、糖基化或疏水基团的连接等，可能会影响蛋白质的构象。此外，环境因素，如ph、盐浓度、离子强度和周围溶液的重量克分子渗透压摩尔浓度，以及与其他蛋白质和辅助因子的相互作用等，都可以影响蛋白质构象。蛋白质的构象状态可以通过针对活性或与另一分子的结合的功能测定或通过通过物理方法(如x射线晶体学，nmr或自旋标记)来确定。对于蛋白质构象和构象状态的一般性讨论，可以参考cantor和schimmel，biophysicalchemistry，第i部分：theconformationofbiological.macromolecules,.w.h.freemanandcompany，1980，和creighton，proteins:structuresandmolecularproperties,w.h.freemanandcompany，1993。如本文所用的，术语“亲和力”通常是指配体(如本文进一步定义的)与靶蛋白结合的程度，以使靶蛋白和配体的平衡向着由它们的结合形成的复合物的存在转移。因此，例如，在抗原结合嵌合多肽和配体以相对相等的浓度结合的情况下，高亲和力的配体将结合抗原结合嵌合多肽，从而使平衡向着高浓度的所得复合物移动。解离常数kd通常用于描述配体和靶蛋白之间的亲和力。通常，解离常数的值小于10-5m。优选，解离常数小于10-6m，更优选小于10-7m。最优选，解离常数小于10-8m。描述配体与其靶蛋白之间的亲和力的其他方法是缔合常数(ka)、抑制常数(ki)，或通过测量半数最大抑制浓度(ic50)或半数最大有效浓度(ec50)评估配体的效能来间接描述。应当理解，在本发明的范围内，术语“亲和力”用于包含结合目标蛋白(构象)表位的ig结构域的抗原结合嵌合蛋白的背景中，更特别地，用于保留其“功能”以通过所述ig结构域的cdr区结合其靶标的抗原结合嵌合蛋白ig结构域的背景中。因此，如本文所用，在本发明的上下文中，术语“功能性抗原结合蛋白”或“构象选择性抗原结合结构域”是指任选以构象选择性的方式在结合其靶蛋白中起作用的所述嵌合抗原结合蛋白的ig结构域。选择性结合靶蛋白的特定构象的结合结构域是指与靶标设想的其他构象相比，构象子集中以更高亲和力结合靶标的结合结构域。本领域技术人员将认识到，选择性结合靶标的特定构象的结合结构域将使靶标稳定或保留在该特定构象中。例如，活性状态构象选择性结合结构域将优先结合处于活性构象状态的靶标，并且将不结合或以较小的程度结合非活性构象状态的靶标，因此对所述活性构象状态具有更高的亲和力；反之亦然。术语“特异性结合”、“选择性结合”、“优先结合”及其语法等效表述在本文中可互换使用。术语“构象特异性”或“构象选择性”在本文中也可互换使用。如本文所用，术语“抗体”指与抗原特异性结合的免疫球蛋白(ig)分子或包含免疫球蛋白(ig)结构域的分子。抗体可以是来自天然来源或来自重组来源的完整的免疫球蛋白并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体一般是免疫球蛋白分子的四聚体。如本文所用的术语“免疫球蛋白(ig)结构域”指抗体链的球状区域、或基本上由这种球状区域组成的多肽。免疫球蛋白结构域的特征在于，它们保留抗体分子的免疫球蛋白折叠(如本文所命名的ig折叠)特征，所述的免疫球蛋白折叠特征由约七至九个反平行β-链的按两个β-片层布置的双层夹心组成，所述双层夹心任选地由保守的二硫键稳定。术语“免疫球蛋白(ig)结构域”，包括“免疫球蛋白恒定结构域”和“免疫球蛋白可变结构域”(缩写为“ivd”)，其中后者意指基本上由四个“框架区”组成的免疫球蛋白结构域，所述框架区在本领域及下文分别称作“框架区1”或“fr1”；称作“框架区2”或“fr2”；称作“框架区3”或“fr3”；及称作“框架区4”或“fr4”；所述框架区由三个“互补决定区”或“cdr”中断，所述互补决定区在本领域和下文分别称作“互补决定区1”或“cdr1”；称作“互补决定区2”或“cdr2”；和称作“互补决定区3”或“cdr3”。因此，免疫球蛋白可变结构域的总体结构或序列可以如下指示：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。正是免疫球蛋白可变结构域(ivd)通过携带抗原结合位点，赋予抗体对抗原的特异性。根据imgt分类，免疫球蛋白可变结构域或v结构域包含约100个aa，并且由九条反平行β链(a、b、c、c'、c”、d、e、f和g)形成，所述β链通过β-转角(ab、cc'、c”d、de和ef)和三个环(或cdr)(bc、c'c”和fg)连接，形成两层夹层[abed][gfcc'c”](图25，改编自lefranc，2014)。所述折叠通过疏水性相互作用彼此紧密地堆积在一起，形成疏水核，并通过β-链b中的第一高度保守的半胱氨酸(1st-cys)(在第一个折叠中)和β-链f中的第二同等保守的半胱氨酸(2nd-cys)(在第二个折叠中)之间的二硫化物桥连接在一起。与文献中描述的cdr相比，本发明中使用的定义系统的独特编号提供了准确且明确界定的cdr-imgt。有关可替代的编号，另请参见例如kabat(kabat等，1991)或chothia(chothia和lesk，1987)。对于v结构域，cdr1-imgt包括27-38位，cdr2-imgt包括56-65位和cdr3-imgt包括105-117位(lefranc，2014)。本发明的ig结构域的“暴露区域”或“暴露环”是指在蛋白质表面暴露的区域或多肽链。对于ig结构域，所述暴露区域或环优选为β-转角，并且最优选为如lefranc(2014)所定义的β-转角。尽管根据imgt的定义，cdr也被认为是“环”，但是那些不被认为是本发明的“暴露区域”的优选候选，其具有用于与支架融合的可及位点，因为这最有可能导致抗原结合的破坏，因此不允许获得功能性抗原结合嵌合蛋白。本发明的“免疫球蛋白”还包括“免疫球蛋白单一可变结构域”(缩写为“isvd”)，等同于术语“单一可变结构域”，并且定义了其中抗原结合位点存在于单个免疫球蛋白结构域上并由其形成的分子。这设定免疫球蛋白单一可变结构域区别于其中两个免疫球蛋白结构域、尤其两个可变结构域相互作用以形成抗原结合位点的“常规”免疫球蛋白或其片段。一般，在常规的免疫球蛋白中，重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)相互作用以形成抗原结合位点。在这种情况下，vh和vl的互补决定区(cdr)均将有助于抗原结合位点，即总计6个cdr将涉及抗原结合位点形成。鉴于以上定义，常规4链抗体(如igg、igm、iga、igd或ige分子；本领域已知)或衍生自这类常规4链抗体的fab片段、f(ab')2片段、fv片段(如二硫键连接的fv或scfv片段)或双体抗体(diabody)(本领域均已知)的抗原结合结构域正常情况下将不视作免疫球蛋白单一可变结构域，因为在这些情况下，与相应的抗原表位结合正常情况下将不借助一个(单一)免疫球蛋白结构域发生，而借助与相应抗原的表位共同结合的一对(缔合的)免疫球蛋白结构域(如轻链可变结构域和重链可变结构域)(即，借助免疫球蛋白结构域的vh-vl对)发生。相反，不与额外的免疫球蛋白可变结构域配对情况下，免疫球蛋白单一可变结构域能够与抗原的表位特异性结合。免疫球蛋白单一可变结构域的结合位点由单一vh/vhh或vl结构域形成。因此，免疫球蛋白单一可变结构域的抗原结合位点由不多于三个cdr形成。从而，单一可变结构域可以是轻链可变结构域序列(例如，vl-序列)或其合适的片段；或重链可变结构域序列(例如，vh-序列或vhh序列)或其合适的片段；只要它能够形成单一抗原结合单元(即，基本上由单一可变结构域组成的有功能抗原结合单元，从而单一抗原结合结构域不需求与另一个可变结构域相互作用以形成有功能抗原结合单元)。在本发明的一个实施方案中，免疫球蛋白单一可变结构域是重链可变结构域序列(例如，vh-序列)；更具体地，免疫球蛋白单一可变结构域可以是从常规四链抗体衍生的重链可变结构域序列或从重链抗体衍生的重链可变结构域序列。例如，免疫球蛋白单一可变结构域可以是(单一)结构域抗体(或适合用作(单一)结构域抗体的氨基酸序列)、“dab”或dab(或适合用作dab的氨基酸序列)或纳米抗体(如本文定义，并包括但不限于vhh)；其他单一可变结构域、或其任一者的任何合适片段。特别地，免疫球蛋白单一可变结构域可以是纳米抗体(如本文定义)或合适的其片段。注：(和)是ablynxn.v.的注册商标。关于纳米抗体的一般说明，参考以下进一步描述以及本文中援引的现有技术，例如，如wo2008/020079中描述。本文的免疫球蛋白结构域还包括“vhh结构域”，也称为vhh，vhh域，vhh抗体片段和vhh抗体，最初被描述为“重链抗体”(即，“不含轻链的抗体”；hamers-castermanet等人(1993)nature363：446-448)的抗原结合免疫球蛋白(ig)(可变)结构域。选择术语“vhh结构域”以将这些可变结构域与常规4链抗体中存在的重链可变结构域(在本文中称为“vh结构域”)和存在于常规4-链抗体中的轻链可变结构域(在本文中称为“vl结构域”)区分开来。对于vhh和纳米抗体的进一步描述，参考muyldermans的综述文章(reviewsinmolecularbiotechnology74：277-302，2001)以及以下专利申请(这些文献被作为一般
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：：提及)：布鲁塞尔自由大学的wo94/04678，wo95/04079和wo96/34103；联合利华的wo94/25591，wo99/37681，wo00/40968，wo00/43507，wo00/65057，wo01/40310，wo01/44301，ep1134231和wo02/48193；vlaamsinstituutvoorbiotechnologie(vib)的wo97/49805，wo01/21817，wo03/035694，wo03/054016和wo03/055527；algonomicsn.v.和ablynxn.v.的wo03/050531；加拿大国家研究委员会的wo01/90190；抗体研究所的wo03/025020(＝ep1433793)；以及ablynxnv的wo04/041867，wo04/041862，wo04/041865，wo04/041863，wo04/062551，wo05/044858，wo06/40153，wo06/079372，wo06/122786，wo06/122787和wo06/122825；以及ablynxnv的其他公开的专利申请。如这些参考文献中所述，纳米抗体(特别是vhh序列和部分人源化的纳米抗体)尤其可以通过在一个或多个框架序列中存在一个或多个“hallmark残基”来表征。纳米抗体的进一步描述，包括纳米抗体的人源化和/或驼源化以及其他修饰、部分或片段、衍生物或“纳米抗体融合物”、多价构建体(包括接头序列的一些非限制性示例)和用于延长纳米抗体的半衰期的不同修饰及其制备，可以见于例如在wo08/101985和wo08/142164中。“结构域抗体”，也称为“dabs”、“域抗体”和“dabs”(术语“域抗体”和“dabs”由葛兰素史克集团公司使用作为商标)，已经描述在例如ep0368684,ward等人(nature341：544-546，1989)，holt等(tendsinbiotechnology21：484-490，2003)和wo03/002609以及例如wo04/068820，wo06/030220，wo06/003388和domantisltd.的其他公开专利申请。结构域抗体基本上对应于非驼类哺乳动物，尤其是人4链抗体的vh或vl结构域。为了以单抗原结合结构域(即，不与vl或vh结构域配对)结合表位，需要对这种抗原结合特性进行特异性选择，例如，通过使用人单vh或vl结构域序列的文库。像vhh一样，结构域抗体具有约13至约16kda的分子量，并且如果衍生自完整的人序列，则不需要人源化用于例如在人类中的治疗用途。还应注意，单可变结构域可衍生自某些鲨鱼物种(例如，所谓的“ignar结构域”，参见例如wo05/18629)。免疫球蛋白单一可变结构域如结构域抗体和纳米抗体(包括vhh结构域和人源化vhh结构域)，代表在其产生时的体内成熟大分子，但是可以通过在一个或多个cdr的氨基酸序列中引入一个或多个改变，进一步经历亲和力成熟，所述改变导致如与相应的亲本分子相比，所得的免疫球蛋白单一可变结构域对其相应抗原的亲和力改善。可以通过本领域已知的方法，例如，如marks等人(biotechnology10:779-783,1992)、barbas等人(proc.nat.acad.sci,usa91:3809-3813,1994)、shier等人(gene169:147-155,1995)、yelton等人(immunol.155:1994-2004,1995)、jackson等人(j.immunol.154:3310-9,1995)、hawkins等人(j.moi.biol.226:889896,1992)、johnson和hawkins(affinitymaturationofantibodiesusingphagedisplay,oxforduniversitypress,1996)所描述的方法，制备本发明的亲和力成熟的免疫球蛋白单一可变结构域分子。从免疫球蛋白单一可变结构域如结构域抗体或纳米抗体开始，设计/选择和/或制备多肽的过程，本文中也称作“格式化”所述免疫球蛋白单一可变结构域；并且使其成为某多肽之部分的免疫球蛋白单一可变结构域称为“被格式化”或“处于所述多肽的格式”。基于本文的公开内容，技术人员将显而易见其中免疫球蛋白单一可变结构域可以格式化的方式的实例和这类格式(例如避免糖基化)的实例。免疫球蛋白单一可变结构域如结构域抗体和纳米抗体(包括vhh结构域)可以经受人源化，即增加与最近缘的人类种系序列的序列同一性程度。特别地，人源化免疫球蛋白单一可变结构域，如纳米抗体(包含vhh结构域)可以是这样的免疫球蛋白单一可变结构域，它们如先前段中总体上所定义那样，但是其中存在至少一个是和/或对应于(如本文限定的)人源化置换的氨基酸残基(和尤其，至少一个框架残基)。可以通过将天然存在的vhh序列的框架区的序列与一个或多个密切相关的人vh序列的相应框架序列比较，确定潜在有用的人源化置换，此后，如此确定的一个或多个潜在有用的人源化置换(或其组合)可以被引入所述vhh序列中(以本身已知的任何方式，如本文进一步描述)并且可以对所得的人源化vhh序列测试对靶的亲和力、稳定性、表达难易度和水平和/或其他所需特性。以这种方式，借助有限程度的试验和误差，可以由技术人员确定其他合适的人源化置换(或合适的其组合)。另外，基于前文所描述，免疫球蛋白单一可变结构域，如纳米抗体(包含vhh结构域)的(框架区)可以是部分人源化的全人源化的。应当注意，从最广泛的意义上说，本发明的免疫球蛋白单可变结构域以及抗原结合嵌合蛋白不限于特定的生物来源或特定的制备方法。例如，免疫球蛋白单可变结构域，特别是本发明的抗原结合嵌合蛋白，通常可以通过以下方法获得：(1)通过分离天然存在的重链抗体的vhh结构域，并进一步对该序列进行工程化以获得抗原结合嵌合蛋白；(2)通过以融合所述抗原结合嵌合蛋白的所述支架蛋白的形式表达编码天然存在的vhh结构域的核苷酸序列；(3)通过天然存在的vhh结构域和/或支架蛋白的“人源化”或通过表达编码这种人源化的vhh结构域和/或支架蛋白和/或抗原结合嵌合蛋白的核酸；(4)通过天然存在的vhh结构域的“突变”以减少与预先存在的抗体的结合，或通过对支架蛋白融合位点进行细化的工程化，以获得本发明的抗原结合嵌合蛋白，其与天然vhh相比，与预先存在的抗体的结合减少；(5)通过“骆驼化”来自任何动物物种，特别是来自哺乳动物物种，如来自人类的天然存在的vh结构域，随后与所述支架蛋白融合；或(6)通过使用合成或半合成技术制备本身已知的蛋白质、多肽或其他氨基酸序列。可以在人源化过程中引入合适的突变，特别是取代，以产生与现有抗体的结合减少的多肽(例如参见wo2012/175741和wo2015/173325)，例如在以下的至少一个位置：11、13、14、15、40、41、42、82、82a、82b、83、84、85、87、88、89、103或108。或者，对预先存在的抗体结合敏感的位置可以通过设计与支架蛋白融合而在空间上屏蔽，从而干扰与抗原结合嵌合蛋白的结合。替代免疫球蛋白结构域，在许多蛋白质中还发现了一个ig超家族或“ig样结构域”，实际上它们构成的结构域在序列和结构上分别与免疫球蛋白结构域和ig折叠非常相似，但它们被称为ig-样结构域，以将它们区别于免疫球蛋白抗体自身的结构域。ig折叠不是专门用于抗原识别的，发现它对于介导相互作用特别有用，并被广泛使用。可以根据序列模式将免疫球蛋白样结构域分类为v、c1、c2和i。例如，monobodies包含免疫球蛋白样结构域。如本文所用，术语“可检测标记物”、“标记”或“标签”指允许检测、可视化和/或分离、纯化和/或固定已分离或纯化的本文所述(多)肽的可检测标记物或标签并且意在包括本领域已知用于这些目的的任何标记物/标签。特别优选亲和标签，如壳多糖结合蛋白(cbp)、麦芽糖结合蛋白(mbp)、谷胱甘肽-s-转移酶(gst)、多(his)(例如，6xhis或his6)、链霉亲和素-标签链霉亲和素-标签和twin-链霉亲和素-标签增溶标签，如硫氧还蛋白(trx)、多(nanp)和sumo；色谱标签，如flag标签；表位标签，如v5标签、myc标签和ha标签；荧光标记物或标签(即，荧光物质(fluorochrome)/萤光团)，如荧光蛋白(例如，gfp、yfp、rfp等)和荧光染料(例如，fitc、tritc、香豆素和花青)；发光标记物或标签，如萤光素酶；和(其他)酶标记物(例如，过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、尿素酶或葡萄糖氧化酶)。还包括前述标记物或标签中任意者的组合。抗原结合嵌合蛋白可以例如融合或缀合于半衰期延长模块，或可以本身作为半衰期延长模块发挥作用。这类模块是本领域技术人员已知的并且例如包括白蛋白、白蛋白结合性结构域、免疫球蛋白fc区/结构域、免疫球蛋白结合性结构域、fcrn结合基序和聚合物。特别优选的聚合物包括聚乙二醇(peg)、羟乙基淀粉(hes)、透明质酸、聚唾液酸和peg-模拟物肽序列。阻止已分离(多)肽聚集的修饰也是技术人员已知的并且例如包括将一个或多个疏水性氨基酸、优选地表面暴露的疏水性氨基酸置换为一个或多个亲水性氨基酸。在一个实施方案中，分离的(多)肽或其免疫原性变体或前述任一者的免疫原性片段包含亲水性氨基酸对多达10、9、8、7、6、5、4、3或2、优选地5、4、3或2个疏水性氨基酸、优选地表面暴露的疏水性氨基酸的置换。优选地，分离的(多)肽的其他特性，例如，其免疫原性，抗原结合功能性，不受这类置换损害。对于本发明的目的，“患者”或“受试者”是指任何生物体，如脊椎动物，特别是任何哺乳动物，包括人和另一种哺乳动物，例如如啮齿动物、兔子、牛、绵羊、马、狗、猫、lama、猪或非人类灵长类动物(例如猴子)这样的动物。啮齿动物可以是小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或毛丝鼠。在一个实施方案中，受试者是人、大鼠或非人灵长类动物。优选，受试者是人。在一个实施方案中，受试者是患有或怀疑患有疾病或病症的受试者，在本文中也称为“患者”。如本文所用的，术语“预防”可以指停止/抑制疾病或病症的发作(例如，通过预防性治疗)。它也可以指与疾病或病症有关的发作延迟、症状频率降低或症状严重性降低(例如，通过预防性治疗)。术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”或“治疗(treat)”可以互换使用，并且通过减缓、干扰、阻止、控制、停止、减轻或逆转体征、症状、病症、病况或疾病的进展或严重程度的治疗性干预来定义，但不一定涉及完全消除所有与疾病相关的体征、症状、病况或病症。详述本文提出了用于设计包含刚性融合的抗原结合结构域的嵌合蛋白的新概念。新的抗原结合嵌合体源于抗原结合结构域和支架蛋白之间的融合体的产生，其中支架蛋白干扰了抗原结合蛋白的拓扑结构，令人惊讶的是它仍然以其典型的折叠出现并且与非融合抗原结合结构域相比，具有以相似的方式特异性地结合抗原或靶蛋白的功能。该概念是围绕特定实例构建的，这些实例应用了待与支架蛋白融合的免疫球蛋白或免疫球蛋白样结构域的独特特性，从而创建了新的独特抗原结合嵌合体，证明了更刚性的非柔性连接。多肽成分的经典连接，尽管通常在其天然状态下未连接，但是通过直接连接它们各自的氨基(n-)和羧基(c-)末端或通过肽键连接来进行，以形成单个连续多肽。这些融合体通常是通过柔性接头制得的，或至少以柔性方式连接，这意味着融合配偶体彼此之间的位置或构象不稳定。如图1所示，通过n-和c-末端连接蛋白质，进行简单的线性连接，融合很容易，但可能不稳定，易于降解，并且因此在某些情况下不适用于治疗。另一方面，本文所述的刚性嵌合/融合蛋白在两个或多个蛋白的一级拓扑结构内具有一个或多个融合点或连接，具有至少一个非柔性融合点(图1)。本发明固有地包含抗原结合嵌合蛋白，其中通过形成几个融合体来阻止与其融合配偶体相对的一种蛋白质的旋转或弯曲。通过在同一嵌合体中存在数个融合体，获得了本发明的新嵌合体的提高的刚性，并且是完美地设计融合位点的结果，以允许仍保留其抗原结合结构域折叠及其结合抗原靶标的功能的融合体。蛋白质的刚度实际上是该蛋白质(在这种情况下为新的嵌合体)(三级)结构所固有的。已经显示可以通过改变已知蛋白质折叠的拓扑结构来获得增加的刚性(king等，2015)。因此，在本发明的抗原结合嵌合蛋白中产生的融合体的刚度提供了足够强的刚度以“定向”或“固定”靶标，尽管大多数刚度仍将低于靶标或抗原自身的刚度。然而，本发明的刚性抗原结合嵌合蛋白仍保持其抗原结合功能的事实是令人惊讶的观察，因为一级拓扑的干扰可能导致结构域或蛋白折叠的改变，从而影响三级拓扑结构和抗原结合。本文已经证明，这种一级拓扑结构的干扰不影响抗原结合，导致在涉及抗体及其靶蛋白的领域中开辟了新途径。本发明涉及提供独特的下一代融合技术和高亲和力和/或构象选择性抗原结合潜力的新组合，以允许蛋白质的非共价靶向。根据用于产生嵌合体的支架蛋白的类型，这种新类型的抗原结合嵌合蛋白有助于多种有价值的应用。优点是众多的，可直接用于结构生物学中，以促进冷冻电镜和x射线晶体学研究，例如，通过解决颗粒大小、优选方向和受限的片段排列中反复的限制问题，这些问题阻止了获得较小蛋白质的高分辨率结构。通过使用这种下一代融合技术，可以预见结构生物学的飞跃，因为现在可以使用刚性伴侣蛋白工具，并且在全面实施时也可以使用这些工具来开发改良的、更牢固的治疗和诊断分子，如通过基于结构的药物设计和基于结构的新化合物筛选。实际上，用于抗原或靶标的构象选择性识别时，这些工具也适用于将靶标稳定在功能性构象的结合模型中，所述功能性构象如活性构象，更具体地说是激动剂、部分激动剂或偏向激动剂构象。此外，已知几种融合蛋白药物的实例，包括经fda批准的(肿瘤坏死因子/fc-igg1)和(血小板生成素/fc-igg1)。考虑到单结构域抗体的治疗发展，与已有抗体的结合是众所周知的障碍，为此，本发明的抗原结合嵌合体可以提供独特的解决方法。此外，本发明的抗原结合嵌合蛋白在生物学以及在作物保护工业中的保护剂领域中提供了新的解决方法。针对害虫和病原体必需分子的骆驼结合结构域的研发证明了组合的高度特异性的作用方式，同时将对野生生物、蜜蜂、种植者和消费者的影响风险降至最低。从本发明的抗原结合嵌合体开发的这种保护剂提供了额外的优点，同时保留了其大规模生产的成本有效方式。在基于所述的nb的抗原结合结构域中发现了本发明的抗原结合嵌合蛋白的进一步应用，所述nb特异性地稳定了可药物化的信号构象，从而能够筛选途径选择性激动剂。随着生物技术中此类技术的迅速发展，可以预见的是，本发明将影响新的蛋白质治疗剂的产生并提高当前蛋白质药物的性能。在第一个方面中，本发明涉及包含与支架蛋白融合的抗原结合结构域的抗原结合嵌合蛋白，其中所述支架蛋白连接所述抗原结合结构域，使得通过在所述抗原结合结构域折叠中可及的至少一个或多个氨基酸位点的融合，其干扰所述抗原结合结构域的拓扑结构。所述抗原结合嵌合蛋白进一步的特征在于与未与所述支架蛋白融合的抗原结合结构域、其天然或野生型形式相比，以相似方式保留了其抗原结合功能。因此，在一个实施方案中，所述抗原结合嵌合蛋白是构象选择性结合结构域。一个实施方案提供了一种抗原结合嵌合蛋白，其中抗原结合结构域与支架蛋白融合，其方式使得支架蛋白“干扰”抗原结合结构域的拓扑结构。通常，蛋白质的“拓扑结构”是指规则的二级结构在三维空间中相对于彼此的定向。蛋白质折叠主要由多肽链拓扑结构决定(orengo等，1994)。因此，在最基本的水平上，“一级拓扑结构”被定义为二级结构元件(sse)的序列，它负责蛋白质折叠识别基序，进而导致二级和三级蛋白质/结构域折叠。因此，就蛋白质结构而言，真实或一级拓扑结构是sse的序列，即，如果设想能够握住蛋白质链的n-和c-末端并将其笔直拉出，那么该拓扑结构就不会改变，无论蛋白质折叠。然后将蛋白质折叠描述为三级拓扑结构，类似于蛋白质的一级和三级结构(另请参见martin，2000)。因此，通过引入支架蛋白融合，本发明的抗原结合嵌合蛋白的抗原结合结构域在其一级拓扑结构中被干扰，但是出乎意料的是，所述抗原结合结构域保留了其三级结构，从而允许保留其功能性抗原结合能力。如本文所述的，“支架蛋白”是指具有允许与另一种蛋白(特别是抗原结合结构域)融合的结构的任何类型的蛋白。这种“支架”、“连接”或“融合配偶体”蛋白优选在其三级结构中具有至少一个暴露区域，以提供至少一个可及位点，以切割作为用于抗原结合结构域的融合点。支架多肽用于与抗原结合结构域组装，从而形成呈驻留构型(dockedconfiguration)的抗原结合嵌合蛋白，以增加质量、提供对称性和/或提供标记和/或添加另外的抗原结合位点，和/或增加半衰期，和/或降低免疫原性，和/或改善或增加抗原结合结构域的功能性。因此，根据所使用的支架蛋白的类型，可以预见到所得抗原结合嵌合蛋白的不同目的。支架蛋白的类型和性质无关紧要，因为它可以是任何蛋白质，并且根据其结构、大小、功能或存在，与所述抗原结合结构域融合的支架蛋白，如在本发明的抗原结合嵌合蛋白中，将用于不同应用领域中。支架蛋白的结构将影响最终的嵌合结构，因此本领域技术人员应在支架蛋白上实施已知的结构信息，并在选择支架时考虑合理的预期。在本申请的实施例中提供了支架蛋白的实例，并且非限制性的蛋白质是酶、膜蛋白、受体、适体蛋白、伴侣蛋白、转录因子、核蛋白、抗原结合蛋白自身，如尤其是纳米抗体，可以用作支架蛋白以产生本发明的抗原结合嵌合蛋白。在优选的实施方案中，所述支架蛋白的3d结构是已知的或可以由技术人员预测，因此与所述抗原结合结构域融合的可及位点可以由所述技术人员来确定。新的嵌合蛋白以独特的方式融合，以避免连接是嵌合蛋白结构内的柔性、松散、弱连接/区域。连接或融合两个多肽的方便方法是通过从重组核酸分子作为融合蛋白来表达它们，该重组核酸分子包括以经典的已知方式与编码第二多肽的第二多核苷酸可操作地连接的编码第一多肽的第一多核苷酸。然而，在本发明的重组核酸分子中，所述支架干扰抗原结合结构域的拓扑结构也反映在表达所述抗原结合嵌合蛋白的基因融合体的设计中。因此，在一个实施方案中，抗原结合嵌合蛋白由嵌合基因编码，所述嵌合基因通过将编码抗原结合结构域的基因的一部分与编码支架蛋白的基因的一部分重组而形成，其中所述编码的支架蛋白通过至少两个或更多个直接融合或由编码的肽接头形成的融合在所述结构域的一个或多个可及位点干扰了编码的抗原结合结构域的一级拓扑。因此，将编码待融合多肽的多核苷酸片段化和重组，以这样的方式提供抗原结合嵌合蛋白，该嵌合蛋白在所述蛋白质之间提供刚性的非柔性连接、结合或融合。通过将支架蛋白与抗原结合结构域融合制得新的嵌合体，以这样的方式使得抗原结合结构域的一级拓扑结构被干扰，这意味着抗原结合结构域的氨基酸序列在可及位点被干扰并与支架蛋白的可及氨基酸连接，因此该序列也可能被干扰。连接在分子内进行，换句话说，在氨基酸序列内内部进行(参见实施例和附图)。因此，本发明的重组融合不仅产生了在n-或c-末端融合的嵌合体，而且包括至少一个内部融合位点，其中这些位点直接融合或通过接头肽融合。将环状排列的支架用于产生抗原结合的嵌合蛋白的情况中，通过连接n-和c-末端，然后在支架蛋白序列内的另一个位点(对应于其三级结构中的可及位点)切割或分离氨基酸序列，与抗原结合结构域部分的氨基酸序列融合，可以改变所述支架蛋白的氨基酸序列。用于获得环状排列的所述n-和c-末端连接可以通过直接融合、接头肽，或者甚至通过n-和c-末端附近区域的短缺失，然后通过末端的肽键来实现。术语“可及位点”、“融合位点”或“融合点”或“连接位点”或“暴露位点”在本文中可互换使用，并且均指结构上可及的蛋白质序列的氨基酸位点，优选位于蛋白质表面的位置或暴露于表面。本领域技术人员将能够确定那些位点。抗原结合结构域的抗原结合位点通常涉及暴露的区域，如，例如ig结构域的cdr。然而，将用于抗原结合结构域融合支架蛋白的那些位点干扰可能导致抗原结合能力的丢失，这不适用于本发明的抗原结合嵌合蛋白，并且因此在本文不打算用作可及融合位点。因此，本文所述的“可及位点”和“暴露区域”为“环”或“β转角”是指不是抗原结合位点或区域的那些位点和区域，因此不是cdr。在大多数情况下，蛋白质的n-末端或c-末端也是蛋白质3d结构的“松散”末端，因此从表面可及。在使用抗原结合结构域中的至少一个其他可及位点进行融合的条件下，这些可被认为是本发明的嵌合体中的可及位点，其导致在该可及位点的干扰/插入，从而破坏了拓扑结构，因为这后一种可及位点融合将为新嵌合体提供刚性。因此，可及位点因此可以包括蛋白质的氨基-和/或羧基-末端位点，但嵌合体不能仅基于由n-或c-末端组成的可及位点的融合。将抗原结合结构域的至少一个或多个位点用于与支架蛋白融合，从而导致已知常规结构域折叠的拓扑结构的干扰。因此，在一个实施方案中，如果至少一个可及位点是所述结构域的n-末端和/或c-末端位点，和/或不包括所述结构域的n-或c-末端位点，则至少一个可及位点不是所述结构域的n-末端和/或c-末端位点。在特定的实施方案中，至少一个位点不是所述结构域的n-或c-末端氨基酸。在另一个实施方案中，至少一个以上的位点用于与支架蛋白融合时，可及位点可以是抗原结合结构域的n-或c-末端位点。支架蛋白也通过从其三级结构可见的可及位点融合，为此，在一个实施方案中，所述至少一个位点不是支架蛋白的n-或c-末端，而在备选实施方案中，至少一个位点是所述支架的n-或c-末端。在一些实施方案中，抗原结合嵌合体包含在所述抗原结合结构域的暴露区域中的干扰处融合的所述支架蛋白的n-末端片段和与所述抗原结合结构域的c-末端融合的所述支架蛋白的c-末端片段。在本发明的一些实施方案中，融合可以是直接融合，或通过接头肽形成的融合，所述融合位点被完美地设计，以获得刚性的、非柔性的融合蛋白。除了选择的可及位点的位置，接头肽的长度和类型也有助于所得嵌合蛋白的刚性。在本发明的内容中，将构成抗原结合嵌合蛋白的多肽彼此通过经由肽键的连接直接融合，或间接融合，由此通过经由短肽接头的连接间接偶联装配两个多肽。优选的“接头分子”、“接头”或“短多肽接头”是具有最大十个氨基酸的长度的肽，更可能是四个氨基酸，通常仅为三个氨基酸长度，但优选仅两个或甚至更优选仅单个氨基酸，以给可及位点的融合连接提供所需的刚性。合适的接头序列的非限制性实例在实施例部分中描述，其可以是随机的，并且其中已经成功地选择了接头以保持结构域之间的固定距离，以及保持融合配偶体的独立功能(例如，抗原结合)。在涉及使用刚性接头的实施方案中，通常已知这些通过采用α-螺旋结构或通过包含多个脯氨酸残基而呈现出独特的构象。在许多情况下，它们比也可能是合适的柔性接头更有效地分离功能结构域，优选短的仅有1-4个氨基酸的长度。在一个实施方案中，抗原结合结构域的可及位点在结构域折叠的暴露区域中。所述暴露区域被鉴定为较少固定的氨基酸段，其大部分位于蛋白质的表面以及结构的边缘。优选，暴露区域以蛋白质结构的环或β-转角存在。在特定的实施方案中，所述抗原结合嵌合蛋白包含具有至少7条反平行β链(主要以β折叠存在)和至少3个β转角的抗原结合结构域，后者也被认为是暴露区域。在一个实施方案中，所述具有至少7条反平行β链和至少3个β-转角的抗原结合结构域包含免疫球蛋白样结构域，如特别是monobody的抗原结合结构域。monobody是使用iii型纤连蛋白结构域(fn3)作为分子支架构建的合成结合蛋白。天然fn3支架由94个氨基酸组成，并且具有约10kda的分子量，与抗体的单个可变结构域的大小相当。它们基于人纤连蛋白的结构，更具体地基于其第十个胞外iii型结构域。该结构域具有类似于抗体可变结构域的结构，每侧有七条β链和三个裸露的环。在另一个特定的实施方案中，所述抗原结合嵌合蛋白包含为免疫球蛋白(ig)结构域的抗原结合结构域。免疫球蛋白(ig)结构域是一种蛋白质结构域，由排列在两个β折叠中的7-9条反平行β链的2层夹层组成，β折叠具有greek关键拓扑结构，由约125个氨基酸组成。免疫球蛋白的可变(v)和恒定(c)亚基在形成双层的β链的数量和规则性上有所不同：c结构域由7条β链组成，排列成使4条链形成一个β折叠，而3条链形成第二个折叠，而v结构域包含9条β链，而不是7条。v结构域中的两条附加链(插入一个β折叠的边缘)在功能上很重要，因为它们定义了直接参与抗原识别位点形成的第二个超变区。通过干扰抗原结合结构域的拓扑结构以获得本发明的抗原结合嵌合蛋白，令人惊讶地，在所得嵌合蛋白中维持了免疫球蛋白或免疫球蛋白样折叠，以及其结合靶蛋白或抗原的功能。关于其中融合支架蛋白的抗原结合结构域或含ig结构域的蛋白，抗原或抗原结合或ig结构域的靶标的性质可以是任何种类的。因此靶标的性质与本发明无关，并且分别与抗原结合位点或抗原结合结构域或ig或ig样结构域的cdr特异性结合的任何表位可以被认为是有效的靶蛋白。作为非限制性实例，靶标可以是单体蛋白质、另一种大分子结构、多聚体、蛋白质复合物或瞬时蛋白质-蛋白质相互作用。靶标也可以具有任何功能，例如但不限于作为酶、膜蛋白(如gpcr)、离子通道，还有核蛋白和其他受体蛋白，其中可以是所述抗原结合结构域的靶标。或者，靶标的来源可以是任何来源，例如但不限于人类、哺乳动物或动物的起源，而且还包括细菌、病毒、昆虫等的起源。在一个实施方案中，抗原结合或ig/ig样结构域的抗原不是与所述抗原结合或ig/ig样结构域融合来形成抗原结合嵌合蛋白的支架蛋白。更优选，使用支架蛋白来融合或连接如本发明所述的抗原结合结构域或ig结构域时，新的抗原结合嵌合蛋白应当没有特异性地结合以其单体、天然或融合形式存在的支架蛋白。或者，本文公开了抗原结合嵌合蛋白的组成，其包含如本文所述的第一和第二抗原结合嵌合蛋白，其中所述第二抗原结合嵌合蛋白的抗原结合结构域特异性地结合第一抗原结合嵌合蛋白的支架蛋白。为了避免抗原结合嵌合蛋白结合其自身支架的聚集或链反应，所述第二抗原结合嵌合蛋白的支架不同于所述第一抗原结合嵌合蛋白的支架蛋白。“不同”对于本发明的目的在本文中表示第二抗原结合嵌合蛋白的支架蛋白的氨基酸突变、缺失、插入或取代或修饰导致第二抗原结合嵌合蛋白的抗原结合结构域没有与第二抗原结合嵌合蛋白的所述支架蛋白部分结合。另一个实施方案涉及在与其抗原或靶蛋白结合的复合物中的抗原结合嵌合蛋白的所述组成。在备选实施方案中，抗原结合嵌合蛋白描述为刚性融合蛋白，其包含i)免疫球蛋白或ig样结构域保守的n-末端氨基酸序列，ii)支架蛋白，和iii)缺乏所述i)的保守n-末端氨基酸序列的免疫球蛋白结构域序列，其中i)和iii)连结ii)的所述支架蛋白。在优选实施方案中，所述刚性融合蛋白包含保守n-末端氨基酸序列，其是fr1区的保守n-末端结构域，包含具有seqidno:1中的残基的保守共有序列，或其同源序列，具有11至15个残基的长度(例如，在seqidno:1的残基11至15之间的n-末端部分的末端，即，接近第一个β-转角)。在另一个实施方案中，抗原结合嵌合蛋白的抗原结合结构域包含螺旋二级结构。特别地，所述抗原结合结构域可以是alphabody，其是作为抗体模拟物的抗原结合结构域的一部分，或者可以是darpin，其是具有与免疫球蛋白非常不同的结构的抗体模拟物，因为它含有通过刚性螺旋接头的设计也可以是刚性的设计的α螺旋，其因此适用于本文所述的融合体中，用于产生抗原结合嵌合蛋白。然而，抗体模拟物的抗原结合特性是合成形成的或预测的结合位点，其不是天然存在的，因此与例如单结构域抗体的体内成熟的抗原结合位点相比可能不太适用。此外，关于干扰拓扑结构，与包括β-转角的融合体相比，使用所述螺旋结构或卷曲螺旋来产生刚性融合体可能更为复杂。ig结构域的“暴露区域”的最直接识别是暴露的环，优选β-转角，其是位于β折叠夹层3d结构边缘的暴露环。更多的实施方案暗示所述抗原结合结构域的暴露区域包含如imgt定义的β-转角(lefranc，2014)，其中所述支架蛋白插入或融合至免疫球蛋白(可变)结构域的所述暴露区域，其为：a.连接所述抗原结合结构域的β链a和b的第一个β转角；或b.连接所述抗原结合结构域的β链c和c′的β转角；或c.连接所述抗原结合结构域的β链c’和d的β转角；或d.连接所述抗原结合结构域的β链d和e的β转角；或e.连接所述抗原结合结构域的β链e和f的β-转角。在优选实施方案中，可及位点在abβ-转角的暴露区域中，其连接ig结构域的a和bβ-链。或者，可及位点位于由cc'β-转角定义的暴露区域中，其连接ig结构域的c和c'β链。另一个实施方案包括在c”dβ转角或efβ转角中具有可及位点的暴露区域。实际上，这些分别是连接β链a和b、c和c'、c”和d、或e和f的表面环，它们构成了典型夹层的β-折叠以提供免疫球蛋白折叠。最优选，可及位点在暴露区域、环或β-转角中，使得ig结构域的cdr保持其结合靶蛋白的表位的能力。cdr本身也可以视为暴露区域，因此从理论上讲，它们提供了可及位点。然而，靶蛋白仍然可以结合时，抗原结合嵌合蛋白将仅是功能性的，因此是抗原结合的，而cdr中的氨基酸用作用于融合的可及位点时则不可能。在另一个实施方案中，抗原结合结构域包含免疫球蛋白样结构域，如更特别地，对于monobody，其中将支架蛋白插入连接所述ig-样结构域的β-链a和b的第一个β-转角中，与以上针对ig结构域提供的选项类似；或，在连接所述ig-样结构域的β-链c和d的β-转角中；或，在连接所述ig-样结构域的β-链e和f的β-转角中，更特别地，对于monobodies，如根据koide等(2012)注释的结构定义的。基于vhhig-折叠注释采用所述命名法。在另一个实施方案中，支架蛋白具有环状排列。在优选实施方案中，支架蛋白的所述环状排列存在于支架蛋白的n-和/或c-末端，或最优选在支架蛋白的n-和c-末端之间。另一个实施方案提供了包含至少2条反平行β-链的支架蛋白。在一个实施方案中，通过在对应于其结构的暴露区域的序列中裂解的可及位点处与环状排列的支架蛋白融合(其中所述暴露的或可及位点不是n-或c-末端)，通过在对应于abβ转角的序列中裂解的可及位点处的ig或抗原结合结构域一级拓扑结构的干扰，将获得了连接免疫球蛋白或抗原结合结构域与支架的融合蛋白(具有两个肽键或两个短接头)。因此，在特定的实施方案中，其中支架蛋白的环状排列在n-和c-末端(如图2中)，支架蛋白序列可以与作为整体的抗原结合蛋白片段(如图8中)重组融合。在特定实施方案中，通过位于抗原结合或ig结构域内的，优选在abβ转角的可及位点附近、β链a的末端和β链g的末端的半胱氨酸残基形成的增强二硫桥的额外产生，提高了所述嵌合体的刚性。在一个实施方案中，抗原结合结构域和支架进一步通过二硫键连接，以提高抗原结合嵌合蛋白的刚性。最优选，那些位点是aβ链的最后一个氨基酸(例如，在seqidno：1的残基11-15附近)，其中所述残基被半胱氨酸取代，并且ig结构域的最后一个氨基酸也被突变成半胱氨酸(见图10)在另一个实施方案中，通过在位于其序列内的结构的暴露区域中的裂解的可及位点处(不是n-或c-末端)与环状排列的支架蛋白融合，通过在其cc’β转角中的裂解的可及位点处的ig结构域拓扑结构的干扰，获得了连接免疫球蛋白与支架的所述融合蛋白(具有两个肽键或两个短接头)。因此，在特定的实施方案中，其中通过连接n-和c-末端形成了支架蛋白的环状排列(如图22中)，支架蛋白序列可以与作为整体的ig蛋白片段重组融合(如图8中)。在另一个实施方案中，本文中所述的支架蛋白是专性二聚体或多聚体，如十二聚体，其可以是同型-或杂-寡聚体，和/或衣壳蛋白，或病毒样颗粒蛋白，或其片段。衣壳蛋白，或病毒样颗粒蛋白形成多聚体，并且在对称结构中自我装配，导致融合的ig结构域在所述对称结构的表面上展示。在另一个实施方案中，通过在其n-末端氨基酸处与支架蛋白融合，在其abβ转角中的裂解的可及位点处的抗原结合或ig/ig-样结构域拓扑结构的干扰，获得了连接免疫球蛋白与支架的融合体或嵌合蛋白(具有三个肽键或三个短接头)。所述支架蛋白还需要其序列内结构上的可及位点，其被裂解以偶联回abβ转角位点，以允许与ig结构域的β-链b融合。提供ig结构域的第二个可及位点，例如，但不限于，由其c-末端氨基酸提供，其进一步与支架蛋白的剩余部分融合(参见图1)。因此，在特定的实施方案中，其中支架蛋白在抗原结合或ig/ig-样结构域的2个不同可及位点融合，支架蛋白序列需要与作为2个片段的抗原结合或ig结构域蛋白片段重组融合。在特定的实施方案中，所述使用三个肽键或短接头连接免疫球蛋白与支架的嵌合融合蛋白，通过位于ig结构域内的半胱氨酸残基形成的加强二硫桥的额外产生，其刚性得到提高。在特定的实施方案中，所述支架蛋白是专性二聚体或多聚体，或可以是衣壳蛋白或病毒样颗粒，或其片段，由此形成对称。在特定的实施方案中，连接免疫球蛋白与支架的融合蛋白(具有三个肽键或短接头)包含形成杂二聚体的两个支架蛋白。通过在位于序列内的结构暴露区域中的分裂的可及位点处(不是n-或c-末端)与第一个环状排列的支架蛋白融合，其随后在其c-末端与同一可及位点融合，将β-链b连接回ig结构域中，通过在其abβ转角中分裂的可及位点处的ig结构域拓扑结构的干扰，获得了所述融合蛋白。通过其c-末端氨基酸提供ig结构域的第二个可及位点，其最后与第二个支架蛋白的n-末端融合，其与第一个支架蛋白二聚化，导致提高的刚性。因此，在特定的实施方案中，其中第一个支架蛋白的环状排列在n-和c-末端，第一个支架蛋白的环状排列的序列可以作为整体重组融合，在ig序列的n-末端和c-末端部分之间插入了ig蛋白片段(在abβ转角内切割)，并且第二个支架蛋白与ig结构域序列的c-末端在n-端融合。因此，通过所述多聚支架的每个单体，多聚支架蛋白在其可及位点与ig结构域连接或融合。在特定实施方案中，连接抗原结合结构域与支架的融合蛋白的支架蛋白(具有三个肽键或短接头)包含第二个抗原结合结构域。通过在其n-末端氨基酸与包含(第二个)抗原结合结构域的支架蛋白融合，通过在其abβ转角中的裂解的可及位点处干扰(第一个)抗原结合结构域拓扑结构，获得了所述融合蛋白。在特定的实施方案中，所述包含(第二个)抗原结合结构域的支架蛋白包含ig结构域，并且在其序列内提供结构上可及的位点，尤其是接近β-链g的c-末端，其被裂解以偶联回abβ转角位点，以允许与(第一个)抗原结合结构域的β-链b融合。随后通过其c-末端氨基酸提供(第一个)抗原结合结构域的第二个可及位点，其最终与包含(第二个)抗原结合ig结构域的支架蛋白的剩余部分融合(参见图17)。因此，在这个特定的实施方案中，包含(第二个)抗原结合结构域的支架蛋白序列需要与作为2个片段的(第一个)抗原结合蛋白片段重组融合。如这个实施方案中所述的彼此融合的两个抗原结合结构域在一个特定的实施方案中公开为两个相同的抗原结合结构域，或作为结合同一靶蛋白的不同表位的不同抗原结合结构域，或甚至作为靶向不同蛋白的2个抗原结合结构域。然而，通过是ig结构域的抗原结合蛋白的cdr结合的表位应当不存在于作为所得抗原结合嵌合体的部分的其他ig结构域中，或应当不存在于新形成的抗原结合嵌合体自身上。在特定的实施方案中，所述ig结构域是两个纳米抗体，并且在更特定的实施方案中，是2个相同的nb，或结合同一靶蛋白的不同表位的不同nb，或甚至是靶向不同蛋白的2个nb。然而，由nb结合的表位应当不存在于是所得抗原结合嵌合体一部分的其他nb中，或应当不存在于新形成的抗原结合嵌合体自身上。在某些实施方案中，本发明的支架蛋白是单体蛋白。在其他实施方案中，支架蛋白是提供对称性的蛋白质，如多聚支架蛋白，或其是衣壳蛋白或自我装配成病毒样颗粒的蛋白质的支架蛋白。多聚支架蛋白通过寡聚化提供对称性，其可以是杂寡聚或同型寡聚，并且可以是专性的，或持久性的，也可以是瞬时的。所获得的对称性可以是任何类型的对称，如，例如，但不限于，环状、立方、二面体、六面体、八面体、二十面体，…。特别地，术语“二十面体”是指源自二十面体的一种对称类型，表示具有20个面的多面体几何形式。术语“病毒样颗粒”(vlp)、“二十面体vlp蛋白”、“衣壳蛋白”或“形成二十面体vlp的蛋白”是指能够自组装成多聚体结构vlp的蛋白质，vlp源自病毒，但无感染性，并提供(二十面体)对称性。例如，细菌噬菌体的头部具有二十面体结构。此外，使用对其已经建立了用于产生病毒颗粒的反向遗传学系统的任何二十面体病毒，可以容易地展示包含全部或部分异源蛋白的嵌合表面蛋白。嵌合表面蛋白包含与异源抗原结合结构域融合的病毒表面或衣壳蛋白，如本发明所提供的。病毒衣壳蛋白可以通过接头序列或通过肽键融合以用作支架。在某些情况下，病毒衣壳蛋白的一部分缺失以更好地容纳接头和/或与其融合的抗原结合结构域。缺失是否影响病毒蛋白重新包被颗粒的能力可以通过在病毒颗粒存在下孵育重组表达的病毒蛋白并观察重新包被的病毒颗粒的形成来评估。本发明的再一个方面涉及新的抗原结合嵌合蛋白，其包含与支架蛋白融合的抗原结合结构域，其中所述支架蛋白干扰所述结构域的拓扑结构，并且其中支架蛋白的总质量或分子量至少为30kda，因此通过嵌合体与抗原结合结构域靶标的结合而增加质量将是显著的，并且足以允许在与所述嵌合体非共价结合时对靶标进行3维结构分析。在另一个实施方案中，支架蛋白的总质量或分子量为至少10、至少20、至少35、至少40、至少45、至少50或至少60kda。这种特定的大小或质量增加将影响图像中的信噪比降低。其次，该嵌合体将通过提供足够的特征来提供结构指导，以使用冷冻电镜和x射线晶体学对小的或难以结晶的蛋白质进行精确的图像比对，从而达到足够高的分辨率。本发明的另一个方面涉及一种新的包含与支架蛋白融合的抗原结合结构域的抗原结合嵌合蛋白，其中所述支架蛋白干扰了所述结构域的拓扑结构，其中支架蛋白进一步包含抗原结合结构域，在特定的实施方案中，所述支架蛋白包含ig结构域，其是vhh、纳米抗体或抗体自身。所述获得新抗原结合嵌合蛋白的融合因此形成了具有至少两个抗原结合位点的抗原结合嵌合蛋白，其中将抗原结合部分融合，以获得刚性的嵌合体，并且保留其结合其靶标的功能。所述至少两个抗原结合位点可以靶向一个靶标的相同表位或不同表位，由此提高亲和力和/或效率。或者，根据本发明的所述包含所述两个融合的抗原结合结构域的嵌合体的两个抗原结合位点可以结合不同的靶蛋白，这允许仅使用一个刚性嵌合体来靶向两个蛋白质。对于例如紧挨的和另外难以到达的靶标需要刚性结构时，嵌合体独特的特征提供了双特异性治疗用途的解决方法。本发明的范围内还包括抗原结合结构域和/或包含抗原结合结构域的支架蛋白，其中抗原结合结构域是“多价”形式并且由两个或更多个(单价)抗原结合结构域(如ig结构域)通过化学或通过重组dna技术键合在一起来形成。多价构建体的非限制性实例包括“二价”构建体、“三价”构建体、“四价”构建体等。多价构建体内包含的免疫球蛋白结构域可以是相同或不同的。特别地，本发明的免疫球蛋白结构域或构成本发明的支架蛋白的ig结构域随后为“多特异性”形式并且由连接两个或更多个免疫球蛋白结构域形成，其中至少一个具有不同的特异性。多特异性构建体的非限制性实例包括“双特异性”构建体、“三特异性”构建体、“四特异性”构建体等。为了进一步说明这，本发明的任何多价或多特异性(如本文定义的)免疫球蛋白结构域可以合适地针对同一抗原上的两个或更多个不同表位，例如，针对靶标的两个或更多个不同表位；或可以针对两个或更多个不同抗原，例如，针对靶标的表位和靶标的天然结合配偶体的表位。特别地，本发明的单价免疫球蛋白结构域使得其将以低于由本发明的多价或多特异性免疫球蛋白单可变结构域给予的亲和性的亲和性结合靶标。在特定的实施方案中，通过干扰ig结构域中的至少一个的拓扑结构，本发明这样的多价或多特异性ig结构域可以作为ig结构域和支架蛋白彼此融合。另外，本发明的多价或多特异性ig结构域可以以常规方式经由其n-和/或c-末端融合，并且进一步作为整体用于与另一个ig结构域和/或另一个支架融合，通过与其融合的ig结构域的干扰或通过多价或多特异性ig结构域自身的ig结构域的干扰来融合。另一个实施方案提供了非免疫球蛋白但为已知结合另一种类型的蛋白质的蛋白质的支架蛋白，并且因此也可以考虑用于治疗靶向。在备选方面中，本发明的抗原结合嵌合蛋白包含修饰的氨基酸。另一个实施方案描述了以修饰形式出现和/或包含(或融合)其他部分的支架蛋白。备选实施方案描述了以修饰形式出现和/或包含其他部分的抗原结合嵌合蛋白的抗原结合结构域。修饰的实例，以及可以修饰的本发明的蛋白质结构域内的氨基酸残基的实例(即，在蛋白质主链上但优选在侧链上)，可以用于引入此类修饰的方法和技术以及此类修饰的潜在作用和优势是本领域技术人员清楚的。例如，这样的修饰可能涉及(例如，通过共价连接或以另一种合适的方式)将一个或多个官能团、残基或部分引至结合剂之中或之上。这样的官能团和用于引入它们的技术的实例是本领域技术人员清楚的，并且通常可以包含本领域提及的所有官能团和技术以及本身已知用于修饰药物蛋白且特别是用于修饰抗体或抗体片段(包括scfv’s和单结构域抗体)的官能团和技术，对此例如参考remington'spharmaceuticalsciences，第16版，mackpublishingco.，easton，pa(1980)。这样的官能团可以例如直接连接(例如共价)支架蛋白，或任选经由合适的接头或间隔物连接，这也是本领域技术人员清楚的。在抗原结合嵌合蛋白具有潜在的治疗价值的情况中，最广泛使用的用于提高药物蛋白的半衰期和/或降低免疫原性的技术之一包括连接合适的药学上可接受的聚合物，如聚(乙二醇)(peg)或其衍生物(如甲氧基聚(乙二醇)或mpeg)。通常，可以使用任何合适形式的peg化，如本领域中用于抗体和抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和scfv’s)的peg化；例如参考chapman,nat.biotechnol.，54，531-545(2002)；veronese和harris，adv.drugdeliv.rev.54,453-456(2003)，harris和chess，nat.rev.drug.discov.,2(2003)和wo04060965。用于蛋白质peg化的各种试剂也是商业上可获得的，例如，从nektartherapeutics,usa获得。优选，使用定点peg化，特别是通过半胱氨酸残基(例如参见yang等，proteinengineering，16，10，761-770(2003))。例如，对于这个目的，可以将peg连接支架蛋白中天然存在的半胱氨酸残基，或可以将支架蛋白进行修饰，使得合适地引入一个或多个半胱氨酸残基，用于peg的连接，或可以将包含一个或多个用于peg连接的半胱氨酸残基的氨基酸序列与支架的n-和/或c-末端融合，全部使用本领域技术人员本身已知的蛋白质工程化技术。优选，对于本发明新的抗原结合嵌合蛋白的支架蛋白，使用具有高于5000分子量的peg，如高于10,000且低于200,000，如低于100,000；例如，在20,000-80,000范围中。另一种通常不太优选的修饰包括n-连接或o-连接的糖基化，通常作为共同翻译和/或翻译后修饰的一部分，这取决于用于表达本发明的抗原结合嵌合蛋白的宿主细胞。用于提高所述抗原结合嵌合蛋白的半衰期的另一种技术可以包括工程化至双功能构建体中(例如，一个针对靶标1的抗原结合结构域和一个存在于支架蛋白内的针对血清蛋白(如白蛋白)的抗原结合结构域)或工程化至抗原结合嵌合蛋白与肽(例如，针对血清蛋白(如白蛋白)的肽)的其他融合体中，通过支架蛋白或作为支架蛋白融合。本发明的另一个方面涉及新的包含与支架蛋白融合的抗原结合结构域的抗原结合嵌合蛋白，其中所述支架蛋白干扰了所述结构域的拓扑结构，其中所述支架蛋白是修饰的蛋白质，其是标记的蛋白质。或者，所述抗原结合结构域是标记的蛋白质。再另一个修饰可以包括引入一个或多个检测标记或其他产生信号的基团或部分，这取决于标记的抗原结合嵌合蛋白计划的用途。合适的标记和用于连接、使用和检测它们的技术是本领域技术人员清楚的，并且例如包括但不限于荧光标记(如irdye800、vivotag800、荧光素、异硫氰酸盐、若丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、o-邻苯二醛和荧光胺以及荧光金属，如eu或来自镧系元素的其他金属)、磷光标记、化学发光标记或生物发光标记(如鲁米诺、异鲁米诺、热性吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓盐、草酸酯、二氧杂环丁烷(dioxetane0或gfp及其类似物)、放射性同位素、金属、金属螯合物或金属阳离子或特别适用于体内、体外或原位诊断和成像的其他金属或金属阳离子，以及发色团和酶(如苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-v-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸酯脱氢酶、磷酸三糖异构酶、生物素抗生物素蛋白过氧化物酶(biotinavidinperoxidase)、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-vi-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶)。其他合适的标记是本领域技术人员清楚的，并且例如包括可以使用nmr或esr光谱法检测的部分。本发明的这种标记的抗原结合嵌合蛋白也可以例如用于体外、体内或原位测定(包括本身已知的免疫测定，如elisa、ria、eia和其他“夹心测定”等)以及体内诊断和成像的目的，这取决于特定标记的选择。如本领域技术人员将清楚的，另一种修饰可以涉及引入螯合基团，例如以螯合上述金属或金属阳离子中的一种。合适的螯合基团例如包括但不限于2,2',2”-(10-(2-((2,5-二氧杂吡咯烷-1-基)氧基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸(dota)、2,2'-(7-(2-((2,5-二氧杂吡咯烷-1-基)氧基)-2-氧代乙基)-1,4,7-三氮杂烷-1,4-二基)二乙酸(nota)、二乙撑三胺五乙酸(dtpa)或乙二胺四乙酸(edta)。另一种修饰可包括引入作为特异性结合对的一部分的官能团，如生物素-(链)亲和素结合对。这样的官能团可用于连接抗原结合嵌合蛋白与结合至结合对另一半的另一种蛋白质、多肽或化合物，即通过形成结合对来连接。例如，本发明的抗原结合嵌合蛋白可以与生物素缀合，并连接与亲和素或链霉亲和素缀合的另一种蛋白质、多肽、化合物或载体。例如，这种缀合的抗原结合嵌合蛋白可以用作报告子，例如在诊断系统中，其中可检测信号产生剂缀合至抗生物素蛋白或链霉亲和素。此类结合对还可例如用于将本发明的抗原结合嵌合蛋白与载体结合，包括适合于药学目的的载体。一个非限制性实例是由cao和suresh在journalofdrugtargeting，8，4，257(2000)中描述的脂质体制剂。此类结合对还可用于将治疗活性剂连接至本发明的抗原结合嵌合蛋白。另外，使用毒性标记或放射性核素作为有效载荷也在所述抗原结合嵌合蛋白的范围内。最后，与支架蛋白连接或融合的“标记”或“标签”的使用提供了ig结构域的靶蛋白可以被非共价标记的优点。本发明的再一个方面涉及编码本发明的所述抗原结合嵌合蛋白的核酸分子。所述核酸分子包含所述抗原结合结构域和所述支架蛋白和/或其片段的编码序列，其中在所述结构域序列将含有支架蛋白序列(或环状排列序列，或其片段)的插入的事实中反映出被干扰的所述结构域的拓扑结构，使得n-末端抗原结合结构域片段和c-末端抗原结合结构域片段在所述核酸分子内被支架蛋白序列或其片段隔开。在另一个实施方案中，描述了嵌合基因，其至少具有启动子、所述编码抗原结合嵌合蛋白的核酸分子和含有转录终止信号的3’端区域。另一个实施方案涉及编码本发明的所述抗原结合嵌合蛋白的表达盒，或包含编码所述抗原结合嵌合蛋白的核酸分子或嵌合基因。在某些实施方案中，将所述表达盒以通用格式用作免疫文库，其含有大的ig结构域组，以选择用于靶标的大部分合适的结合剂。更多实施方案涉及包含编码本发明的抗原结合嵌合蛋白的所述表达盒或核酸分子。在特别的实施方案中，用于在大肠杆菌中表达的载体允许产生抗原结合嵌合蛋白并在其靶标存在或不存在下纯化它们。备选的实施方案涉及宿主细胞，其包含本发明的抗原结合嵌合蛋白，或编码本发明的抗原结合嵌合蛋白的核酸分子或表达盒或载体。在特定的实施方案中，所述宿主细胞进一步共同表达特异性地结合所述抗原结合嵌合蛋白的抗原结合结构域的抗原或靶蛋白。另一个实施方案公开了所述宿主细胞，或其分离的膜制备物，或从其分离的蛋白质的用途，用于配体筛选、药物筛选、蛋白质捕获和纯化，或生物物理研究。提供所述载体的本发明进一步包括在通用融合载体中高通量克隆的选择。在另外的实施方案中描述了所述通用载体，其中所述载体特异性地适用于酵母、噬菌体、细菌或病毒中的表面展示。此外，所述载体发现了在免疫文库的选择和筛选中的应用，所述文库包括具有大的不同ig结构域组的此类通用载体或表达盒，其中保守ig结构域和支架蛋白的相同n-末端与文库提供的剩余ig结构域序列融合。因此，通过ig结构域序列的差异，且更特别地所述ig结构域文库的cdr区域的差异，提供了为针对特定靶标筛选新的抗原结合嵌合蛋白构建的所述文库中的不同序列。本发明的另一个方面涉及产生根据本发明的抗原结合嵌合蛋白的方法，其包括步骤(a)在使得抗原结合嵌合蛋白表达的条件下，培养包含本发明的载体、表达盒、嵌合基因或核酸序列的宿主，和(b)任选，回收表达的多肽。在一个实施方案中，本发明的载体适用于涉及在细胞群的胞外表面上展示抗原结合嵌合蛋白集合(优选免疫文库)的方法中。表面展示方法综述于hoogenboom(2005；naturebiotechol23，1105-16)，并且包括细菌展示、酵母展示、(细菌)噬菌体展示。优选，细胞群是酵母细胞。不同的酵母表面展示方法全部提供紧密连接由文库编码的每个抗原结合嵌合蛋白与携带编码该蛋白的质粒的酵母细胞的胞外表面的方式。迄今为止描述的大部分酵母展示方法使用酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)，但其他酵母物种，例如，巴斯德毕赤酵母，也可以使用。更具体地，在一些实施方案中，酵母株来自选自酵母属(saccharomyces)、毕赤酵母属(pichia)、汉逊酵母属(hansenula)、裂殖酵母属(schizosaccharomyces)、克鲁维酵母属(kluyveromyces)、耶氏酵母属(yarrowia)和假丝酵母属(candida)的属。在一些实施方案中，酵母物种选自酿酒酵母(s.cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(p.pastoris)、多形汉逊酵母(h.polymorpha)、粟酒裂殖酵母(s.pombe)、乳酸克鲁维酵母(k.lactis)、解脂耶氏酵母(y.lipolytica)和白色假丝酵母(c.albicans)。大部分酵母表达融合蛋白基于gpi(糖基-磷脂酰-肌醇)锚定蛋白，其在细胞表面蛋白的表面表达中起着重要作用，并且对于酵母的生活力力至关重要。一种这样的蛋白质，α-凝集素，由aga1编码的核心亚基组成并且通过二硫桥连接aga2编码的小结合亚基。由核酸文库编码的蛋白质可以引至aga1的n-末端区域上或aga2的c-末端或n-末端区域上。两种融合模式都将导致多肽在酵母细胞表面上的展示。本文公开的载体还适用于原核宿主细胞在表面上展示蛋白质。用于这个目的的合适的原核生物包括真细菌，如革兰氏阳性或革兰氏阴性生物体，例如，肠杆菌科(enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(escherichia)，例如大肠杆菌(e.coli)，肠杆菌属(enterobacter)，欧文氏菌属(erwinia)，克雷伯菌属(klebsiella)，变形杆菌属(proteus)，沙门氏菌属(salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)，沙雷氏菌属(serratia)，例如粘质沙雷氏菌(serratiamarcescans)和志贺氏菌属(shigella)，以及芽孢杆菌属(bacilli)，例如枯草芽孢杆菌(b.subtilis)和地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)(例如，在1989年4月12日公开的dd266,710中公开的地衣芽孢杆菌41p)，假单胞菌属(pseudomonas)，如铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)和链霉菌属(streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(atcc31,446)，尽管其他菌株，如大肠杆菌b、大肠杆菌1776(atcc31,537)和大肠杆菌w3110(atcc27,325)，是合适的。这些实例是说明性的，而非限制性的。宿主细胞是原核细胞时，合适的细胞表面蛋白的实例包括合适的细菌外膜蛋白。这样的外膜蛋白包括菌毛和鞭毛、脂蛋白、冰核蛋白和自转运蛋白。用于异源蛋白质展示的示例性细菌蛋白包括lamb(charbit等，emboj，5(11)：3029-37(1986))、ompa(freudl，gene，82(2)：229-36(1989))和内膜蛋白(intimin)(wentzel等，jbiolchem，274(30)：21037-43，(1999))。另外的示例性外膜蛋白包括但不限于flic、支链淀粉酶、oprf、opri、phoe、misl和溶细胞素。lee等，trendsbiotechnol，21(1)：45-52(2003)，jose，applmicrobiolbiotechnol，69(6)：607-14(2006)和daugherty，curropinstructbiol，17(4)：474-80(2007)中详细介绍了已用于表面展示的细菌膜蛋白的广泛列表。此外，为了进行深入的筛选选择，可将载体分别应用于酵母和/或噬菌体展示，然后分别进行facs和淘选。例如，酵母细胞上抗原结合嵌合体的显示结合荧光激活细胞分选(facs)的分辨能力，提供了一种优选的选择方法。在酵母展示中，每种抗原结合蛋白例如都以与aga2p蛋白的融合体形式展示，在单个细胞表面上约50,000个拷贝。对于通过facs的选择，用不同荧光染料标记将决定选择程序。接下来，可以用所用荧光蛋白的混合物将展示抗原结合嵌合体的酵母文库染色。然后可以使用双色facs来分析在特定酵母细胞上展示的每种抗原结合嵌合体的特性，以解析不同的细胞群。展示高度适合于靶向目标蛋白质的抗原结合嵌合体的酵母细胞将结合，并可以在双色facs中沿对角线进行分选。例如，当需要筛选特异性靶向瞬时蛋白-蛋白相互作用或构象选择性结合的抗原结合嵌合蛋白时，最优选将载体用于这种选择方法。类似地，施加用于噬菌体展示的载体，并用于在噬菌体上展示抗原结合嵌合体，然后淘选。例如可以通过使所述通用载体内的抗原结合嵌合体与细菌噬菌体衣壳蛋白iii融合而在m13颗粒上进行展示(hoogenboom，2000；immunology.5699：371-378)。为了选择特异性结合某些构象和/或瞬时蛋白-蛋白相互作用的抗原结合蛋白，例如，仅将相互作用的原体(protomer)之一固定在固相上。然后通过淘选噬菌体展示的抗原结合嵌合体来进行生物选择，该方法是在过量的剩余可溶性原体存在下进行的。任选，可以从固定在固相上的交联复合物或蛋白质的一轮淘选开始。本发明的另一个方面涉及包含所述抗原结合嵌合蛋白或包含抗原结合嵌合蛋白与抗原或靶蛋白的组合物的复合物，其中所述靶蛋白特异性地结合抗原结合嵌合蛋白或抗原结合嵌合蛋白的组合物。更特别地，其中所述靶蛋白结合所述抗原结合嵌合蛋白的抗原结合结构域，甚至更特别地，在其中所述抗原结合结构域是ig结构域的实施方案中，结合所述抗原结合嵌合蛋白的ig结构域的cdr。一个实施方案公开了如本文所述的复合物，其中抗原结合结构域是构象选择性结合结构域。更特别地，公开了一种复合物，其中抗原结合结构域将靶蛋白稳定在功能性构象中。更具体地，所述功能性构象可能涉及激动剂构象，可能涉及部分激动剂构象，或偏向激动剂构象，等等。或者，公开了本发明的复合物，其中抗原结合结构域将靶蛋白稳定在功能性构象中，其中所述功能性构象是无活性构象，或其中所述功能性构象涉及反向激动剂构象。本发明的更多方面涉及包含所述抗原结合嵌合蛋白的组合物。本发明的“组合物”可以以试剂盒的形式提供，所述试剂盒包含第一容器和第二容器，第一容器包含冻干的抗原结合嵌合蛋白，而第二容器包含用于重悬浮冻干蛋白的溶液。蛋白质粉可以包含一种或多种冻干保护剂，如蔗糖、葡聚糖、山梨糖醇和氨基酸，以在冻干过程中稳定蛋白质。或者，在单个容器中提供了组合物，所述容器包含悬浮液或溶液中的抗原结合嵌合蛋白。任一种溶液可以含有一种或多种赋形剂。溶液通常是水基的。因此，纯水可以形成主要的赋形剂。例如，为获得所需终浓度的蛋白质稀释通常将用注射用水(wfi)进行。溶液通常含有缓冲剂。因此，更多赋形剂包括缓冲剂和ph调节剂，如柠檬酸钠、磷酸二氢钠单水合物和氢氧化钠。在一些情况中，增稠剂，如黄原胶，可以作为另一种赋形剂存在。表面活性剂，特别地非离子型表面活性剂，如聚山梨酯80，也可以存在。其他赋形剂包括蔗糖、山梨糖醇、无机盐、氨基酸和维生素。本发明还涉及包含一种或多种本发明的化合物的“药物组合物”，特别地，包含抗原结合嵌合蛋白和药学上可接受的载体或稀释剂。这些药物组合物可以通过给药于需要的患者用于实现所需的药物效果。本发明包括由药学上可接受的载体和药学有效量的本发明的化合物或其盐组成的药物组合物。化合物的药学有效量优选是对待治疗的特定病症产生结果或发挥影响的含量。通常，“治疗有效量”、“治疗有效剂量”和“有效量”表示获得所需的一种或多种结果需要的含量。本领域普通技术人员将认识到效力，并且因此“有效量”可以根据本发明的化合物的性质和结构而改变。本领域技术人员可以容易地评估化合物的效力。“药学上可接受的”表示不是在生物上或其他方面不合理想的物质，即，可以与化合物一起向个体给药物质，而没有引起任何不合需要的生物作用或以有害的方式与其中含有其的药物组合物的任何其他组分相互作用。药学上可接受的载体优选对患者相对无毒和无害的载体，浓度与活性成分的有效活性相一致，使得归因于载体的任何副作用不会使活性成分的有益作用受损。合适的载体或佐剂通常包含以下非穷举列表中包括的一种或多种化合物：大的缓慢代谢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物和无活性病毒颗粒。这样的成分和程序包括以下参考文献中描述的那些，将每篇按引用并入本文中：powell,m.f等("compendiumofexcipientsforparenteralformulations"pdajournalofpharmaceuticalscience&technology1998,52(5),238-311)，strickley,r.g("parenteralformulationsofsmallmoleculetherapeuticsmarketedintheunitedstates(1999)-part-1"pdajournalofpharmaceuticalscience&technology1999,53(6),324-349)和nema,s等("excipientsandtheiruseininjectableproducts"pdajournalofpharmaceuticalscience&technology1997,51(4),166-171)。如本文所用的，术语“赋形剂”旨在包括可能存在于药物组合物中的并且不是活性成分的所有物质，如盐、粘合剂(例如乳糖、右旋糖、蔗糖、海藻糖、山梨糖醇、甘露醇)、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、乳化剂、缓冲物质、稳定剂、调味剂或着色剂。“稀释剂”，特别是“药学上可接受的介质”，包括如水、盐水、生理盐溶液、甘油、乙醇等这样的介质。辅助物质，如润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质、防腐剂，可以包括在这样的介质中。可以使用任何有效的常规剂型，包括立即释放、缓慢释放和定时释放制剂，将本发明的抗原结合嵌合蛋白和药学上可接受的载体与本领域公知的药学上可接受的载体一起施用，并且可以通过任何合适的途径进行施用，如本领域普通技术人员通常已知的那些中的任一种途径。为了治疗，可以根据标准技术将本发明的药物组合物施用于任何患者。对于口服给药，可以将化合物配制成固体或液体制剂，如胶囊、丸剂、片剂、含片(troches)、锭剂(lozenges)、熔剂、粉剂、溶液、混悬剂或乳剂，并且可以根据本领域已知的用于制造药物组合物的方法制备。固体单位剂型可以是胶囊，其可以是普通的硬壳或软壳明胶类型，其包含例如表面活性剂、润滑剂和惰性填充剂，如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉。在另一个实施方案中，本发明的化合物可以与常规的片剂基质(如乳糖、蔗糖和玉米淀粉)并结合以下物质一起制片：粘合剂，如阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶，旨在帮助施用后的片剂分解和溶解的崩解剂，如马铃薯淀粉、海藻酸、玉米淀粉和瓜尔胶、黄芪胶、阿拉伯胶，旨在改善片剂颗粒流动并防止片剂材料粘附于片剂模具和冲头表面的润滑剂，如滑石粉、硬脂酸或硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌，旨在提高片剂的美学品质并使其更易被患者接受的染料，着色剂和调味剂，如薄荷、冬青油或樱桃调味剂。用于口服液体剂型的合适的赋形剂包括磷酸二钙和稀释剂，如水和醇，例如乙醇、苯甲醇和聚乙烯醇，添加或不添加药学上可接受的表面活性剂、悬浮剂或乳化剂。各种其他材料可以作为涂层存在或以其他方式改变剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用虫胶，糖或两者包衣。分散性粉末和颗粒适合于制备水性悬浮液。它们在与分散剂或湿润剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂的混合物中提供的活性成分。合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂由上面已经提到的那些举例说明。也可以存在其他赋形剂，例如上述的甜味剂、调味剂和着色剂。药物组合物可以是无菌可注射水性悬浮液的形式。可以按照已知方法，使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂来配制这样的悬浮液，如，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮，黄芪胶和阿拉伯胶；可以是天然存在的磷脂，如卵磷脂的分散剂或润湿剂，环氧烷与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物，例如heptadeca-ethyleneoxycetanol，环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的部分酯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的部分酯的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。无菌注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液。可以使用的稀释剂和溶剂是例如水、林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和等渗葡萄糖溶液。另外，无菌不挥发油通常用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，脂肪酸，如油酸，可用于制备注射制剂。另一方面涉及本发明的抗原结合嵌合蛋白的用途或核酸分子、嵌合基因、表达盒、载体、复合物或组合物的用途，所述用途是在靶蛋白的结构分析中的用途。特别地，抗原结合嵌合蛋白在靶蛋白的结构分析中的用途，其中所述靶蛋白是与所述抗原结合嵌合蛋白特异性结合的蛋白。如本文所用的，“分解结构”或“结构分析”是指确定蛋白质的原子排列或原子坐标，并且通常通过生物物理方法来完成，如x射线晶体学或冷冻电子显微镜(cryo-em)。具体地，一个实施方案涉及在结构分析中的用途，包括单颗粒冷冻电镜或包括晶体学。本发明的抗原结合嵌合蛋白在结构生物学中的使用提供了可以用作结晶助剂的主要优势，即起晶体接触的作用并增加对称性，甚至更多地用作冷冻电镜中的刚性工具，冷冻电镜对于分解大型结构将非常有价值，但主要是为了减少当今所应付的尺寸障碍，并且最后也要增加对称性。与更传统的方法(如x射线晶体学)相比，使用冷冻电镜进行结构确定具有多个优势。特别是，冷冻电镜在纯度、均质性和数量方面对待分析样品的要求不那么严格。重要的是，冷冻电镜可以应用于不会形成合适的用于结构确定的晶体的靶标。可以将纯化的或未纯化的蛋白质的悬浮液单独或与其他蛋白质分子(如抗原结合嵌合蛋白)或非蛋白质分子(如核酸)复合施加于碳格栅上，以通过冷冻电镜成像。包被的格栅通常在液态乙烷中闪冻，以将悬浮液中的颗粒保持为冷冻水合状态。较大的颗粒可以通过冷冻固定玻璃化。可以在冷冻超薄切片机中将玻璃化的样品切成薄片(通常为40至200nm厚)，并将这些切片放在电子显微镜格栅上进行成像。通过使用平行照明和更好的显微镜对准可以获得高达～的分辨率，从而改善从图像获得的数据的质量。在这样的高分辨率下，从头开始建立完整原子结构的模型是可能的。然而，在可以使用选定的或紧密相关的靶蛋白和选定的异源蛋白或紧密同源物的原子分辨率的结构数据用于约束比较建模的情况下，则较低分辨率的成像可能就足够了。为了进一步提高数据质量，可以仔细对准显微镜，以揭示在用于成像的相同条件下记录的碳膜图像的傅里叶变换中，可见对比度传递函数(ctf)环超过1/3然后可以使用如ctffind之类的软件确定每张显微照片的散焦值。本发明的另一个方面涉及一种确定靶蛋白或目标蛋白的3-维结构的方法，其包括步骤：(i)提供本发明的抗原结合嵌合蛋白或抗原结合嵌合蛋白的组合物和靶蛋白，以形成复合物，其中所述靶蛋白特异性地结合所述抗原结合嵌合蛋白或组合物，或提供本发明的复合物；(ii)且在合适的条件下展示所述混合物或复合物，用于结构分析，其中在高分辨率下确定所述靶蛋白的3d结构。在特定的实施方案中，通过x-射线晶体学进行所述结构分析。在另一个实施方案中，所述3d分析包括冷冻电镜。更具体地，本文如下描述了一种用于冷冻电镜分析的方法。印迹前将样品(例如，在与目标靶复合的选择的megabody蛋白)施加到选择的性能最佳的放电格栅上(碳包被铜格栅，c-flat，1.2/1.3200目)：electronmicroscopysciences；金r1.2/1.3300目ultraaufoil格栅：quantifoil等)，然后在液态乙烷中plunge-冻(vitrobotmarkiv(fei)或选择的其他plunger)中。单个格栅的数据是在配备有选择的探测器(例如，falcon3ec直接探测器)的300kv电子显微镜(以krios300kv为例，带有选择的补充相板)下收集的。显微照片以电子计数模式以适合预期的megabody-抗原复合物大小的适当放大倍率收集。手动检查收集的显微照片，然后再进行进一步的图像处理。通过选择的软件(例如relion，sphire包)应用漂移校正、射束感应运动、剂量加权、ctf拟合和相移估计。使用选择的软件挑选粒子，并将其用于2d分类。手动检查2d分类，并消除假阳性。根据数据收集设置对粒子进行分类。通过应用适当的低通滤波器来生成初始3d参考模型，并生成多个(以六个为例)3d分类。使用原始粒子进行3d细化(如果需要，使用软蒙板)。通过使用傅立叶壳相关(fsc)＝0.143标准来估计重建分辨率。本地分辨率可以通过scipion中的monores实施来计算。重建的冷冻电镜图谱可以使用ucsfchimera和coot软件进行分析。最初可以使用ucsfchimera拟合设计模型，然后通过选择的软件(ucsfchimera，pymol或coot)进行分析。本发明方法的另一个优点是，由于使用抗原结合嵌合蛋白，以常规方式只能用高纯度蛋白质才能进行的结构分析对纯度的要求不那么严格了。这样的抗原结合蛋白，特别是在纳米抗体的情况下，将通过结合复杂混合物中的表位而特异性地滤出目标蛋白。靶蛋白可以通过这种方式被捕获、冷冻并通过冷冻电镜进行分析。所述方法在替代实施方案中也适用于3d分析，其中靶蛋白是瞬时蛋白-蛋白复合物。另外，所述嵌合抗原结合分子也可以用于确定靶标的3维结构的方法中以稳定作为靶标的瞬时蛋白-蛋白相互作用以进行其结构分析。另一个实施方案涉及选择或筛选与相同靶蛋白的不同表位结合的一组抗原结合嵌合蛋白的方法，其包括以下步骤：(i)设计与靶蛋白结合的抗原结合嵌合蛋白的免疫文库，和(ii)通过表面酵母展示、噬菌体展示或细菌噬菌体选择抗原结合嵌合蛋白以获得包含与所述靶的几个表位结合的蛋白的抗原结合嵌合蛋白组，从而允许在分开的图像中例如在冷冻电镜中分析靶蛋白的几种构象。在另一个实施方案中，本发明的所述方法和所述抗原结合嵌合蛋白用于基于结构的药物设计和基于结构的药物筛选。基于结构的药物设计的迭代过程通常会经过多个周期，然后才能将优化的前导引入i期临床试验。第一个循环包括通过三种主要方法之一的靶蛋白或核酸的克隆、纯化和结构测定：x射线晶体学、nmr或同源性建模。使用计算机算法，将数据库中的化合物或化合物片段置于结构的选定区域中。可以使用本发明的抗原结合嵌合蛋白来固定或稳定靶标的某些结构构象。根据所选化合物与该靶标位点的空间和静电相互作用对其进行评分和排名，并通过生化分析测试最佳化合物。在第二个循环中，对与来自第一个循环的具有前景的前导(在体外至少具有微摩尔抑制作用)复合的靶标进行结构测定，揭示了可以优化以提高效力的化合物上的位点。同样在这一点上，本发明的抗原结合嵌合蛋白可以发挥作用，因为它有助于以某种构象状态对所述靶标进行结构分析。其他循环包括优化前导的合成，确定新靶标:先导复合物的结构以及进一步优化前导化合物。在药物设计过程的几个循环后，优化的化合物通常在结合并且常常在针对靶标的特异性方面表现出显著提高。文库筛选会导致命中，并将其进一步开发为前导，对于这些前导的结构信息以及用于结构-活性-关系分析的药物化学是必不可少的。在另一个实施方案中，本发明的方法中使用的所述抗原结合嵌合蛋白的抗原结合结构域包含纳米抗体ig结构域，从而提供了所述方法的附加优点，所述方法仅包括正确折叠的靶蛋白的平均图像，因为使用纳米抗体选择展示的抗原结合嵌合体揭示了构象表位的大部分的结合剂。另一个实施方案涉及鉴定(构象选择性)化合物的方法，其包括步骤：i)提供靶蛋白和特异性结合所述靶蛋白的本发明的抗原结合嵌合蛋白ii)提供测试化合物iii)评价测试化合物与靶蛋白的选择性结合。根据特别优选的实施方案，通过配体结合测定或竞争测定，甚至更优选放射性配体结合或竞争测定，来进行上述鉴定构象选择性化合物的方法。最优选，在比较测定中，更具体地，比较配体竞争测定，甚至更具体地比较放射性配体竞争测定中进行上述鉴定构象选择性化合物的方法，其在实施例部分中进一步说明。待测试的化合物可以是任何小的化合物，或大分子，如蛋白质、糖、核酸或脂质。通常，测试化合物将是小的化合物、肽、抗体或其片段。将认识到在一些情况中测试化合物可以是测试化合物的文库。特别地，针对治疗化合物(如激动剂、拮抗剂或反向激动剂)和/或调节剂的高通量筛选测定形成本发明的一部分。对于高通量目的，可以使用化合物文库或组合文库，如变构化合物文库、肽文库、抗体文库、基于片段的文库、合成化合物文库、天然化合物文库、噬菌体展示文库等。用于制备和筛选此类文库的方法是本领域技术人员已知的。测试化合物可以任选是共价或非共价连接可检测标记。合适的可检测标记以及用于连接、使用和检测它们的技术是本领域技术人员清楚的，并且包括，但不限于，通过光谱、光化学、生化、免疫化学、电、光学或化学手段可检测的任何组合物。有用的标记包括磁珠(例如，dynabeads)、荧光染料(例如，所有alexafluor染料、异硫氰酸荧光素、texas红、若丹明、绿色荧光蛋白等)、放射性标记(例如，3h、125i、35s、14c或32p)、酶(例如，辣根过氧化物、碱性磷酸酶)和比色标记，如胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠。检测此类标记的方法是本领域技术人员公知的。因此，例如，可以使用胶卷或闪烁计数器检测放射性标记，可以使用光探测器检测发射的照明以检测荧光标记。通常通过提供酶与底物并检测由酶对底物的作用产生的反应产物来检测酶标记，而比色标记可以通过简单地观察有色的标记来检测。其他合适的检测标记早先在关于本发明的嵌合多肽的本发明的第一个方面的内容中已经描述。因此，根据特定的实施方案，上述任一种筛选方法中使用的测试化合物选自多肽、肽、小分子、天然产物、肽模拟物、核酸、脂质、脂肽、碳水化合物、抗体或其衍生的任何片段，如fab、fab'和f(ab')2、fd、单链fvs(scfv)、单链抗体、二硫化物连接的fv(dsfv)和包含vl或vh结构域任一的片段、重链抗体(hcab)、单结构域抗体(sdab)、迷你抗体、源自骆驼重链抗体的可变结构域(vhh或纳米抗体)、源自鲨鱼抗体的新抗原受体的可变结构域(vnar)、包括alphabody的蛋白支架、蛋白a、蛋白g、设计的锚蛋白重复结构域(darpins)、iii型纤连蛋白重复序列、anticalins、knottins、工程化ch2结构域(纳米抗体)，如上文定义的。在一个优选实施方案中，高通量筛选方法涉及提供包含大量潜在治疗配体的组合化学或肽文库。然后，如本文所述的，在一种或多种测定法中筛选此类“组合文库”或“化合物文库”，以鉴定显示出所需特征活性的那些文库成员(特定的化学物质或亚类)。“化合物文库”是通常最终用于高通量筛选中的存储化学物质的集合。“组合文库”是通过组合各种化学“构建块”，通过化学合成或生物合成生成的多种化学化合物的集合。组合文库的制备和筛选是本领域技术人员公知的。由此鉴定的化合物可以用作常规的“前导化合物”，或者本身可以用作潜在的或实际的治疗剂。另一个方面提供了所述抗原结合嵌合蛋白的用途，其中支架蛋白是标记的蛋白质，作为诊断工具，或更具体地用于体内成像。最后一个方面提供了所述抗原结合嵌合蛋白或核酸、载体、复合物或组合物，用作药物。如本文使用的，术语“药物”是指用于治疗中的物质/组合物，即，用于疾病或病症的预防或治疗中。根据本发明，术语“疾病”或“病症”是指任何生理状态，特别是指如本文定义的疾病或病症。应当理解，尽管本文已经针对根据本发明的工程化细胞和方法讨论了特定的实施方案，特定的构造以及材料和/或分子，但是可以在形式和细节上进行各种改变或修改而不背离本发明的范围和精神。提供以下实施例以更好地说明特定实施方案，并且不应将其视为限制本申请。该申请仅受权利要求的限制。实施例概述我们已经设计了由抗原结合结构域和支架蛋白构建的刚性抗原结合嵌合蛋白，其中抗原结合结构域通过两个或三个短接头或通过两个或三个直接连接而连接到支架蛋白上。根据支架的性质，这些刚性抗原结合嵌合蛋白用于不同的应用。例如，本文呈现的“抗原结合嵌合蛋白”也称为“megabodies”(mbs或mgbs)，并且由包含免疫球蛋白或免疫球蛋白样结构域的纳米抗体、vhh或monobodies嫁接到支架蛋白上构建而成，特别是大型单体支架。那些抗原结合嵌合体或如本文中特别使用的megabodies有助于确定(较小)蛋白质的蛋白质结构，并且有助于包括x射线晶体学和冷冻电镜应用在内的数种应用。mbs通过降低靶标的构象柔性和通过扩展倾向于形成晶体触点的表面，以及通过提供其他定相信息，而充当下一代结晶伴侣蛋白。此外，使用那些嵌合体作为创新的辅助工具，已经降低了使用冷冻电镜获得高分辨率结构的尺寸壁垒。通过将特定的megabody抗原结合嵌合蛋白与其靶标混合，它们的特异性结合相互作用导致“质量”添加，并将颗粒获得并定义的特征嵌入到玻璃冰中的网格中，从而有助于精确的图像对准并提高3d重建的分辨率。使用此类抗原结合型嵌合蛋白(如mbs)的另一个优点是它们以一对一的比例选择性结合构象表位，有利于颗粒分类并由此改善了分类颗粒的结构/构象均质性并提高了3d重建的分辨率。重要的是，可以使用/组合一组相似的但结合相同蛋白质上的不同表位的不同mb，以从相同的大分子复合物制备不同的颗粒。作为此方法概念的证明，我们在根据图2的gfp特异性纳米抗体的第一个暴露的β-转角(连接β-链a和b)中插入了编码hopq(幽门螺杆菌的周质蛋白，pdb5lp2)粘附结构域的基因的环状排列变体(chopq)(实施例1)。我们将此嵌合体表达为大肠杆菌周质中的分泌蛋白，并以mg量将其纯化至同质(实施例2)。接下来，我们证实了这种嵌合抗体结合gfp并通过x射线晶体学解析了其结构(实施例3)。使用相同的支架，我们还制备了稳定蛋白质复合物的抗原结合嵌合蛋白(实施例4)、结合gpcr的抗原结合嵌合蛋白(实施例5)和结合离子通道的抗原结合嵌合蛋白(实施例6；和实施例22)。此外，实施例5表明可以获得构象选择性稳定，由此保留了从其构建megabody的nb或抗原结合结构域的所有功能特性。我们还使用了体外进化技术，通过两个短的多肽连接来设计其他功能性的基于hopq的megabodies，所述两个短的多肽连接在接头长度和接头组成上不同(实施例7)。为了显示其他大型支架蛋白也可以用于构建megabodies，我们接下来通过两个长度和组成不同的短多肽连接在gfp特异性纳米抗体的连接β链a和b的第一个β-转角中插入了编码ygjk(pdb3w7s)(大肠杆菌的86kda周质蛋白)的基因的环状排列变体(实施例8)。我们还表明，可以在接头肽之一和纳米抗体的c-末端之间工程化二硫键，以使megabodies刚性化(实施例9)。还构建了由nb构建的其他刚性抗体嵌合体，这些嵌合体通过更复杂的连接方案连接支架。使用体外进化，我们通过长度和组成不同的三个短多肽连接，将gfp特异性纳米抗体与azurin(pdb2tsa)融合。azurin是含铜的单结构域蛋白，待用于通过x射线晶体学中的异常散射来定相(实施例10)。本文描述为megabodies的所得抗原结合嵌合蛋白显示出能够使得通过x射线晶体学和单颗粒冷冻电镜对蛋白质或复合物进行结构研究。类似地，抗原结合结构域可以刚性偶联至具有结构对称性的多聚支架，从而产生具有结构对称性的多聚抗原结合嵌合蛋白或多聚megabodies。为了证明这一原理，通过三个连接纳米抗体与支架的短的多肽接头将结合溶菌酶的nb嫁接到susb上，susb是多形拟杆菌的反向糖苷酶水解酶同型二聚体(pdb3wfa)(实施例11)。具有两倍对称性的此类同型二聚体mb允许在冷冻电镜或x射线晶体学中利用对称性限制，从而有助于在高分辨率下确定蛋白质结构。在另一个实例中，我们从由nb构建的抗原结合嵌合蛋白产生了展示纳米抗体的病毒样颗粒(vlp)，nb与pp7的衣壳蛋白或ap205(一种天然存在的环状排列的pp7)刚性融合。pp7是铜绿假单胞菌的二十面体细菌噬菌体。源自pp7的vlp封装了指导其合成的mrna，因此建立了亲和力选择的抗原特异性nb序列所需的基因型/表型连接。因此，我们将体外进化技术用于设计稳健的vlp，这些vlp以高度对称的排列在其表面上展示90个nb(实施例12-15)。这些展示纳米抗体的vlp是通过冷冻电镜解析小蛋白结构的出色工具。如免疫球蛋白的抗原结合结构域也可以通过刚性嫁接到支架上，所述支架可以用荧光团、染料、离子或金属标记，用于诊断、成像或其他生物物理应用中。在实施例10中，我们将gfp特异性纳米抗体与azurin(pdb2tsa)融合，azurin是一种含铜的单结构域蛋白，可用于通过x射线晶体学中的异常散射进行定相。我们还将结合gfp的纳米抗体刚性嫁接到酰基载体蛋白(acp)上(实施例16)。acp是可以在单个酶促步骤中用共价荧光团进行正交标记的蛋白质。还可以通过三个短肽接头将免疫球蛋白结构域与相同的ig结构域或不同的ig结构域(或甚至不同的治疗性支架)刚性融合，以分别产生二价或双特异性抗原结合嵌合蛋白(nano2bodies、n2b，实施例17&18)。二价或双特异性抗原结合嵌合蛋白可以用作x-射线晶体学或冷冻电镜中的伴侣蛋白，但在生物物理应用、成像、诊断和治疗中也具有多重应用。由于β链a包含在所有nb共有的高度保守的n末端序列中(harmsen等，2000)，因此可以方便地将所有体内成熟的纳米抗体库克隆为刚性抗原结合嵌合蛋白文库(包含抗原结合的嵌合蛋白，如本文所称的megabodies，nanotools或nano2bodies)，并通过标准方法筛选结合剂。然后通过噬菌体展示、酵母展示或病毒展示选择功能性抗原结合嵌合蛋白(实施例19)。我们还从插入gfp特异性纳米抗体的第二个暴露的β转角(连接β链c和c’)中的编码hopq的粘附结构域(幽门螺杆菌的周质蛋白；本文称为“chopq”的环状排列变体)的基因的环状排列变体构建了刚性抗原结合嵌合蛋白(实施例20)并产生了由合成免疫球蛋白样抗原结合蛋白(如monobodies)构建的抗原结合嵌合蛋白(实施例21)。此外，几种设计并产生的抗原结合嵌合蛋白已经用于棘手的膜结合复合物(如gpcr、离子通道和酪氨酸受体激酶)的结构分析(实施例22)。另一个实施例证明了通过产生抗原结合嵌合蛋白或源自结合chopq支架蛋白的megabody的megabody，形成了抗原结合嵌合蛋白的某些组合物或“polybody”，以进一步增大支架尺寸(实施例23)。实施例24表明了多聚抗原结合嵌合蛋白可以从插入nb的第一条β链ab的dodecin蛋白构建。并且最后，还测试了二硫化物桥接的同型二聚体作为支架蛋白用于产生另一种形式的具有增加的质量和对称性的抗原结合嵌合蛋白(实施例25)。实施例1：从插入gfp特异性纳米抗体的第一个连接β-链ab的β-转角中的chopq支架构建的58kd抗原结合嵌合蛋白的设计和产生。作为获得刚性抗原结合嵌合蛋白(如megabodies)的概念的第一个证明，根据图2，通过两个连接纳米抗体与支架的肽键将纳米抗体嫁接到大的支架蛋白上，构建了刚性megabody。本文所述的58kdamagabody是根据图2和3连接的从单结构域免疫球蛋白的部分和支架蛋白的部分连结的嵌合多肽。在此，使用的免疫球蛋白结构域是如seqidno:1中所示的结合gfp的纳米抗体。支架蛋白是称为hopq的幽门螺杆菌株g27的粘附素结构域(pdb:5lp2，seqidno:19)(javaheri等，2016)。连接hopq的n-和c-末端，以允许形成hopq的环状排列变体，称为chopq，其中在其序列中的另一些地方进行序列的切割。为了设计mbnb207chopq构建体，将所有部分以以下给出的顺序通过肽键(seqidno:20)彼此从氨基(n-)末端连接羧基(c-)末端：抗gfp纳米抗体的β-链a(seqidno:1的1-13)，hopq的c-末端部分(seqidno:19的残基192-414)，连接hopq的c-末端和n-末端以产生支架蛋白的环状排列chopq的短肽接头(seqidno:21)，hopq的n-末端部分(seqidno:19的残基14-186)，结合gfp的纳米抗体的β-链b至g(seqidno:1的残基16-126)，6xhis标签和epea标签(us9518084b2；seqidno:209)。为了证明mbnb207chopq(seqidno:20)可以作为折叠良好且功能性的蛋白表达，我们在酵母的表面上展示了这种蛋白质(boder，1997)并通过流式细胞术检测了同类抗原(gfp)与展示这种megabody的酵母细胞的特异性结合。为了在酵母上展示mbnb207chopq，我们使用了标准方法来构建编码与各种辅助肽和蛋白的融合体中的megabody的开放阅读框(seqidno:22)：指引在酵母中胞外分泌的apps4前导序列(rakestraw，2009)，mbnb207chopq，柔性肽接头，通过二硫键将酵母细胞壁连接aga1p蛋白的酵母凝集素蛋白aga2p的粘附亚基aga2p，用于展示的融合蛋白的正交荧光素染色的酰基载体蛋白(johnsson，2005)，接着是cmyc标签。将这个开放阅读框在半乳糖诱导型gal1/10启动子的转录控制下置于pctcon2载体中(chao，2006)并引入酵母株eby100中。将带有这个质粒的eby100酵母细胞在富含半乳糖培养基中生长并诱导过夜，以引发mbnb207chopq-aga2p-acp融合体的表达和分泌。对于acp的正交染色，在荧光标记的coa类似物(coa-647，2μm)和催化量的sfp合成酶(1μm)存在下，将细胞孵育1h。我们发现了通过将生长条件从富含葡萄糖培养基变成富含半乳糖培养基诱导了酵母表面上的mbnb207chopq表达(图4)。表面展示水平可以通过流式细胞术容易且定量分析。在这些实验中，将诱导的酵母细胞洗涤并接受流式细胞术，通过将coa647荧光水平与没有展示megabody但在相同测试中正交染色的酵母细胞进行比较，以测量每个细胞的mb展示水平。在表达mbnb207chopq的培养物中只检测到具有高co647荧光信号的可区分酵母细胞，表明megabody可以在酵母表面上有效展示和正交染色(图4)。为了分析展示的megabody的功能，我们通过流式细胞术检测了其与同类抗原(gfp)的结合。如上所述，用coa647将eby100酵母细胞进行诱导并正交荧光染色，以监测mbnb207chopq-aga2p-acp融合体展示。接着将这些正交染色的酵母细胞在100nmgfp存在下孵育1h(scholz等，2000)。洗涤这些细胞后，我们观察到可检测量的结合展示的mbnb207chopq的gfp，这应当与酵母表面上的mbnb207chopq的表达水平为线性相关。实际上，二维流式细胞术分析证实了gfp(高gfp荧光水平)仅结合具有显著megabody展示水平(高coa647荧光水平)的酵母细胞(图5)。相反，gfp没有结合已经以相同方式染色但没有表达mbnb207chopq的野生型酵母细胞。我们从这些实验推断mbnb207chopq可以作为折叠良好且功能性的抗原结合(结合gfp)嵌合蛋白在酵母表面上表达。实施例2：从插入gfp特异性纳米抗体的第一个连接β-链ab的β-转角中的chopq支架构建的58kd抗原结合嵌合蛋白的表达、纯化和表征。接着，我们开始在大肠杆菌的周质中表达这个58kdambnb207chopq，将这纯化至均质并测定其特性。为了在大肠杆菌中周质中表达megabodies样mbnb207chopq(seqidno:20)，我们使用了标准方法来构建克隆载体(称为pmesd2)，其允许任何所需的megabody的表达，所述megabody从插入任何纳米抗体的连接非常保守的β-链a和β-链b的第一个β-转角中的hopq(的环状排列变体)构建。这个载体是pmes4的衍生物(pardon，2014)并且含有编码以下多肽的开放阅读框：指引megabody分泌至大肠杆菌周质中的dsba前导序列，nbgfp207的β-链a，表示纳米抗体非常保守的fr1部分，hopq的环状排列变体，称为chopq，6xhis标签和epea标签，接着是amber终止密码子。任何纳米抗体的c-末端部分(从β-链b至β-链g)可以在这个载体中作为sapi片段克隆。为了在大肠杆菌的周质中表达mbnb207chopq，并将这种重组蛋白纯化至均质，通过pcr扩增编码来自β-链b至g的nbgfp207的dna片段(seqidno:121的核苷酸52-378)(使用引物seqidno:122和seqidno:123)并在pmesd2载体中作为sapi片段克隆，所述载体指引his标记和epea标记的mbnb207chopq在大肠杆菌中周质中在plac启动子的转录控制下表达。将wk6细菌细胞(wk6是su-非抑制菌株)在6ltb培养基中在37℃下生长并在细胞达到对数生长期时通过iptg来诱导。his标记和epea标记的mbnb207chopq的周质表达在28℃下继续过夜。通过离心收获细胞并使用渗透性休克从周质释放重组mbnb207chopq(pardon等，2014)。随后通过离心从原生质体分离重组megabody并从histrapff5ml预填充柱上的澄清上清液收集。接着通过施加500mm咪唑从ninta树脂洗脱蛋白并使用具有3kda截留的nmwl滤器(nominalmolecularweightlimit)通过离心浓缩。接着将浓缩样品施加于superdex200pg16/90大小排阻柱，以回收24mg作为可溶性蛋白的重组megabody，具有约60kda的表观分子量。接着通过大小排阻色谱(sec)分析了纯化的重组mbnb207chopq的功能特性。用4倍摩尔过量的gfp在4℃下孵育megabody30min，并施加于superdex75pg16/90柱上。将单独的纯化的gfp分开施加于相同的大小排阻色谱上(图6)。通过测量280nm(由任何蛋白质吸收的)和488nm(由gfp吸收的)处的uv吸收来监测不同蛋白质的洗脱。图6中显示的洗脱谱说明了两个对称峰中含有megabody和过量gfp洗脱液的混合物(蓝色和红色吸收谱)。第一个洗脱峰(最高分子量)在488nm处吸收，表明其含有gfp。第二个峰在相同洗脱体积的单独gfp洗脱(绿色吸收谱)并且也在488nm处吸收。相应洗脱级分的sds-聚丙烯酰胺电泳证实了含有megabody和过量gfp的混合物的第一个洗脱峰含有megabody和gfp，而第二个峰仅含有gfp。所有这些数据表明纯化的重组mbnb207chopq与gfp形成了复合物，其抵抗大小排阻色谱的分离。此外，通过生物层干涉法进行了mbnb207chopq与gfp的特异性结合的实时动力学分析。将链霉亲和素包被的生物传感器用于捕获生物素化的gfp并与不同浓度的mbnb207chopq结合。图24中显示的数据证明了使用mbnb207chopq对gfp的亲和性与使用单独的nbgfp207的亲和性相似。实施例3.通过x射线晶体学测定从插入gfp特异性纳米抗体的第一个连接β-链ab的β-转角中的chopq支架构建的58kd抗原结合嵌合蛋白的结构。如实施例1和2中所述的，我们能够表达和纯化58kda嵌合体mbnb207chopq，我们开始结晶这种megabody并通过x-射线晶体学解析其结构。按照实施例2中所述的，通过sec(图6)作为复合物纯化mbnb207chopq，浓缩至48mg/ml并在补充了0.1ul母液的0.1μl滴液中进行各种商业稀疏矩阵结晶筛选(jscg/proplex/pegion/wizard12/morpheus)。将jscg筛选a2条件(0.1m柠檬酸钠，ph5.5，20％w/vpeg3000)中获得的小晶体用于接种优化方法中。从jscga2晶体接种，在0.2m柠檬酸铵、17％peg3350、10％甘油48mg/mlmb207中获得了衍射良好的晶体。在diamond(uk)的i3源处收集了数据并结构细化到分辨率(表1)。表1.结晶、数据收集和细化统计学megabody在p1中结晶，每个不对称单元有10个分子。不对称单元中不同分子之间的rmsd范围为0.3至表明纳米抗体通过两个连接纳米抗体与支架的肽键刚性地连接支架。实施例4：从插入蛋白复合物稳定纳米抗体的第一个连接β-链ab的β-转角中的chopq支架构建的58kd抗原结合嵌合蛋白的表达和纯化。作为第二个抗原结合嵌合蛋白实例，我们着手表达和纯化从插入nb35的第一个连接β链a和b的β-转角中的chopq支架构建的58kd抗原结合嵌合蛋白，nb35在β2肾上腺素能受体-gs蛋白复合物的gβ和gα亚基的界面处结合(rasmussen等，2011a)。称为mbnb35chopq的58kdmegabody是根据图2和3连接的单结构域免疫球蛋白的部分和支架蛋白的部分连结的嵌合多肽。在此，使用的免疫球蛋白结构域是在β2肾上腺素能受体-gs蛋白复合物的gβ和gα亚基的界面处结合的纳米抗体(rasmussen等，2011a)，cdr1主要与gβ相互作用，长cdr3环与gβ和gα亚基两者相互作用，如seqidno:24中所述的。将所有部分以以下给出的顺序通过肽键(seqidno:25)彼此从氨基末端连接羧基末端：抗gfp纳米抗体的β-链a(seqidno:1的1-13)，hopq的c-末端部分(seqidno:19的残基192-414)，连接hopq的c-末端和n-末端以产生支架蛋白的环状排列的短肽接头(seqidno:21)，hopq的n-末端部分(seqidno:19的残基14-186)，纳米抗体的链b至g(seqidno:1的残基16-128)，6xhis标签和epea标签。为了在大肠杆菌的周质中表达mbnb35chopq，并将这种重组蛋白纯化至均质，通过pcr扩增编码来自β-链b至g的nb35的dna片段(使用引物seqidno:122和seqidno:123)并在pmesd2载体中作为sapi片段克隆，所述载体指引his标记和epea标记的chopqnb35megabody(seqidno:25)在大肠杆菌中周质中在plac启动子的转录控制下表达。还按照实施例2中所述的在大肠杆菌周质中表达了mbnb35chopq，并纯化至均质。此外，纯化的chopqnb35选择性地在β2肾上腺素能受体-gs蛋白复合物的gβ和gα亚基的界面处结合。实施例5：从插入grcr特异性纳米抗体的第一个连接β-链ab的β-转角中的chopq支架构建的58kd抗原结合嵌合蛋白的表达和纯化。作为再一个实例，我们着手表达和纯化另一个从插入nb80的第一个连接β链a和b的β-转角中的chopq支架构建的58kd抗原结合嵌合蛋白，nb80结合人β2肾上腺素能受体并呈现出g蛋白样行为(rasmussen等，2011b)。这样的纳米抗体的替换方案已经描述于例如wo2012/007593(参见表1、2)、wo2012/175643(参见表2、3)、wo2014/122183(参见表1和2)和wo2015/110449(参见表2和3)中。基于这些引用的专利申请中列出的所述nb的序列(所述表中列出的)，本发明因此还包括如本文所述设计和产生的所有抗原结合嵌合蛋白。或者，所述nb的cdr足以获得所述的靶向的cgpr复合蛋白的特异性稳定，本发明因此还包括如本文所述设计和产生的抗原结合嵌合蛋白，其中来自所述引用的gpcr复合特异性nb的cdr是所述结合gpcr复合物的抗原结合嵌合蛋白的抗原结合结构域的cdr的基础。称为mbnb80chopq的58kdmegabody是根据图2和3连接的单结构域免疫球蛋白的部分和支架蛋白的部分连结的嵌合多肽。在此，使用的免疫球蛋白结构域是nb80(seqidno:26)，在β2肾上腺能受体的胞质侧结合的纳米抗体。其cdr3的八氨基酸序列渗入由来自受体的tm区段3、5、6和7的氨基酸形成的疏水性袋中。其cdr1的四氨基酸序列提供了另外的与tm区段5和6的胞质端稳定的相互作用(rasmussen等，2011b)。其cdr3占据了与β2ar-gs蛋白复合物中的gs的羧基末端肽相似的位置(rasmussen等，2011a)。将所有部分以以下给出的顺序通过肽键(seqidno:27)彼此从氨基末端连接羧基末端：抗gfp纳米抗体的β-链a(seqidno:1的1-13)，hopq的c-末端部分(seqidno:19的残基192-414)，连接hopq的c-末端和n-末端以产生支架蛋白的环状排列的短肽接头(seqidno:21)，hopq的n-末端部分(seqidno:19的残基14-186)，nb80的β-链b至g(seqidno:27的残基16-120)，6xhis标签/epea标签。为了在大肠杆菌的周质中表达mbnb80chopq，并将这种重组蛋白纯化至均质，如实施例4下所述的，通过pcr扩增编码来自β-链b至g的nb80的dna片段(使用引物seqidno:122和seqidno:123)并在pmesd2载体中作为sapi片段克隆。这个质粒指引his标记和epea标记的mbnb80chopq(seqidno:27)在大肠杆菌中周质中在plac启动子的转录控制下表达。与之前实施例的megabodies相似，还按照实施例2中所述的在大肠杆菌周质中表达了mbnb80chopq，并纯化至均质。此外，纯化的mbnb80chopq选择性地结合并稳定β2ar的活性状态构象。与wo2012/007593中所述的实施例相似，我们将nb80或mbnb80chopq存在下的β2ar野生型(wt)受体的药理特性与仅β2ar-wt的特性和无关megabodymbnb207chopq存在下的β2ar-wt的特性进行了比较(图53)。nb80是选择性地结合激动剂结合的β2ar并呈现g蛋白样行为的纳米抗体，因此稳定激动剂·β2ar·nb80复合物中的受体的活性状态构象(rasmussen等，2011)。我们通过放射性配体试验研究了nb80结合人β2肾上腺素能受体并呈现g蛋白样行为的特性(rasmussen等，2011b)是否保留在mbnb80chopq中。nbgfp207，特异性结合gfp并对β2ar没有亲和性的纳米抗体。同样，将mbnb207chopq用作阴性对照，并且显示出对β2ar没有亲和性(图53)。为了能够比较nb80或mbnb80chopq对β2ar的药理作用，我们如下进行了放射性配体试验。为了表达β2ar野生型(wt)受体，根据制造商的说明，使用杆状病毒表达系统(invitrogen，目录号10359-016)将1μgpfastbac1-β2arwt构建体转化至dh10bactm细胞中并涂布新鲜的lb琼脂平板上，该平板上补充了50μg/ml卡那霉素，7μg/ml庆大霉素，10μg/ml四环素，100μg/mlx-gal和40μg/mliptg。挑出白色菌落，纯化杆状病毒质粒(bacmid)，并通过测序确认开放阅读框的序列。重组杆状病毒是通过将2μg杆状病毒质粒dna与8μlcellfectin作为转染试剂一起以6孔板形式转染到sf9细胞中而产生的。将细胞在27℃下孵育，3天后收集p1病毒。随后通过连续传代扩增病毒，并收集p3病毒。用0.5m.o.i.的杆状病毒感染浓度为2-3×106细胞/ml的sf9细胞，并且细胞在27℃表达受体72小时。通过流式细胞术评估受体的表达和细胞表面定位，使用小鼠抗flagm2抗体作为一抗(1:100)，该抗体识别受体n-末端细胞外部分的flag肽序列，并使用抗小鼠dylight405作为二抗(1；100)。通过将这些细胞以1000xg离心30分钟并将所得沉淀重悬于补充了蛋白酶抑制剂(completetm无edta蛋白酶抑制剂混合物片，roche)的tme结合缓冲液(75mmtris/hclph7.4、12.5mmmgcl2、1mmedta)中，从而从这些细胞制备膜。使用ultraturrax匀浆器以最大速度将细胞发生六次裂解，每次10秒。然后将含有膜的裂解物在4℃下以40.000xg离心40分钟，弃去上清液，并将膜沉淀物重悬于补充有10％蔗糖的tme结合缓冲液中。将膜在-80℃下保存直至进一步使用。按照生产商的说明，使用piercebca蛋白质检测试剂盒(thermoscientific)估算总膜蛋白含量。为了根据总膜蛋白浓度对数据进行归一化以进行进一步分析，将所有样品稀释至0.2mg/ml的终浓度。对于放射性配体竞争结合试验，在存在2nm[3h]-二氢阿普洛尔和存在5μmnb80、mbnb80chopq、mbnb207chopq或无纳米抗体的情况下，将10μg表达β2ar-wt的膜与范围从10-11m到10-4m的浓度递增的肾上腺素(天然激动剂，sigma目录号nre4250)或(-)-异丙肾上腺素盐酸盐(全激动剂，sigma目录号nri6504)孵育。在存在10μm阿普洛尔的情况下确定非特异性结合。将样品在室温下在振荡平台上孵育2小时，然后使用96孔filtermate收集器(perkinelmer)在whatmangf/cunifilters(perkinelmer，目录号nr6005174)上过滤，将结合受体的放射性配体与游离放射性配体分离。过滤后，用冰冷洗涤缓冲液(20mmtris-hclph7.4)洗涤保留在滤板上的膜，并将过滤器在50℃干燥下1小时。加入35μl闪烁液(microscinttm-o，perkinelmer)后，在wallacmicrobetatrilux闪烁计数器中测量保留在过滤器上的放射活性(cpm)。数据表示一式两份进行的每个实验的平均值±s.e.。ic50值是使用prism(graphpadsoftware，sandiego，ca)通过非线性回归分析确定的。如图53中所示，我们发现了存在mbnb80chopq时β2ar-wt的药理特性与存在nb80时β2ar-wt的特性非常相似，并且与单独的β2ar-wt或存在mbnb80chopq时的β2ar-wt的药理特性大不相同。与单独的β2ar-wt相比，在具有g蛋白样行为的mbnb80chopq存在下(cfrnb80)，β2ar-wt受体对激动剂(肾上腺素，异丙肾上腺素)的亲和力增加，这表明在mbnb80chopq存在下该受体采用活性状态构象(rasmussen等，2011b)。与对照β2ar-wt相比，在存在mbnb80chopq下，β2ar-wt对天然激动剂肾上腺素增加的亲和力，可以从图53(a)中描绘的竞争性结合实验的ic50值的比例来计算，通过将肾上腺素对单独的β2ar-wt的ic50除以肾上腺素对mbnb80chopq存在下的β2ar-wt的ic50高，获得的表观效力转移。mbnb80chopq存在下β2ar-wt对合成激动剂异丙肾上腺素增加的亲和力可以从图53(b)中描绘的竞争性结合实验的ic50值的比例来计算，通过将异丙肾上腺素对β2ar-wt的ic50除以mbnb80chopq存在下异丙肾上腺素对β2ar-wt的ic50高，获得的表观效力转移。总之，我们证明了nb80的功能已保留在mbnb80chopq形式中，此外，由于其保留了对β2ar靶标的抗原结合亲和力，实际上它稳定了β2ar活性状态构象，并且与nb80一样，提供了构象选择性抗原结合。实施例6：从插入离子通道结合纳米抗体的第一个连接β-链ab的β-转角中的chopq支架构建的58kd抗原结合嵌合蛋白的表达和纯化。作为再一个实例，我们着手表达和纯化另一个从插入nb25的第一个连接β链a和b的β-转角中的chopq构建的58kd抗原结合嵌合蛋白，nb25结合五聚配体门控的离子通道gabaa(miller等，2017)。称为mbnb25chopq的58kdmegabody是根据图2和3连接的单结构域免疫球蛋白的部分和支架蛋白的部分连结的嵌合多肽。在此，使用的免疫球蛋白结构域是nb25(seqidno:28)，结合gabaaβ3亚基的胞外结构域(miller等，2017)。将所有部分以以下给出的顺序通过肽键(seqidno:29)彼此从氨基末端连接羧基末端：抗gfp纳米抗体的β-链a(seqidno:1的1-13)，hopq的c-末端部分(seqidno:19的残基192-414)，连接hopq的c-末端和n-末端以产生支架蛋白的环状排列的短肽接头(seqidno:21)，hopq的n-末端部分(seqidno:19的残基14-186)，nb25的β-链b至g(seqidno:28的残基16-125)，6xhis标签/epea标签。为了在大肠杆菌的周质中表达mbnb25chopq，并将这种重组蛋白纯化至均质，如实施例4下所述的，通过pcr扩增编码来自β-链b至g的nb25的dna片段(使用引物seqidno:122和seqidno:123)并在pmesd2载体中作为sapi片段克隆。这个质粒指引his标记和epea标记的mbnb25chopq(seqidno:29)在大肠杆菌中周质中在plac启动子的转录控制下表达。与之前实施例的megabodies相似，还按照实施例2中所述的在大肠杆菌周质中表达了mbnb25chopq，并纯化至均质。此外，纯化的mbnb25chopq结合gabaaβ3亚基的胞外结构域。实施例7.通过体外选择设计和产生从插入gfp特异性纳米抗体的第一个连接β-链ab的β-转角中的c7hopq构建的其他58kd抗原结合嵌合蛋白。由于折叠的能力以及megabodies的稳定性和刚性可能依赖于连接免疫球蛋白与支架的多肽键的组成和长度，因此我们引入了体外进化技术来对特定的megabody格式进行微调，如果需要。从实施例1中描述的megabody开始，我们使用相似设计构建了编码megabody的文库，其中两个可变长度和混合氨基酸组成的短肽将纳米抗体连接至根据图2的支架，这些适合体外选择。在此所述的58kdamegabody是根据图2通过短多肽键连接的单结构域免疫球蛋白的部分和支架蛋白的部分连结的嵌合多肽。在此，使用的免疫球蛋白是如seqidno:1中所示的结合gfp的纳米抗体。将所有部分以以下给出的顺序通过肽键(seqidno:30-33)彼此从氨基末端连接羧基末端：抗gfp纳米抗体的β-链a(seqidno:1的1-12)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，hopq的c-末端部分(seqidno:19的残基193-414)，连接hopq的c-末端和n-末端以产生支架蛋白的环状排列chopq的肽接头(seqidno:21)，hopq的n-末端部分(seqidno:19的残基15-186)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，抗gfp纳米抗体的β-链b至g(seqidno:1的残基11-126)，6xhis标签和epea标签。为了展示和选择实施例1、2&3中描述的megabody的功能变体，这些变体的差异在于连接纳米抗体与酵母上的支架的接头的组成和长度不同，我们使用标准方法构建了一个开放阅读框文库，所述开放阅读框编码根据图8与许多辅助肽和蛋白质融合的各种megabodies(seqidno:34-37)：指导酵母中胞外分泌的apps4前导序列(rakestraw，2009)，抗gfp-纳米抗体的β链a(seqidno:1的1-12)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，hopq的c-末端部分(seqidno:19的残基193-414)，连接hopq的c-末端和n-末端以产生支架蛋白的环状变体的短肽接头(seqidno:21)，hopq的n-末端部分(seqidno:19的残基15-186)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，抗gfp-纳米抗体的β链b至g(seqidno:1的残基11-126)，柔性(ggsg)n肽接头，通过aga1p蛋白的二硫键连接酵母细胞壁的酵母凝集素蛋白aga2p的aga2p粘附亚基，然后是用于展示的融合蛋白正交荧光染色的酰基载体蛋白(johnsson，2005)和myc标签。将这些开放阅读框在半乳糖诱导型gal1/10启动子的转录控制下放入pctcon2载体中(chao，2006)，以构建酵母展示文库，该文库编码实施例1、2和3中所述的184.000种不同的megabody变体(参见图8)。为了进行体外选择，将这个文库引入酵母株eby100中。使转化的细胞在富含半乳糖的培养基中生长并诱导过夜。使用sfp合酶(1μm)，用coa-647(2μm)对诱导的细胞进行正交染色，并与100nmgfp孵育。接下来，将这些细胞洗涤并进行2-参数facs分析，以鉴定出展示高水平的特定megabody(高coa-647荧光)并结合抗原gfp(高gfp荧光)的酵母细胞。分选出展示高水平gfp结合纳米抗体的细胞，并在富含葡萄糖的培养基中进行扩增，以通过酵母展示和两参数facs分析进行以后几轮的选择。一轮选择后，将coa-647和gfp通道中代表性数量的高荧光细胞作为单个菌落生长，并进行dna测序，以确定代表性数量的连接纳米抗体与支架蛋白的肽接头的序列。在facs实验中，具有1-1、1-2、2-1和2-2个氨基酸短接头变体的每种类型接头的四个代表性克隆(表2)被证实与100nmgfp结合(图30)。这证明可以通过体外选择从megabody文库选择抗原结合结构域和支架蛋白之间的不同短肽连接，并展示为功能性抗原结合嵌合蛋白。由于我们能够在酵母表面上展示megabody的功能变体(上文)，因此我们着手在大肠杆菌周质中表达了四个1-1个氨基酸短接头代表性megabody克隆(表2中的mp1331_a5，mp1331_a12，mp1331_b7和mp1331_g10)，将这些嵌合体纯化至同质并确定其特性。基本上按照实施例2中所述的来产生megabodymbnb207c7hopq的四个变体(mbnb207c7hopqa5，mbnb207c7hopqa12，mbnb207c7hopqb7，mbnb207c7hopqg10)和具有短(c7；参见实施例23)环状排列的野生型(mbnb207c7hopq)：mbnb207c7hopq(seqidno:136)：抗gfp-纳米抗体的保守n-末端的β链a(seqidno:1的1-13)，hopq的c末端部分(seqidno:19的残基192-411)，hopq的n-末端部分(seqidno:19的残基18-186)，抗gfp-纳米抗体的β链b至g(seqidno：1的残基16-126)，6xhis标签和epea标签。四个mbnb207c7hopq变体(seqidno:137-140)：抗gfp-纳米抗体的保守n-末端的β链a(seqidno：1的1-12)，一个氨基酸接头(表2)，hopq的c-末端部分(seqidno:19的残基193-411)，hopq的n-末端部分(seqidno:19的残基18-185)，一个氨基酸接头(表2)，抗gfp-纳米抗体的β链b到g(seqidno:1的残基17-126)，6xhis/epea标签。按实施例2所述的，在大肠杆菌中表达这些megabodies(seqidno:136-140)，并纯化。然后将浓缩的样品上样至superdex200pg10/300大小排阻色谱柱上，作为具有约60kda的表观分子量的同质的可溶性蛋白样品洗脱(图31)。通过酶联免疫吸附测定(elisa)分析了纯化的重组megabodies(seqidno:136-140)的功能特性。将纯化的gfp以碳酸氢钠缓冲液ph8.2中0.1μg/孔的浓度固定在maxisorp微量滴定板(nunc)的孔中。在室温下用pbs中的乳将孔中的残留蛋白结合位点阻断两小时。将纯化的megabody样品在gfp包被和未包被的孔中孵育。洗涤步骤后，使用特异性识别仅存在于megabody上的epea标签的捕获选择(captureselect)生物素化抗体(lifetechnologies)来检查megabodies与gfp的结合。随后用链霉亲和素碱性磷酸酶(promega)进行捕获选择生物素化抗体的检测。加入酶底物p-硝基苯基磷酸酯后，测量了405nm处的吸收。将固定的gfp与无gfp条件进行比较，检测到的信号显示每个megabody的信号至少高10倍。elisa和sec数据表明，可以将纯化的重组megabodies(seqidno:136-140)纯化至同质并与gfp形成复合物(图31和32)。表2.连接支架蛋白hopq与纳米抗体的酵母展示优化的接头肽的组成和长度实施例8：通过体外选择设计和产生从插入gfp特异性纳米抗体的第一个暴露的β-转角(连接β-链a和b)中的cygjk构建的100kd抗原结合嵌合蛋白。或者，设计从连接更大支架的纳米抗体构建的megabody。根据图2和9构建了用于体外选择的编码megabody变体的文库，其中两个短肽连接纳米抗体与另一个支架。设计的100kdamegabodies是根据图2通过短多肽接头连接的单结构域免疫球蛋白的部分和支架蛋白的部分连接的嵌合多肽。使用的免疫球蛋白是如seqidno:1中所示的结合gfp的纳米抗体。使用的替换支架蛋白是ygjk，其是大肠杆菌的86kda周质蛋白(pdb3w7s，seqidno:38)。将所有部分以以下给出的顺序通过肽键(seqidno:39-42)彼此从氨基末端连接羧基末端：抗gfp纳米抗体的β-链a(seqidno:1的残基1-12)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，ygjk的c-末端部分(seqidno:38的残基464-760)，连接ygjk的c-末端和n-末端以产生支架蛋白的环状排列的短肽接头(seqidno:43)，ygjk的n-末端部分(seqidno:38的残基1-461)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，抗gfp纳米抗体的β-链b至g(seqidno:1的残基17-126)。为了展示和选择mbnb207cygjkq随机接头的功能变体(seqidno:39-42)，这些变体的差异在于连接纳米抗体与酵母上的支架的接头的组成和长度不同，我们使用标准方法构建了一个开放阅读框文库，所述开放阅读框编码与许多辅助肽和蛋白质融合的各种megabodies(seqidno:44-47)：指导酵母中胞外分泌的apps4前导序列(rakestraw，2009)，抗gfp-纳米抗体的β链a(seqidno:1的1-12)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，ygjk的c-末端部分(seqidno:38的残基464-760)，连接ygjk的c-末端和n-末端以产生支架蛋白的环状变体的短肽接头(seqidno:43)，ygjk的n-末端部分(seqidno:38的残基1-461)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，抗gfp-纳米抗体的β链b至g(seqidno:1的残基17-126)，柔性(ggsg)n肽接头，通过aga1p蛋白的二硫键连接酵母细胞壁的酵母凝集素蛋白aga2p的aga2p粘附亚基，然后是用于展示的融合蛋白正交荧光染色的酰基载体蛋白(johnsson，2005)和myc标签。将这些开放阅读框在半乳糖诱导型gal1/10启动子的转录控制下放入pctcon2载体中(chao，2006)，以构建酵母展示文库，该文库编码184.000种mbnb207cygjkq随机接头的不同变体(seqidno:39-42)。为了进行体外选择，将这个文库引入酵母株eby100中。使转化的细胞在富含半乳糖的培养基中生长并诱导过夜。使用sfp合酶(1μm)，用coa-647(2μm)对诱导的细胞进行正交染色，并与100nmgfp孵育。接下来，将这些细胞洗涤并进行2-参数facs分析，以鉴定出展示高水平的特定megabody(高coa-647荧光)并结合抗原gfp(高gfp荧光)的酵母细胞。分选出展示高水平gfp结合纳米抗体的细胞，并在富含葡萄糖的培养基中进行扩增，以进行通过酵母展示和两参数facs分析进行以后几轮的选择。两轮选择后，将coa-647和gfp通道中代表性数量的高荧光细胞作为单个菌落生长，并进行dna测序，以确定代表性数量的连接纳米抗体与支架蛋白的肽接头的序列。在facs实验中，每种接头类型(长度)1-1、1-2、2-1和2-2个氨基酸短接头变体的一个或两个代表性克隆(表3)被证实与100nmgfp结合(图33)。这证明可以通过体外选择从megabody文库选择抗原结合结构域和支架蛋白之间的不同短肽连接，并展示为功能性抗原结合嵌合蛋白。由于我们能够在酵母表面上展示mbnb207cygjkq的功能变体(上文)，因此我们着手在大肠杆菌周质中表达每种氨基酸短接头代表性megabody克隆的一个克隆(表3中的mp1333_e2，mp1333_a2，mp1333_c4和mp1333_f5)。作为具有以下氨基酸序列的嵌合多肽产生了由酵母展示选择的四个mbnb207cygjkq变体：mbnb207cygjke2(seqidno:141)：抗gfp-纳米抗体的β链a(seqidno:1的1-12)，tyr一氨基酸接头，ygjk的c末端部分(seqidno:38的残基464-760)，连接ygjk的c-末端和n-末端以产生支架蛋白的环状变体的短肽接头(seqidno:43)，ygjk的n-末端部分(seqidno:38的残基1-461)，asp一氨基酸接头，抗gfp-纳米抗体的β链b至g(seqidno：1的残基17-126)，6xhis标签/epea标签。对于其他megabodies获得了相似的构建体，接头性质中存在差异：mbnb207cygjka2(seqidno:142)：glu1-氨基酸接头，gly-asp2-氨基酸接头；mbnb207cygjkc4(seqidno:143)：met-tyr2-氨基酸接头，asn1-氨基酸接头，mbnb207cygjkf5(seqidno:144)：trp-thr2-氨基酸接头，gly-ala2-氨基酸接头。使用修饰的pmesd2载体，按照实施例2中所示的，在大肠杆菌中表达了mbnb207cygjk变体(seqidno:141-144)。这种新的载体(称为pmesp3)含有编码以下多肽的开放阅读框：指引megabody分泌至大肠杆菌周质中的pelb前导序列，nbgfp207的β链a，ygjk的环状排列变体，任何纳米抗体的c-末端部分(从β链b到β链g)，6xhis标签和epea标签，接着是amber终止密码子。使用四种mbnb207cygjk变体中的每一种的周质提取物，按照实施例7中所述的，通过elisa分析了表达的megabodies的功能特性。对使用和未用固定的gfp的样品的检测信号的比较(图34)清楚地证实了功能性mbnb207cygjk变体的周质表达(seqidno:141-144)。按照实施例2中所示的，使用imac，接着sec，将表示1-1氨基酸短接头变体的mbnb207cygjke2(seqidno:141)进一步纯化至同质(图35)。通过测量了纯化的mbnb207cygjke2(seqidno:141)的gfp结合动力学，并与nbgfp207纳米抗体(seqidno:1)和mbnb207chopq(seqidno:20)进行比较(图24)。计算的结合亲和性证实了从环状排列的hopq或ygjk支架蛋白构建的抗原结合嵌合蛋白没有干扰初始单结构域免疫球蛋白的结合特性。表3.连接支架蛋白ygjk与纳米抗体的酵母展示优化的接头肽的组成和长度。megabody克隆连接#1连接#2mp1333_e2ydmp1333_e6ladmp1333_c4mynmp1333_a2egdmp1333_d6fgamp1333_f5wtgamp1333_c2fmpa实施例9：从插入gfp特异性纳米抗体的第一个连接β-链ab的β-转角中的c/c7hopq构建的58kda抗原结合嵌合蛋白的设计和产生，通过额外的连接支架与纳米抗体的二硫化物进一步刚性化。我们根据图10通过工程化连接抗原结合结构域(在此为免疫球蛋白结构域)与支架的额外二硫键进一步研发了甚至更高刚性的抗原结合嵌合蛋白。因此，根据图2和10，我们使用了定点诱变来产生mbnb207chopq的突变体，其中两个短肽和一个二硫键连接纳米抗体与支架。在此描述的58kdamegabodies是根据图2和10通过短多肽连接和二硫键连接的单结构域免疫球蛋白的部分和支架蛋白的部分连结的嵌合多肽。在此，使用的免疫球蛋白是如seqidno:1中所示的结合gfp的纳米抗体。支架蛋白是称为hopq的幽门螺杆菌株g27的粘附素结构域(pdb:5lp2，seqidno:19)。将所有部分以以下给出的顺序通过肽键(seqidno:48-50)彼此从氨基末端连接羧基末端：抗gfp纳米抗体的β-链a(seqidno:1的1-13)，hopq的c-末端部分(seqidno:19的残基192-414)，连接hopq的c-末端和n-末端以产生支架蛋白的环状排列(chopq)的短肽接头(seqidno:21)，其中一个残基被半胱氨酸替代的hopq的n-末端部分(seqidno:19的残基14-186)，其中一个残基被半胱氨酸替代的纳米抗体的β-链b至g(seqidno:1的残基16-126)，6xhis/epea标签。从抗gfp纳米抗体的β-链a(seqidno:1的1-13)，其中一个残基被半胱氨酸替代的hopq的c-末端部分(seqidno:19的残基192-414)，连接hopq的c-末端和n-末端以产生支架蛋白的环状排列(chopq)的短肽接头(seqidno:21)，hopq的n-末端部分(seqidno:19的残基14-186)，其中一个残基被半胱氨酸替代的纳米抗体的β-链b至g(seqidno:1的残基16-126)，6xhis/epea标签构建了seqidno:51。应用更短的c7hopq环状排列(对于c7hopq：参见实施例23)作为支架蛋白设计了更多构建体：从抗gfp纳米抗体的β-链a(seqidno:1的1-13)，hopq的c-末端部分(seqidno:19的残基192-411)，其中一个残基被半胱氨酸替代的hopq的n-末端部分(seqidno:19的残基18-186)，其中一个残基被半胱氨酸替代的纳米抗体的β-链b至g(seqidno:1的残基16-126)，6xhis/epea标签构建了seqidno:146-150。从抗gfp纳米抗体的β-链a(seqidno:1的1-13)，其中一个残基被半胱氨酸替代的hopq的c-末端部分(seqidno:19的残基192-411)，hopq的n-末端部分(seqidno:19的残基18-186)，其中一个残基被半胱氨酸替代的纳米抗体的β-链b至g(seqidno:1的残基16-126)，6xhis标签和epea构建了seqidno:145。按照实施例2中所述的，总共从大肠杆菌表达和纯化了10个megabody变体(mbnb207chopqcys1-4(seqidno:48-51)和mbnb207c7hopqcys5-10(seqidno:145-150)。按照实施例7中所述的，通过elisa分析了这些纯化的重组megabodies的功能特性。对使用和未用固定的gfp的样品的检测信号的比较(图36)清楚地证实了从大肠杆菌周质纯化的mbnb207chopqcys1-4(seqidno:48-51)和mbnb207c7hopqcys5-10(seqidno:145-150)的功能性。为了测量引入的另外的二硫化物对这些工程化的megabody变体的热稳定性的作用，我们进行了热位移试验(tsa)并按照之前所述的(hunynh等，2015)计算了每种megabody变体的解链温度(tm)。因此，将0.2mg/ml每种凝胶过滤纯化的megabody变体在140mmnacl和10mmtrisph7.3缓冲液中与syproorange染料(sigma)混合。接着，在25至100℃的温度范围中在bio-radcfx96仪器上通过实时pcr一式三份地测量了20μl样品的荧光。使用boltzmnann等式通过graphpadprism软件计算了单独的tm值(表4)。对于mbnb207chopqc15-c534(seqidno:51)、mbnb207c7hopqc14-c512(seqidno:145)、mbnb207c7hopqc316-c472(seqidno:147)和mbnb207c7hopqc314-c472(seqidno:148)，与野生型megabody相比，解链温度分别提高10.9℃、3.43℃、4.29℃和6.14℃，表明形成了这些二硫键，并且刚性化了megabodies。表4.mbnb207c/c7hopq半胱氨酸变体的解链温度(tm)megabody克隆tm[℃]mbnb207chopq48.7mbnb207chopqc357-c42549mbnb207chopqc358-c488(43.8)*49.5mbnb207chopqc359-c490(44.2)*49.7mbnb207chopqc15-c534(49.4)*59.6mbnb207c7hopq49.74mbnb207c7hopqc14-c51253.17mbnb207c7hopqc402-c47447.01mbnb207c7hopqc316-c47254.02mbnb207c7hopqc314-c472(49.16)*55.88mbnb207c7hopqc312-c45350.34mbnb207c7hopqc349-c45250.03*第一过渡解链温度(参见图36)实施例10：通过体外选择设计和产生从嫁接到azurin上的gfp特异性纳米抗体构建的抗原结合嵌合蛋白。另一种产生刚性抗原结合嵌合蛋白的方式是通过备选的连接方案将免疫球蛋白与其支架连接。因此，构建了图11中所示的编码从通过三个连接纳米抗体与支架的多肽连接嫁接到支架蛋白的纳米抗体构建的megabodies的文库，并且适用于体外选择。在此所述的刚性抗原结合嵌合蛋白是根据图11的通过三个短多肽接头连接的单结构域免疫球蛋白的部分和支架蛋白的部分连结的嵌合多肽。使用的免疫球蛋白是如seqidno:1中所示的结合gfp的纳米抗体。使用的支架蛋白是azurin，小的含有铜的铜绿假单胞菌的单结构域蛋白(pdb2tsa，seqidno:52，与铜绿假单胞菌蛋白相比m121a突变)。将所有部分以以下给出的顺序通过肽键(seqidno:53-60)彼此从氨基末端连接羧基末端：抗gfp纳米抗体的β-链a(seqidno:1的1-12)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，azurin的n-末端部分(seqidno:52的残基3-22)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，抗gfp纳米抗体的β-链b至g(seqidno:1的残基17-126)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，azurin的c-末端部分(seqidno:52的残基31-128)，6xhis和epea标签。为了在酵母上展示和选择其中三个短肽连接纳米抗体与支架的这些结合金属的megabodies的功能性代表(seqidno:53-60)，我们使用标准方法构建了开放阅读框的文库，所述开放阅读框编码与许多辅助肽和蛋白质融合的各种megabodies(seqidno:61-68)：指导酵母中胞外分泌的apps4前导序列(rakestraw，2009)，抗gfp-纳米抗体的β链a(seqidno:1的1-12)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，azurin的n-末端部分(seqidno:52的残基3-22)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，抗gfp-纳米蛋白的链b至g(seqidno:1的残基17-126)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，azurin的c-末端部分(seqidno:52的残基31-128)，柔性(ggsg)n肽接头，通过aga1p蛋白的二硫键连接酵母细胞壁的酵母凝集素蛋白aga2p的aga2p粘附亚基，然后是用于展示的融合蛋白正交荧光染色的酰基载体蛋白(johnsson，2005)和myc标签。将这些开放阅读框在半乳糖诱导型gal1/10启动子的转录控制下放入pctcon2载体中(chao，2006)，以构建酵母展示文库，该文库编码77.280.000个不同的根据图12其中三个短肽并且连接纳米抗体与azurin的megabody变体。为了通过酵母展示和facs的体外选择，将这个文库引入酵母株eby100中。使转化的细胞在cu++的存在下在富含半乳糖的培养基中生长并诱导过夜。使用sfp合酶(1μm)，用coa-647(2μm)对诱导的细胞进行正交染色，并与100nmgfp孵育。接下来，将这些细胞洗涤并进行2-参数facs分析，以鉴定出展示高水平的特定megabody(高coa-647荧光)并结合抗原gfp(高gfp荧光)的酵母细胞。分选出展示高水平gfp结合纳米抗体的细胞，并在富含葡萄糖的培养基中进行扩增，以通过酵母展示和两参数facs分析进行以后几轮的选择。两轮选择后，将coa-647和gfp通道中代表性数量的高荧光细胞作为单个菌落生长，并进行dna测序，以确定代表性数量的连接纳米抗体与支架蛋白的肽接头的序列。在facs实验中，接头类型1-2-1、2-2-1、1-2-2和2-2-2个氨基酸短接头变体的两个代表性克隆(表5)被证实与100nmgfp结合(图37)。这证明可以通过体外选择从megabody文库选择通过三个短多肽接头连接的单结构域免疫球蛋白的部分和支架蛋白的部分连结的megabodies，并其展示为功能性抗原结合嵌合蛋白。由于我们能够在酵母表面上展示mbnb207azurin的功能变体(上文)，因此我们着手在大肠杆菌周质中表达这些抗原结合嵌合蛋白。作为具有以下氨基酸序列的嵌合多肽产生了由酵母展示选择的八个mbnb207azurin变体(表5)：mbnb207azurin变体(seqidno:151-158)：抗gfp-纳米抗体的β链a(seqidno:1的1-12)，氨基酸接头(表5)，azurin的n末端部分(seqidno:52的残基3-22)，氨基酸接头(表5)，抗gfp-纳米抗体的链b至g(seqidno:1的残基17-126)，氨基酸接头(表5)，azurin的c-末端部分(seqidno:52的残基31-128)，6xhis/epea标签。为了在大肠杆菌周质中表达如mbnb207azurin变体(seqidno:151-158)这样的megabodies，我们按照实施例2中所述的，修饰了pmesd2载体。这种新的载体(称为pmesp3)含有编码以下多肽的开放阅读框：指引megabody分泌至大肠杆菌周质中的pelb前导序列，nbgfp207的β链a，azurin的n-末端部分，任何纳米抗体的c-末端部分(从β链b到β链g)，azurin的c-末端部分，6xhis标签和epea标签，接着是amber终止密码子。按照实施例2中所述的在大肠杆菌周质中表达了八个mbnb207azurin变体(seqidno:151-158)。使用八种mbnb207azurin变体中每一种的周质提取物，按照实施例7中所述的，通过elisa分析了表达的megabodies的功能特性。对使用和未用固定的gfp的样品的检测信号的比较(图38)清楚地证实了功能性mbnb207azurin变体(seqidno:151-158)的周质表达。这证明了可以在大肠杆菌周质中功能性地表达通过三个短多肽接头连接的单结构域免疫球蛋白的部分和支架蛋白的部分连结的megabodies。表5.连接支架蛋白azurin与纳米抗体的酵母展示优化的接头肽的组成和长度。megabody克隆连接#1连接#2连接#3seqidno:mp1305_a8nnga151mp1304_d9pngp152mp1304_d10gnggk153mp1305_d11gengn154mp1304_g6gstdg155mp1304_b8gsrtm156mp1304_b2ggngpp157mp1305_c8ringny158实施例11：通过体外选择设计和产生从插入gfp特异性纳米抗体的第一个暴露的β转角中的反向糖苷水解酶的环状排列变体构建的抗原结合嵌合蛋白，以通过体外选择来产生具有结构对称性的同型二聚megabodies。我们通过将nbs嫁接到具有结构对称性的多聚支架蛋白的亚基上进一步设计了多聚megabodies。构建了编码根据图11从通过连接纳米抗体与支架的三个短多肽连接嫁接到大的同型二聚支架蛋白的每个亚基上的纳米抗体构建的megabodies的文库，以通过酵母展示和facs鉴定具有双重对称性的刚性同型二聚megabodies。本文描述的同型二聚megabodies(每个二聚体191kda)是根据图11通过三个短多肽接头连接的单结构域免疫球蛋白的部分和支架蛋白的部分连结的嵌合多肽。使用的免疫球蛋白结构域是如seqidno:1中所示的抗gfp纳米抗体。使用的支架蛋白是susb，其是多形拟杆菌的同型二聚葡聚糖-1,4-α-葡糖苷酶(pdb3wfa，seqidno:69)。根据图13，将所有部分以以下给出的顺序彼此从氨基末端连接羧基末端(seqidno:70-77)：抗gfp纳米抗体的β-链a(seqidno:1的残基1-14)，丝氨酸、具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，susb的n末端部分(seqidno:69的残基1-68)、具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，抗gfp纳米抗体的β-链b至g(seqidno:1的残基15-125)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，susb的c-末端部分(seqidno:69的残基76-718)，6xhis/epea标签。为了在酵母上展示和选择其中三个短肽连接纳米抗体与同型二聚支架的每个亚基的这些同型megabodies的功能性代表(seqidno:70-77)，我们使用标准方法构建了一个开放阅读框文库，所述开放阅读框编码与许多辅助肽和蛋白质融合的各种megabodies(seqidno:78-85)：指导酵母中胞外分泌的apps4前导序列(rakestraw，2009)，抗gfp-纳米抗体的β链a(seqidno:1的残基1-14)，丝氨酸，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，susb的n-末端部分(seqidno:69的残基1-68)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，抗gfp-纳米抗体的β链b至g(seqidno:1的残基15-125)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，susb的c-末端部分(seqidno:69的残基76-738)，柔性(ggsg)n肽接头，通过aga1p蛋白的二硫键连接酵母细胞壁的酵母凝集素蛋白aga2p的aga2p粘附亚基，然后是用于展示的融合蛋白的正交荧光染色的酰基载体蛋白(johnsson，2005)和myc标签。根据图11将这些开放阅读框在半乳糖诱导型gal1/10启动子的转录控制下放入pctcon2载体中(chao，2006)，以构建酵母展示文库，该文库编码77.280.000个其中三个短肽连接纳米抗体与同型二聚支架的每个亚基的megabody的不同变体。为了进行酵母展示和facs的体外选择，将这个文库引入酵母株eby100中。使转化的细胞在ca++的存在下在富含半乳糖的培养基中生长并诱导过夜。使用sfp合酶(1μm)，用coa-647(2μm)对诱导的细胞进行正交染色，并与100nmgfp孵育。接下来，将这些细胞洗涤并进行2-参数facs分析，以鉴定出展示高水平的特定megabody(高coa-647荧光)并结合抗原gfp(高gfp荧光)的酵母细胞。分选出展示高水平gfp结合的细胞，并在富含葡萄糖的培养基中进行扩增，以通过酵母展示和两参数facs分析进行以后几轮的选择。多轮选择后，将coa-647和gfp通道中代表性数量的高荧光细胞作为单个菌落生长，并进行dna测序，以分析以高水平展示并结合抗原的多个megabody变体中连接纳米抗体与susb的接头的长度和组成，表明它们表达良好，可以接受细胞分泌并折叠成功能性结合gfp的嵌合蛋白。将这些同型二聚megabodies中的一种在大肠杆菌周质中表达并纯化至同质。将纯化的蛋白质结晶并在与gfp的复合物中解析其结构。实施例12：通过体外选择设计和产生从插入gfp特异性纳米抗体的第一个暴露的β转角中的pp7的病毒衣壳蛋白的环状排列变体构建的展示纳米抗体的二十面体病毒样颗粒。通过冷冻电镜测定三维结构涉及平均单独粒子的多个拷贝的2d投影图像中存在的信息，这些信息相对于入射电子束方向可变。在二十面体病毒的情况中，尽管每个单独的病毒体都可以视为一个粒子，但是这些结构的对称性使得每个粒子中包含许多相同的不对称单元拷贝，从而将平均来确定结构的有效单元数提高了许多倍。因此，按照衣壳蛋白给予的对称性刚性地排列纳米抗体的二十面体病毒将成为通过冷冻电镜解析小蛋白及其复合物结构的最终工具。在此，我们通过将nbs嫁接到二十面体细菌噬菌体的衣壳蛋白上来设计展示纳米抗体的二十面体病毒样颗粒，所述衣壳蛋白自组装成病毒样颗粒(vlp)。显示了在铜绿假单胞菌的二十面体细菌噬菌体的pp7衣壳蛋白的连接二聚体的90个拷贝或180个衣壳蛋白可以在大肠杆菌中过表达时自组装，形成二十面体病毒样颗粒(vlp)(o'rourke等人，2015年)。在这些vlp中，衣壳蛋白与一种单体的n-末端成对缠绕，该单体非常接近交错单体的c-末端。还已经证明了可以将肽插入该二聚体的暴露环中以在相应的vlp的表面上展示这个肽。因此，我们构建了编码刚性抗体嵌合体的随机文库，该嵌合体是从嫁接到pp7衣壳蛋白的串联二聚体上的纳米抗体构建的，其中根据图2两个短肽连接纳米抗体与支架。本文所述的3.9mda二十面体病毒样颗粒是由嵌合多肽自组装而成的，所述嵌合多肽是根据图14从直接连接的单结构域免疫球蛋白的部分和支架蛋白的部分构建的。使用的免疫球蛋白是如seqidno:1中所示的gfp结合纳米抗体。使用的支架蛋白是pp7的衣壳蛋白(pdb：1dwn，seqidno:2)的共价二聚体的环状排列形式。pp7是铜绿假单胞菌的二十面体rna细菌噬菌体。将所有部分以以下给出的顺序彼此从氨基末端连接羧基末端(seqidno：3-6)：由起始密码子编码的甲硫氨酸，抗gfp-纳米抗体的β链a(seqidno:1的残基1-13)，pp7衣壳蛋白(seqidno:2的残基12-128)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，甘氨酸，pp7衣壳蛋白(seqidno:2的残基12-128)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，甘氨酸，pp7衣壳蛋白(seqidno:2的残基2-8)，gfp结合纳米抗体的β链b至g(seqidno:1的残基16-126)，6xhis/epea标签。这种刚性的抗原结合嵌合蛋白自组装成二十面体vlp(nanovlp)，其在其表面上展示纳米抗体的90个拷贝(图14)。为了选择这些自组装成nanovlp的工程化gfp结合衣壳蛋白的功能性代表，我们使用标准方法构建了一个开放阅读框文库(seqidno:3-6)，其包含甲硫氨酸，抗gfp-纳米抗体的β链a，环状排列的二聚pp7衣壳蛋白，gfp结合纳米抗体的β链b至g，6xhis/epea标签。将这些dna片段作为ndei-ecori片段在pmesp载体(refca12729，pmes4衍生物，genbankgq907248，其中除去了lgui位点)中克隆，以替代pelb信号肽、任何nb序列和所有检测标签，包括基因3。将这种新形成的文库称为pcpp72nbgfp207l。为了选择可以重组表达并在体外组装以形成二十面体病毒样颗粒的重组gfp结合pp7衣壳蛋白，在质粒水平上构建嵌合二聚体文库。这些文库用于转化大肠杆菌细胞。可以组装成nanovlp的嵌合二聚体在大肠杆菌中表达，并接受色谱选择。对文库进行imac纯化，以选择表达嵌合二聚体并可以组装成vlp的这些克隆。由于每个具有装配能力的vlp将编码纳米抗体-衣壳蛋白的核酸封装在其外壳中，因此我们通过源自那些nanovlp的rna的rt-pcr扩增了克隆。将表达抗原结合嵌合蛋白的几个克隆作为单个菌落生长，并进行dna测序，以确定将第一个pp7衣壳蛋白连接下一个pp7的肽接头的序列，并确定环状排列肽接头的序列。按照实施例7中所述的，对携带全长构建体的各个克隆进行elisa，以鉴定结合gfp的克隆(图39)。这证明了可以从文库中选出通过多肽接头连接的单结构域免疫球蛋白的部分和(环状排列的)pp7衣壳蛋白的部分连结的抗原结合嵌合蛋白作为功能性抗原结合嵌合蛋白。表6给出了具有不同接头变体的代表性克隆。表6.pp7衣壳蛋白与纳米抗体的直接连接(无氨基酸)和pp7衣壳蛋白之间的接头。megabody克隆连接#1接头#1连接#2接头#2seqidmp1403_a3-gl-rg159mp1403_d3-r-pg160mp1403_g5-gv-lg161mp1403_e6-w-pg162mp1403_d7-r-gpg163mp1403_a9-cr-rg164mp1403_b9-rv-plg165实施例13：通过体外选择设计和产生从插入溶菌酶特异性纳米抗体的第一个暴露的β-转角中的ms2的病毒衣壳蛋白的环状排列变体构建的展示纳米抗体的二十面体病毒样颗粒。根据图15，此处描述的3.9mda二十面体病毒样颗粒由嵌合多肽自组装而成，该嵌合多肽是从通过短多肽接头连接的单结构域免疫球蛋白的部分和支架蛋白的部分构建的。使用的免疫球蛋白是溶菌酶结合纳米抗体(pdb：1mel，seqidno:7)。使用的支架蛋白是ms2的衣壳蛋白的共价二聚体的环状排列形式(pdb：2ms2，seqidno:2)。ms2是大肠杆菌的二十面体rna细菌噬菌体。将所有部分以以下给出的顺序彼此从氨基末端连接羧基末端(seqidno:9-13)：由起始密码子编码的甲硫氨酸，纳米抗体的β链a(抗gfp纳米抗体的β链a，残基1-12)，具有随机组成的两个氨基酸的环状排列接头，ms2衣壳蛋白(seqidno:8的残基17-130；接着是seqidno:8的残基2-130和seqidno:8的残基2-14)，溶菌酶结合纳米抗体的β链b至g(seqidno:7的残基17-133)，6xhis/epea标签。这种刚性的抗原结合嵌合蛋白自组装成二十面体vlp，其在其表面上展示纳米抗体的90个拷贝(图15)。为了选择这些自组装成nanovlp的工程化溶菌酶结合衣壳蛋白的功能性代表，我们使用标准方法构建了一个开放阅读框文库(seqidno:9-13)，其包含甲硫氨酸，抗gfp-纳米抗体的β链a，环状排列的二聚ms2衣壳蛋白，溶菌酶结合纳米抗体的β链b至g，6xhis/epea标签。将这些dna片段作为ndei-ecori片段在pmesp载体(refca12729)中克隆。将这种新形成的质粒文库称为pcms22cablys3l。为了选择可以重组表达并在体外组装以形成二十面体病毒样颗粒的重组溶菌酶结合ms2衣壳蛋白，在质粒水平上构建了nanovlp的文库。这些文库用于转化大肠杆菌细胞。nanovlp在大肠杆菌中表达，并接受针对vlp组装的色谱选择。由于每个具有装配能力的vlp将编码纳米抗体-衣壳蛋白的核酸封装在其外壳中，通过源自那些可以通过沉淀接着大小排阻色谱纯化的nanovlp的rna的rt-pcr测序揭示了通过针对装配的选择富集了基因。使用溶菌酶进行亲和性选择时，从特异性结合溶菌酶的那些nanovlp分离了rna并扩增。将一些具有装配能力的溶菌酶特异性的从这些溶菌酶结合ms2衣壳蛋白构建的nanovlp纯化至同质，并在溶菌酶存在和不存在下通过单颗粒冷冻电镜进行分析。实施例14：通过体外选择设计和产生从插入gfp特异性纳米抗体的第一个暴露的β-转角中的ap205的天然排列的病毒衣壳蛋白构建的展示纳米抗体的二十面体病毒样颗粒。本文所述的二聚体由嵌合多肽自组装而成，所述嵌合多肽是根据图40从通过短多肽接头连接的单结构域免疫球蛋白的部分和支架蛋白的部分构建的。使用的免疫球蛋白是gfp结合纳米抗体(seqidno:1)。使用的支架蛋白是ap205的衣壳蛋白的共价二聚体(pdb：5fs4，seqidno:166)。ap205是不动杆菌属(acinetobacter)细菌的二十面体rna细菌噬菌体。ap205衣壳蛋白二聚体采用保守的光滑病毒科(leviviridae)衣壳蛋白折叠，但n-末端区域除外，后者在其他已知的单链rna噬菌体中形成β-发夹。ap205在由n-和c-末端β链形成的相同位置处具有相似的结构，使得与其他衣壳蛋白相比，其为环状排列。所述排列使衣壳蛋白末端移动到组装粒子的最表面暴露部分，这解释了其对长n-和c-末端融合体的耐受性增强(shishovs等，2016)将所有部分以以下给出的顺序彼此从氨基末端连接羧基末端(seqidno:167)：由起始密码子编码的甲硫氨酸，纳米抗体的β-链a(抗gfp纳米抗体的β-链a，残基1-11)，一个氨基酸的随机接头，ap205衣壳蛋白二聚体(seqidno:166的残基4-128；接着是seqidno:166的残基4-126)，gfp结合纳米抗体的β-链b至g(seqidno:1的残基16-126)，6xhis/epea标签。为了选择这样的抗原结合嵌合蛋白的功能性代表，我们使用标准方法构建了开放阅读框的文库，所述开放阅读框包含甲硫氨酸、抗gfp纳米抗体的β-链a、二聚ap205衣壳蛋白、gfp结合纳米抗体的β-链b至g、6xhis/epea标签。将这些dna片段作为ndei-ecori片段在pmesp载体(refca12729)中克隆。将这种新形成的质粒称为pmesap2052xxpnbgfp207。为了选择可以在体外重组表达并正确装配的抗原结合嵌合(ap205)蛋白，在质粒水平构建了抗原结合嵌合蛋白的文库。将这些文库用于转化大肠杆菌细胞。为了鉴定正确装配成嵌合二聚体的嵌合蛋白，按照实施例7中所述的，在大肠杆菌中表达了单独的克隆，并进行elisa来筛选结合gfp的克隆(图41)。将表达结合gfp的mbnb207ap205x2xx的几个克隆作为单个菌落生长并接受dna测序以确定连接纳米抗体与支架蛋白的肽接头的序列。这证明了可以从文库选择通过两个短多肽接头连接的单结构域免疫球蛋白的部分和病毒ap205衣壳蛋白的部分连结的抗原结合嵌合蛋白作为功能性抗原结合嵌合蛋白。表7中给出了1-1氨基酸短接头变体的代表性克隆。我们发现这些抗原结合嵌合蛋白中的一些自装配成在表面上展示纳米抗体的90个拷贝的二十面体vlp。表7.连接ap205衣壳蛋白与纳米抗体的接头肽的组成。实施例15：通过体外选择设计和产生从插入gfp特异性纳米抗体的第一个连接β链a和b的β-转角中的ap205的衣壳蛋白构建的两条多肽链组成的二聚抗原结合嵌合蛋白。本文所述的二聚体由嵌合多肽自装配而成，所述嵌合多肽是根据图42从通过短多肽接头连接的单结构域免疫球蛋白的部分和支架蛋白的部分构建的。使用的免疫球蛋白是gfp结合纳米抗体(seqidno:1)。使用的支架蛋白是ap205(pdb：5fs4，seqidno:166)。ap205单体装配成二聚体或vlp时，一个单体的n-末端靠近第二个单体的c-末端，反之亦然。为了获得功能性抗原结合嵌合体，第一个单体的β链a需要结合第二个单体的gfp结合纳米抗体的β链b至g，且第二个单体的gfp结合纳米抗体的β链b至g需要结合第一个单体的β链a，以装配成二聚抗原结合嵌合蛋白。将所有部分以以下给出的顺序彼此从氨基末端连接羧基末端(seqidno:173)：由起始密码子编码的甲硫氨酸，纳米抗体的β-链a(抗gfp纳米抗体的β-链a，残基1-11)，一个氨基酸的随机接头，ap205衣壳蛋白(seqidno:166的残基4-126)，gfp结合纳米抗体的β-链b至g(seqidno:1的残基16-126)，6xhis/epea标签。为了选择这样的二聚抗原结合嵌合蛋白的功能性代表，我们使用标准方法构建了开放阅读框的文库，所述开放阅读框包含甲硫氨酸、抗gfp纳米抗体的β-链a、单体ap205衣壳蛋白、gfp结合纳米抗体的β-链b至g、6xhis/epea标签。将这些dna片段作为ndei-ecori片段在pmesp载体中克隆。将这种新形成的质粒称为pmesap2051xxpnbgfp207。为了选择可以在体外重组表达并正确装配的二聚抗原结合嵌合蛋白，在质粒水平构建了二聚抗原结合嵌合蛋白的这些文库。将这些文库用于转化大肠杆菌细胞。为了鉴定正确装配成二聚体的嵌合蛋白，按照实施例7中所述的，在大肠杆菌中表达了单独的克隆，并进行elisa来筛选结合gfp的克隆(图43)。将表达结合gfp的mbnb207ap205xx的二聚体的几个克隆作为单个菌落生长并接受dna测序以确定连接纳米抗体与支架蛋白的肽接头的序列。这证明了可以从文库选择通过两个短多肽接头连接的单结构域免疫球蛋白的部分和病毒ap205衣壳蛋白的部分连结的二聚抗原结合嵌合蛋白作为功能性二聚抗原结合嵌合蛋白。表8中给出了1-1氨基酸短肽接头变体的代表性克隆。表8.连接ap205衣壳蛋白与纳米抗体的接头肽的组成。实施例16：通过体外选择设计和产生从插入gfp特异性纳米抗体的第一个连接β链ab的β-转角中的acp构建的抗原结合嵌合蛋白。基于我们第一种megabodies的成功设计，我们还测试了免疫球蛋白结构域是否还可以通过刚性嫁接到支架上，所述支架用待用于诊断、成像或其他生物物理应用中的荧光团、染料、离子或金属标记。因此，我们构建了编码刚性抗体嵌合体的随机文库，所述嵌合体从嫁接到acp上的纳米抗体构建，其中根据图2两个短肽连接纳米抗体与支架(但不需要支架中的环状排列)，以产生通过使用coa和sfp合酶的荧光衍生物可以正交标记至特定丝氨酸(图16)的刚性抗原结合嵌合蛋白(yin等，2006)。在此所述的nanotool是根据图2通过短多肽接头连接的单结构域免疫球蛋白的部分和支架蛋白的部分连结的嵌合多肽。在这种特别的megabody中，不需要支架蛋白的环状排列，因为野生型acp的n-末端和c-末端彼此接近并且对于工程化连接纳米抗体与acp的两个短多肽接头位置良好(图16)。使用的免疫球蛋白是如seqidno:1中所示的gfp结合纳米抗体。支架蛋白是大肠杆菌的酰基载体蛋白(pdb:1t8k，seqidno:86)，缩写为acp。根据图2，将所有部分以以下给出的顺序通过肽键彼此从氨基末端连接羧基末端(seqidno:87-90)：抗gfp纳米抗体的β-链a(seqidno:1的残基1-11)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，acp(seqidno:86的残基2-76)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，纳米抗体的β-链b至g(seqidno:1的残基17-126)，6xhis/epea标签。为了在酵母上展示和选择其中两个短肽连接纳米抗体与acp的这些nanotools的功能性代表(seqidno:87-90)，我们使用标准方法构建了开放阅读框的文库，所述开放阅读框编码与许多辅助肽和蛋白质融合的各种mbnb207acptoolbodies(seqidno:91-94)：指导酵母中胞外分泌的apps4前导序列(rakestraw，2009)，抗gfp-纳米抗体的β链a(seqidno:1的残基1-11)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，acp(seqidno:86的残基2-76),具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，纳米抗体的β链b至g(seqidno:1的残基17-126)，柔性(ggsg)n肽接头，通过aga1p蛋白的二硫键连接酵母细胞壁的酵母凝集素蛋白aga2p的aga2p粘附亚基，然后是myc标签。将这些开放阅读框在半乳糖诱导型gal1/10启动子的转录控制下放入pctcon2载体中(chao，2006)，以构建酵母展示文库，该文库编码77.280.000个不同的根据图16其中两个短肽连接纳米抗体与acp支架的nanotool变体。为了进行通过酵母展示和facs的体外选择，将这个文库引入酵母株eby100中。使转化的细胞在富含半乳糖的培养基中生长并诱导过夜。使用sfp合酶(1μm)，用coa-647(2μm)对诱导的细胞进行正交染色，并与100nmgfp孵育。接下来，将这些细胞洗涤并进行2-参数facs分析，以鉴定出展示高水平的特定nanotool(高coa-647荧光)并结合抗原gfp(高gfp荧光)的酵母细胞。分选出展示高水平gfp结合的细胞，并在富含葡萄糖的培养基中进行扩增，以接受通过酵母展示和两参数facs分析的以后几轮选择。一轮选择后，将coa-647和gfp通道中代表性数量的高荧光细胞作为单个菌落生长，并进行dna测序，以确定代表性数量的连接纳米抗体与支架蛋白的肽接头的序列。在facs实验中，具有1-1、2-1和2-2氨基酸短接头变体的两个代表性克隆(表9)被证实与100nmgfp结合(图44)。这证明可以从megabody文库选择通过两个短多肽接头连接的单结构域免疫球蛋白的部分和酰基载体蛋白的部分连结的nanotools，并且其展示为功能性抗原结合嵌合蛋白。由于我们能够在酵母表面上展示mbnb207acpnanotool的功能变体(上文)，因此我们着手在大肠杆菌周质中表达这些抗原结合嵌合蛋白。作为具有以下氨基酸序列的嵌合多肽产生了六个由酵母展示选择的mbnb207acpnanotool变体(表9)：mbnb207acp变体(seqidno:178-183)：抗gfp-纳米抗体的β链a(seqidno:1的残基1-11)，氨基酸接头(连接#1表9)，acp(seqidno:86的残基2-76)，氨基酸接头(连接#2表9)，纳米抗体的β链b至g(seqidno：1的残基17-126)，6xhis/epea标签。为了在大肠杆菌中表达那些变体，按照实施例2中所述的，修饰了pmesd2。这种新的载体(称为pmesp2)含有开放阅读框，其编码以下多肽：指引nanotool分泌至大肠杆菌周质中的pelb前导序列，nbgfp207的β链a，acp，任何纳米抗体的c-末端部分(从β链b至β链g)，6xhis/epea标签，接着是amber终止密码子。按照实施例2中所述的，表达了六个mbnb207acpnanotool变体(seqidno:178-182)。接着按照实施例7中所述的，使用六个mbnb207acpnanotool变体中每一个的周质提取物，通过elisa分析了表达的nanotools的功能特性。对使用和未用固定的gfp的样品的检测信号的比较(图45)清楚地证实了功能性mbnb207acpnanotool变体的周质表达。这证明了可以在大肠杆菌周质中功能性地表达通过两个短多肽接头连接的单结构域免疫球蛋白的部分和酰基载体蛋白的部分连结的nanotool。表9.连接支架蛋白酰基载体蛋白与纳米抗体的酵母展示优化的接头肽的组成和长度。实施例17：使用噬菌体展示通过体外选择设计和产生从插入溶菌酶特异性纳米抗体的第一个连接β链ab的β-转角中的gfp特异性纳米抗体构建的抗原结合嵌合蛋白。进一步研究了纳米抗体自身是否可以用作支架蛋白，因此纳米抗体是否还可以与相同或不同纳米抗体刚性融合来产生二价或双特异性抗原结合嵌合蛋白。因此，根据图17通过三个连接纳米抗体与支架的多肽接头将纳米抗体嫁接到另一个纳米抗体上以构建刚性nb-nb嵌合体(nano2body)。以这样的方式进行连接使得两个nb的补位自由结合其各自的抗原。因此，如果nano2body的两个纳米抗体结合相同的抗原，这个融合体能够以更高的亲合力结合，或者如果nano2body的每个纳米抗体结合不同的抗原，则这个融合体能够结合并交联两个不同的抗原。在此所述的nano2bodies(图18)是根据图17通过短多肽接头连接的第一纳米抗体的部分和另一(不同)纳米抗体的部分连结的嵌合多肽。使用的第一纳米抗体是如seqidno:1中所示的gfp结合纳米抗体(nbgfp207)。第二纳米抗体结合鸡蛋白溶菌酶(cablys3，pdb1mel，seqidno:7)(desmytera等，1996)。如图18中所示的，将所有部分以以下给出的顺序通过肽键彼此从氨基末端连接羧基末端(seqidno:14)：抗gfp纳米抗体nb207gfp的β-链a(残基1-15，seqidno:ep1)，具有随机组成的三个氨基酸的肽接头，甘氨酸，nbgfp207(残基2-118，seqidno:1)，具有随机组成的两个氨基酸的肽接头，溶菌酶结合纳米抗体的β-链b至g(seqidno:7的残基16-133)，具有随机组成的三个氨基酸的肽接头，nbgfp207的g-链的最后部分(seqidno:1的残基117-126)，6xhis/epea标签。为了在丝状噬菌体上展示和选择这些nano2bodies的功能性代表(seqidno:14)，我们使用标准方法构建了开放阅读框的文库，所述开放阅读框编码与许多辅助肽和蛋白质融合的各种nano2bodies。为此，以使得2个纳米抗体可以插入形成nano2bodies的方式使用了携带pelb信号肽的pmesp1载体和携带dsba信号肽的pmesd1载体，两者都含有β链a：seqidno:15：指导融合蛋白分泌至大肠杆菌周质中的pelb前导序列，抗gfp-纳米抗体nbgfp207的β链a(残基1-15，seqidno:1)，具有随机组成的三个氨基酸的肽接头，甘氨酸，nbgfp207(残基2-118，seqidno:1)，具有随机组成的两个氨基酸的肽接头，溶菌酶结合纳米抗体的β-链b至g(seqidno:7的残基16-133)，具有随机组成的三个氨基酸的肽接头，nbgfp207的g-链的最后部分(seqidno:1的残基117-126)，6xhis/epea标签，amber终止密码子，ha标签和m13噬菌体的蛋白3。或nano2bodyseqidno:16：指导融合蛋白分泌至大肠杆菌周质中的dsba前导序列，抗gfp-纳米抗体nbgfp207的β链a(残基1-15，seqidno:1)，具有随机组成的三个氨基酸的肽接头，甘氨酸，nbgfp207(残基2-118，seqidno:1)，具有随机组成的两个氨基酸的肽接头，溶菌酶结合纳米抗体的β-链b至g(seqidno:7的残基16-133)，具有随机组成的三个氨基酸的肽接头，nbgfp207的g-链的最后部分(seqidno:1的残基117-126)，6xhis/epea标签，amber终止密码子，ha标签和m13噬菌体的蛋白3。实施例18：使用噬菌体展示通过体外选择设计和产生从插入fedf特异性纳米抗体的第一个连接β链ab的β-转角中的gfp特异性纳米抗体构建的抗原结合嵌合蛋白。我们还测试了纳米抗体是否可以与相同或不同的纳米抗体刚性融合来产生二价或双特异性抗原结合嵌合蛋白。因此，根据图17通过三个连接纳米抗体与支架的多肽接头将纳米抗体嫁接到另一个纳米抗体上以构建刚性nb-nb二聚体(nano2body；n2b)。以这样的方式进行连接使得两个nb的补位自由结合其各自的抗原。因此，如果两个单体结合相同的抗原，这个融合体能够以更高的亲合力结合，或者如果每个单体结合不同的抗原，则这个融合体能够结合两个不同的抗原。在此所述的nano2bodies(图19)是根据图19通过短多肽接头连接的第一纳米抗体的部分和另一(不同)纳米抗体的部分连结的嵌合多肽。使用的第一纳米抗体是如seqidno:1中所示的gfp结合纳米抗体(nbgfp207)。第二纳米抗体识别f18菌毛粘附素fedf的凝集素结构域(nbfedf9，seqidno:17)(moonens等，2014)。如图19中所示的，将所有部分以以下给出的顺序通过肽键彼此从氨基末端连接羧基末端(seqidno:18)：抗gfp纳米抗体nbgfp207的β-链a(残基1-15，seqidno:1)，具有随机组成的三个氨基酸的肽接头，甘氨酸，nbgfp207(残基2-118，seqidno:1)，具有随机组成的两个氨基酸的肽接头，fedf结合纳米抗体的β-链b至g(seqidno:17的残基16-129)，具有随机组成的三个氨基酸的肽接头，nbgfp207的g-链的最后部分(seqidno:1的残基117-126)，6xhis/epea标签。因为高度保守的n-末端序列和高度保守的c-末端序列是所有nbs共有的，因此可以以非常相似的方式方便地克隆体内成熟的纳米抗体库。可以制备两种形式的nano2body:nbgfp207作为第一个结合结构域，和nbfedf9，作为第二个结合结构域。为了简化筛选，我们从图46中所示的能量稳定的构建体(seqidno:184-185)开始使用了计算机建模。为了在丝状噬菌体上展示和选择这些nano2bodies的功能性代表，我们使用标准方法构建了开放阅读框的文库，所述开放阅读框编码与许多辅助肽和蛋白质融合的各种nano2bodies。为此，以使得2个纳米抗体可以插入形成nano2body的方式使用了携带pelb信号肽的pmesp1载体和携带dsba信号肽的pmesd1载体，两者都含有β链a：seqidno:184-185。在pmesp构建体中，pelb前导序列指引抗原结合嵌合蛋白分泌至大肠杆菌周质中，在pmesd构建体中，dsba前导序列指引抗原结合嵌合蛋白分泌至大肠杆菌周质中。将所有部分以以下给出的顺序通过肽键彼此从氨基末端连接羧基末端：信号肽，抗gfp-纳米抗体nbgfp207的β链a(残基1-13，seqidno:1)，四个氨基酸的肽接头：tenh(残基14-17，seqidno:184-185)，nbgfp207(残基3-116，seqidno:1，残基5中从v突变成q)，具有随机组成的四个氨基酸的肽接头，fedf结合纳米抗体的β-链b至g(seqidno:17的残基16-128)，三个氨基酸的肽接头：gqe(seqidno:184的残基249-251)或gqq(seqidno:185的残基249-251)，nbgfp207的g-链的最后部分(seqidno:1的残基117-126)，6xhis/epea标签，amber终止密码子，ha标签和m13噬菌体的蛋白3。为了选择可以在体外重组表达的抗原结合嵌合蛋白，在质粒水平构建了抗原结合嵌合蛋白的文库。具有在pmesp载体中克隆的dna片段的文库称为pmespniibgfp207xfedf9，具有pmesp载体中克隆的dna片段的文库称为pmesdniibgfp207xfedf9。将这些文库用于转化大肠杆菌细胞。为了鉴定正确装配的嵌合蛋白，我们进行了通过fedf上的噬菌体展示(pardon等，2014)的1轮或2轮体外选择接着一轮gfp上的选择。选择后，挑选单独的克隆并将目标dna片段进行pcr，在1％琼脂糖凝胶上检查每个克隆的大小。对带有正确大小的dna片段的几个克隆进行序列分析，以确定连接不同纳米抗体片段的肽接头的序列。如下所述，在大肠杆菌中表达了正确的克隆，使用imac半纯化并进行了elisa，来筛选表达并结合gfp和fedf的克隆(图47)：将纯化的gfp和fedf在碳酸氢钠缓冲液ph8.2中以0.5μg/孔的浓度分开固定在maxisorp微滴定平板(nunc)的孔中。用pbs中的乳在室温下将孔中的残余蛋白结合位点阻断两小时。将imac纯化的nano2body样品在gfp包被的、fedf包被的和无包被的孔上孵育。洗涤步骤后，通过使用特异性识别仅存在于nano2body上的epea标签的捕获选择c-标签生物素化抗体(lifetechnogies)检测nano2body与gfp的结合。随后使用链霉亲和素-碱性磷酸酶(promega)进行了捕获选择生物素化抗体的检测。在添加酶底物p-硝基苯基磷酸酯后测量了405nm处的吸收。检测的信号表明了这些抗原结合嵌合蛋白中的一些能够识别gfp和fedf。这证明了可以从文库选择通过三个短肽接头连接的单结构域免疫球蛋白的部分和不同单结构域免疫球蛋白的部分连结的nano2body作为功能性抗原结合嵌合蛋白。表10中给出了4-4-3氨基酸短接头变体的代表性克隆。表10.连接两个纳米抗体的接头肽的组成实施例19：用于通过酵母展示或噬菌体展示从免疫文库选择gfp特异性抗原结合嵌合蛋白的展示载体。作为免疫球蛋白折叠框架的一部分，n-末端氨基酸序列(包括β链a和形成连接β链a与b的β转角的残基)在不同的骆驼抗体中是高度保守的(harmsen，2000)。因此，一旦连接一个代表性纳米抗体与支架的接头肽的长度和序列得到优化，相同的接头可用于将特定支架插入任何纳米抗体的连接β链a与b的第一个β-转角中，以产生折叠良好且稳定的megabodies(参见前面的实施例)。相似地，不同骆驼抗体的c-末端序列是高度保守的。因此，一旦连接一个代表性纳米抗体与支架的这个接头肽的长度和序列得到优化，相同的接头可以用于连接纳米抗体的c-末端与支架。因此，例如根据图2或图11所示的连接方案，体内成熟的纳米抗体文库可以方便地用于克隆刚性抗原结合嵌合蛋白的大的文库。根据预期的应用，可以针对特定设计的功能性megabodies、具有对称性的多聚megabodies、vlps、nanotools或nano2bodies通过噬菌体展示、酵母展示或病毒展示来筛选这些文库。为了证明这个概念，根据图2通过连接纳米抗体与支架的两个肽键将纳米抗体免疫文库嫁接到支架蛋白hopq上，来构建用于从嫁接到相同支架的不同纳米抗体装配的刚性抗原结合嵌合蛋白的大库的展示的文库(图20)。在此所述的megabodies是根据图2通过短多肽接头连接的单结构域免疫球蛋白的部分和支架蛋白的部分连结的嵌合多肽。免疫球蛋白是已经按照pardon等所述的(2014)从使用gfp免疫的美洲驼的血样克隆的纳米抗体。将所有部分以以下给出的顺序通过肽键彼此从氨基末端连接羧基末端：抗gfp-纳米抗体的β链a(seqidno:1的残基1-13)，hopq的c-末端部分(seqidno:19的残基192-414),连接hopq的c-末端和n-末端以产生支架蛋白的环状排列的短肽接头(seqidno:21)，hopq的n-末端部分(seqidno:19的残基14-186)，源自用gfp免疫的美洲驼的纳米抗体的β链b至g。按照pardon等(2014)所述的从这一免疫的动物克隆编码纳米抗体的基因。为了在酵母上展示和选择其中两个短肽连接其他gfp特异性纳米抗体与支架的新的功能性gfp结合megabodies，我们使用引物tu64(seqidno:124)和tu65(seqidno:125)扩增了编码纳米抗体的基因，并在酵母中使用了gap修复同源重组，以构建以下的开放阅读框文库，所述开放阅读框编码根据图8在与各种辅助肽和蛋白融合的这些megabodies：指引酵母中的胞外分泌的apps4前导序列(rakestraw，2009)，来自免疫文库megabody文库的chopqnb，柔性肽接头，通过aga1p蛋白的二硫键连接酵母细胞壁的酵母凝集素蛋白aga2p的aga2p粘附亚基，用于展示的融合蛋白的正交荧光染色的酰基载体蛋白(johnsson，2005)，接着是cmyc标签。将这些开放阅读框在半乳糖诱导型gal1/10启动子的转录控制下放入pctcon2载体中(chao，2006)，以构建酵母展示文库，该文库编码107个其中两个短肽连接来自免疫文库的纳米抗体与hopq的不同megabodies。为了进行通过酵母展示和facs的体外选择，将这个文库引入酵母株eby100中。使转化的细胞在富含半乳糖的培养基中生长并诱导过夜。使用sfp合酶(1μm)，用coa-647(2μm)对诱导的细胞进行正交染色，并与200nmgfp孵育。接下来，将这些细胞洗涤并进行2-参数facs分析，以鉴定出展示高水平的特定megabody(高coa-647荧光)并结合gfp(高gfp荧光)的酵母细胞。分选出展示高水平gfp结合的细胞，并在富含葡萄糖的培养基中进行扩增，以通过酵母展示和两参数facs分析进行以后几轮的选择(使用较低的gfp浓度100nm、10nm和1nm)。多轮选择后，将coa-647和gfp通道中代表性数量的高荧光细胞作为单个菌落生长，并进行dna测序，以确定以高水平展示并结合gfp的代表性数量的megabodies的序列。在facs实验中，鉴定出九个不同的结合100nmgfp的gfp特异性megabodies(seqidno:95-103，还可以参见图21)，证明了可以从源自免疫文库的megabody文库选择抗原结合嵌合蛋白。实施例20.通过体外选择设计和产生从插入gfp特异性纳米抗体的第二个连接β链cc’的β转角中的hopq的环状排列变体构建的58kd抗原结合嵌合蛋白。实施例1-17说明了可以从插入连接β链a与b的纳米抗体的第一个β-转角中的支架蛋白构建抗原结合嵌合蛋白。为了证明支架还可以通过其他转角连接免疫球蛋白结构域，我们还通过体外选择从插入gfp特异性纳米抗体的第二个暴露的β-转角中的chopq支架蛋白构建了抗原结合嵌合蛋白。在此所述的58kdamegabodies是根据图22通过短多肽接头连接的单结构域免疫球蛋白的部分和支架蛋白的部分连结的嵌合多肽。在此，使用的免疫球蛋白是如seqidno:1中所示的gfp结合纳米抗体。将所有部分以以下给出的顺序通过肽键彼此从氨基末端连接羧基末端(seqidno:104-107)：抗gfp纳米抗体的β-链a至c(seqidno:1的1-39)，具有随意组成的一个或两个氨基酸的肽接头，hopq的c-末端部分(seqidno:19的残基193-414)，连接hopq的c-末端和n-末端以产生支架蛋白的环状排列的肽接头(seqidno:21)，hopq的n-末端部分(seqidno:19的残基15-186)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，抗gfp纳米抗体的β-链c’至g(seqidno:1的残基46-126)，/epea标签。为了在酵母上展示和选择其中hopq的环状排列插入gfp特异性纳米抗体的第二个β转角中的megabodies的功能性变体，我们使用标准方法构建了开放阅读框的文库，所述开放阅读框编码与许多辅助肽和蛋白质融合的各种megabodies(seqidno:108-111)：指导酵母中胞外分泌的apps4前导序列(rakestraw，2009)，抗gfp-纳米抗体的β链a至c(seqidno:1的1-39)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，hopq的c-末端部分(seqidno:19的残基193-414)，连接hopq的c-末端和n-末端以产生支架蛋白的环状排列的肽接头(seqidno:21)，hopq的n-末端部分(seqidno:19的残基15-186)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，抗gfp-纳米抗体的β链c’至g(seqidno:1的残基41-126)，柔性(ggsg)n肽接头，通过aga1p蛋白的二硫键连接酵母细胞壁的酵母凝集素蛋白aga2p的aga2p粘附亚基，然后是用于展示的融合蛋白正交荧光染色的酰基载体蛋白(johnsson，2005)和myc标签。将这些开放阅读框在半乳糖诱导型gal1/10启动子的转录控制下放入pctcon2载体中(chao，2006)，以构建酵母展示文库，该文库编码图22中描述的184.000个不同的megabody变体。为了体外选择，将这个文库引入酵母株eby100中。使转化的细胞在富含半乳糖的培养基中生长并诱导过夜。使用sfp合酶(1μm)，用coa-647(2μm)对诱导的细胞进行正交染色，并与100nmgfp孵育。接下来，将这些细胞洗涤并进行2-参数facs分析，以鉴定出展示高水平的特定megabody(高coa-647荧光)并结合抗原gfp(高gfp荧光)的酵母细胞。分选出展示高水平gfp结合纳米抗体的细胞，并在富含葡萄糖的培养基中进行扩增，以通过酵母展示和两参数facs分析进行以后几轮的选择。一轮选择后，将coa-647和gfp通道中代表性数量的高荧光细胞作为单个菌落生长，并进行dna测序，以确定代表性数量的连接纳米抗体与支架蛋白的肽接头的序列。在facs实验中，1-1、2-1、1-2和2-2氨基酸短接头变体的一个或两个代表性克隆(表11)被证实与100nmgfp结合(图48)。这证明可以通过体外选择从megabody文库选择其支架蛋白插入单结构域免疫球蛋白的第二个暴露的β-转角(连接β链c和c’)中并通过两个短多肽接头连接的megabodies，并展示为功能性抗原结合嵌合蛋白。表11.连接支架蛋白与纳米抗体的第二个暴露的β-转角的酵母展示优化的接头肽的组成和程度。megabody克隆连接#1连接#2mp1327_c6rnmp1327_e4rmmp1327_d5cslmp1327_f6npdmp1327_b4qeytmp1327_b5lnhw实施例21.通过体外选择设计和产生从插入k-ras特异性monobody的第一个连接β-链ab的β-转角中的chopq构建的其他58kd抗原结合嵌合蛋白。在此我们描述了基于合成的抗原结合结构域的抗原结合嵌合蛋白，如monobody。从插入h-ras和k-ras特异性monobodyns1(spencer-smith等，2017)的连接β链a和b的第一个β-转角中的chopq支架蛋白构建megabodies。在此描述的58kdamegabodiesmbns1chopq是根据图2通过短多肽接头连接的ns1(合成的结合蛋白(monobody)的部分和支架蛋白的部分连结的嵌合多肽。在此，合成的结合蛋白是seqidno:112中所示的h-ras和k-ras结合monobodyns1(spencer-smith等，2017)。monobodies是基于iii型纤连蛋白结构域构建的合成蛋白。已经分离了以高亲合力结合不同靶标阵列的monobodies，包括受体的胞外结构域、激酶、类固醇激素受体和模块蛋白结构域(koide，2012)。如23中所示的，将所有部分以以下给出的顺序通过肽键彼此从氨基末端连接羧基末端(seqidno:113-116)：ns1的β-链a(seqidno:112的1-13)，具有随意组成的一个或两个氨基酸的肽接头，hopq的c-末端部分(seqidno:19的残基193-414)，连接hopq的c-末端和n-末端以产生支架蛋白的环状排列的肽接头(seqidno:21)，hopq的n-末端部分(seqidno:19的残基15-186)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，ns1monobody的β-链b至g(seqidno:112的残基16-94)，6xhis/epea标签。为了在酵母上展示和选择连接monobody与支架的接头的组成和长度不同的功能性megabodiesmbns1chopq，我们使用标准方法构建了开放阅读框的文库，所述开放阅读框编码与许多辅助肽和蛋白质融合的各种mbns1chopq(seqidno:117-120)：ns1的β链a(seqidno:112的1-13)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，hopq的c-末端部分(seqidno:19的残基193-414)，连接hopq的c-末端和n-末端以产生支架蛋白的环状排列的肽接头(seqidno:21)，hopq的n-末端部分(seqidno:19的残基15-186)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，ns1monobody的β链b至g(seqidno:112的残基16-94)，柔性(ggsg)n肽接头，通过aga1p蛋白的二硫键连接酵母细胞壁的酵母凝集素蛋白aga2p的aga2p粘附亚基，然后是用于展示的融合蛋白正交荧光染色的酰基载体蛋白(johnsson，2005)和myc标签。将这些开放阅读框在半乳糖诱导型gal1/10启动子的转录控制下放入pctcon2载体中(chao，2006)，以构建酵母展示文库，该文库编码184.000个从monobodyns1和支架hopq构建的megabody的不同变体。为了体外选择，将这个文库引入酵母株eby100中。使转化的细胞在富含半乳糖的培养基中生长并诱导过夜。使用sfp合酶(1μm)，用coa-488(2μm)对诱导的细胞进行正交染色，并用100nmdylight-647标记的k-ras孵育。接下来，将这些细胞洗涤并进行2-参数facs分析，以鉴定出展示高水平的特定megabody(高coa-488荧光)并结合抗原k-ras(高dylight-647荧光)的酵母细胞。分选出展示高水平k-ras结合monobody的细胞，并在富含葡萄糖的培养基中进行扩增，以通过酵母展示和两参数facs分析进行以后几轮的选择。一轮选择后，将coa-488和dylight-647通道中代表性数量的高荧光细胞作为单个菌落生长，并进行dna测序，以确定代表性数量的连接monobodyns1与支架蛋白的肽接头的序列。在facs实验中，1-1和2-2氨基酸短接头变体的三个代表性克隆(表12)被证实与100nmk-ras结合(图49)。呈现的高展示水平以及与抗原的结合表明这些megabodies可以进行细胞分泌并展示为功能性k-ras结合嵌合蛋白。表12.连接支架蛋白与monobody的酵母展示优化的接头肽的组成和长度。megabody克隆连接#1连接#2mp1326_b6fgmp1326_c2qlmp1326_e12avmp1326_a3rpsgmp1326_a11vkirmp1326_b12estn实施例22：设计和产生用于难处理的膜结合复合物(如gpcr、离子通道和酪氨酸受体激酶)的结构分析的抗原结合嵌合蛋白。如本文所述的特异性结合所谓的“难处理”靶标的抗原结合嵌合蛋白的应用促进了其精细的结构分析。如实施例4-6中已经举例说明的那样，设计、生产了58kdamegabodies并将其用于gpcr、g蛋白或离子通道的结构测定。在实施例4中，基于nb35的mb35构建体，其特异性地结合β2肾上腺素能受体-gs蛋白复合物的gβ和gα亚基的界面。在实施例5中，基于nb80的mb80构建体，其特异性地结合人β2肾上腺素能受体。在实施例6中，基于nb25的mb25构建体，其特异性地结合五聚配体门控的离子通道gabaa(miller等，2017)。此外，产生了mbnb38chopq，基于纳米抗体nb38(seqidno:130)，其特异性地结合gabaa离子通道β1亚基的胞外结构域(miller等，2018)，并且其允许用来确定该膜结合的蛋白的高解析结构。按照实施例6中实施所述的产生了mbnb38chopq。在此，将nb38的免疫球蛋白结构域(seqidno:130)与支架蛋白chopq连接。将所有部分以以下给出的顺序通过肽键彼此从氨基末端连接羧基末端(seqidno:131)：抗gfp纳米抗体的保守n-末端的β-链a(seqidno:1的1-13)，hopq的c-末端部分(seqidno:19的残基192-414)，连接hopq的c-末端和n-末端以产生支架蛋白的环状排列的短肽接头(seqidno:21)，hopq的n-末端部分(seqidno:19的残基14-186)，nb38的β-链b至g(seqidno:130的残基16-123)，6xhis/epea标签。在大肠杆菌中表达mbnb38chopq构建体并使用镍亲和性色谱和大小排阻色谱进行纯化至同质，最终将以15mg/ml储存在-80℃。纯化的mbnb38chopq(seqidno:131)已经用于解析分别结合竞争性拮抗剂荷包牡丹碱、通道阻断剂苦味毒，激动剂gaba和经典苯二氮卓类药物阿普唑仑(xanax)和地西泮(valium)的脂质纳米盘中的全长人α1β3γ2gabaa受体的高分辨率冷冻电镜结构。通过a型γ-氨基丁酸受体(gabaar)的离子传导信号在哺乳动物神经系统中驱动快速抑制性神经传递。因此，gabaar对于大脑功能的几乎所有方面都至关重要，并且代表重要的药物靶标或者，基于所述纳米抗体并应用cygjk支架来设计和生产100kda抗原结合嵌合蛋白，以促进这种难处理的膜结合复合物的结构分析。这通过将nb35、nb80、nb25和nb38嫁接到ygjk的环形排列形式上来证明。这些megabody克隆基本上按照实施例8中所述的生成：mbnb35cygjke2(seqidno：194)：抗gfp纳米抗体的β链a(seqidno:1的1-12)，tyr一个氨基酸接头，ygjk的c-末端部分(seqidno:38的残基464-760)，连接ygjk的c-末端和n-末端以产生支架蛋白的环状排列的短肽接头(seqidno:43)，ygjk的n-末端部分(seqidno:38的残基1-461)，asp一个氨基酸接头，nb35纳米抗体的β链b至g(seqidno:24的残基17-128)，6xhis/epea标签。遵循相似的构造来设计和产生mbnb80cygjke2(seqidno:195)，但是使用nb80纳米抗体的β链b至g(seqidno:26的残基17-120)；mbnb25cygjke2(seqidno:196)，但使用nb25纳米抗体的β链b至g(seqidno:28的残基17-125)；mbnb38cygjke2(seqidno:197)，但使用nb38纳米抗体的β链b至g(seqidno:130的残基17-123)。此外，产生了基于特异性结合原肌球蛋白相关激酶受体b(trkb)的nb22纳米抗体(seqidno:198)的mbnb22cygjke2，以用于测定这种膜结合受体的高分辨率结构。也是按照实施例8所述的生成了mbnb22cygjke2：mbnb22cygjke2(seqidno:199)：抗gfp-纳米抗体的β链a(seqidno:1的1-12)，tyr一个氨基酸接头，ygjk的c-末端部分(seqidno:38的残基464-760)，连接ygjk的c-末端和n-末端以产生支架蛋白的环状排列的短肽接头(seqidno:43)，ygjk的n-末端部分(seqidno:38的残基1-461)，asp一个氨基酸接头，nb22纳米抗体的β链b至g(seqidno:198的残基17-124)，6xhis/epea标签。这些megabodies(seqidno:194-195-196-197-199)的周质表达和同质纯化基本上按照实施例8中所述的进行。作为实例，mbnb22cygjke2(seqidno:199)已经用作结晶伴侣蛋白，将结合原肌球蛋白相关激酶受体b(trkb)的人脑衍生的神经营养因子结晶，并通过x-射线晶体学解析了trkb-bdnf-cygjke2nb22三元复合物的高分辨率结构。bdnf是通过促进神经元存活、突触形成、突触传递和突触可塑性参与回路的发育和功能调节的神经营养因子。bdnf通过与trkb结合而起作用(yoshii和constantine-paton，2010年)。实施例23：能够特异性结合含chopq的抗原结合嵌合蛋白的chopq支架的抗原结合嵌合蛋白的设计和产生，以结合并进一步延伸抗原结合嵌合蛋白支架。如图26中图示的，已经产生了另一种抗原结合嵌合蛋白，其包含chopq特异性纳米抗体(nb60)，根据图2中的融合体，其嫁接到支架蛋白上。所得到的抗原结合嵌合蛋白，或“装配的抗原结合嵌合蛋白”或“polybody”或“增大的抗原结合嵌合蛋白支架”的组合物允许使用这种特定的“抗mb支架megabody”进一步增加本发明的抗原结合嵌合蛋白的尺寸。这样的“polybodies”可以例如包含突变的chopq作为支架蛋白，其不结合nb60chopq结合位点，以避免导致聚集的自我相互作用。polybody中使用的支架还可以组成不同的支架，如本文所述的cygjk支架蛋白，以避免所述的自我结合。首先，产生结合chopq的nb60(seqidno:132)，并用于在mbnb207chopq(seqidno:20)存在下的结晶。基于解析的晶体结构，将mbnb207chopq中的chopq的三个残基(t289、n296和e197)鉴定为nb60-chopq相互作用的主要贡献者(图27)。此外，可以提出基于较短版本的chopq的megabody设计，环状排列区域具有截断(称为c7hopq)，其总是在mbnb207chopq晶体结构的电子密度中显示为一个从不完全可见的环。mbnb60c7hopq由以下部分组成，以以下给出的顺序通过肽键彼此从氨基末端连接羧基末端：抗gfp纳米抗体的β链a(seqidno:1的1-13)，hopq的c-末端部分(seqidno:19的残基192-411)，hopq的n-末端部分(seqidno:19的残基18-186)，c7hopq-结合纳米抗体的β链b至g(seqidno:132的残基16-133)，6xhis/epea标签。然而，为了生成结合含c/c7hopq的megabodies而不结合自身(自动聚合)的mbnb60c7hopqmegabody，则使用了mbnb60c7hopq的两个不同突变体：·n277k，t270r(mbnb60c7hopqmut2，seqidno:133)·n277k，t270r，e197r(mbnb60c7hopqmut3，seqidno:134)按照实施例2中所述的，在大肠杆菌周质中表达那些mbnb60c7hopq突变体，并纯化至同质。接着，使用图24中所示的类似测量，octet测量(图29)提供了这两个mbnb60c7hopq突变体megabodies可以结合含野生型chopq支架蛋白的megabodies的证据。将生物素化的mbnb60c7hopq(seqidno:20)固定在链霉亲和素生物传感器上。针对与固定化mbnb60c7hopq的结合，检测了不同浓度的nb60(seqidno:132)，mbnb60c7hopqmut2(seqidno:133)和mbnb60c7hopqmut3(seqidno:134)。对于nb60和两个mbnb60c7hopq突变体，证实了结合mbnb60c7hopq。与基于chopq突变体的方法相似，其他支架蛋白可以用于产生polybodies或抗原结合嵌合蛋白的组合物。因此，使用了替代的支架蛋白ygjk，其是大肠杆菌的86kda周质蛋白(pdb3w7s，seqidno:38)(图26，b)。按照实施例8中所述的产生了mbnb60cygjke2：mbnb60cygjke2(seqidno:135)：抗gfp-纳米抗体的β链a(seqidno:1的1-12)，tyr一个氨基酸接头，ygjk的c-末端部分(seqidno:38的残基464-760)，连接ygjk的c-末端和n-末端以产生支架蛋白环状排列的短肽接头(seqidno:43)，ygjk的n-末端部分(seqidno:38的残基1-461)，asp一个氨基酸接头，nb60纳米抗体的β链b至g(seqidno:132的残基17-133)，6xhis/epea标签。按照实施例8中所述的表达和纯化这种megabody。接着，如上所述通过octet测量验证了mbnb60cygjke2与mbnb207chopq的结合(图29)。实施例24：通过体外选择设计和产生从插入gfp特异性纳米抗体的第一个连接β-链ab的β-转角中的dodecin构建的多聚抗原结合嵌合蛋白。在本文中我们证明了还可以怎样将免疫球蛋白结构域刚性嫁接到dodecinrv1498a上。这种来自古细菌结核分枝杆菌的小黄素蛋白是12个单体的装配物。表明，在大肠杆菌中过表达时，单体的12个拷贝可以自我装配，形成高度热稳定的dodecin(liu等，2011)。在dodecin中，每个单体的n-末端非常接近同一单体的c-末端。因此，我们构建了编码刚性抗原结合嵌合蛋白的随机文库，所述嵌合蛋白是根据图2从嫁接到dodecin单体上的纳米抗体构建的，其中两个短肽连接纳米抗体与支架。此处描述的258kdambnb207dodecin分子从嵌合多肽自我装配，该嵌合多肽根据图50由直接连接的单结构域免疫球蛋白的部分和支架蛋白的部分构建。使用的免疫球蛋白是如seqidno:1中所示的gfp结合纳米抗体。使用的支架蛋白是结核分枝杆菌的dodecinrv1498a的单体(genbank登录号：3205040，seqidno:192)。将所有部分以以下给出的顺序彼此从氨基末端连接羧基末端(seqidno:193)：由起始密码子编码的甲硫氨酸，抗gfp-纳米抗体的β链a(seqidno:1的残基1-11)，具有随机组成的一个氨基酸的肽接头，dodecinrv1498a蛋白(seqidno:192的残基5-66)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，gfp结合纳米抗体的β-链b到g(seqidno:1的残基17-126)，6xhis/epea标签。这种抗原结合嵌合蛋白自我装配成含有12个megabody拷贝的dodecin多聚体(图50)。为了选择其中两个短肽连接纳米抗体与dodecin的这些抗原结合嵌合蛋白的功能性代表(seqidno:193)，我们使用标准方法构建了编码上述抗原结合嵌合蛋白(seqidno:193)的开放阅读框的文库。将这些dna片段在pmesp载体中作为hindiii-spi片段克隆。将这种新形成的质粒称为pmespdodecinxnbgfp207。为了选择可以在体外重组表达和正确装配的抗原结合嵌合mbnb207dodecin蛋白，在质粒水平构建了抗原结合嵌合蛋白的文库。将这些文库用于转化大肠杆菌细胞。为了鉴定正确装配成dodecins的嵌合蛋白，按照实施例7中所述的，在大肠杆菌中表达了单个克隆并进行elisa，以筛选结合gfp的克隆(图51)。将表达抗原结合嵌合蛋白并结合gfp的几个克隆作为单个菌落生长并接受dna测序，以确定连接纳米抗体与支架蛋白的肽接头的序列。这证明了可以从文库选择通过两个短多肽接头连接的单结构域免疫球蛋白的部分和dodecin连结的抗原结合嵌合蛋白作为功能性抗原结合嵌合蛋白。表13中给出了1-1氨基酸短接头变体的代表性克隆。这表明了从嫁接到dodecinrv1498a的单体上的纳米抗体构建的这些抗原结合嵌合蛋白可以在大肠杆菌中功能性地表达。表13.连接dodecinrv1498a蛋白与纳米抗体的接头肽的组成。megabody克隆连接#1连接#2mp1462_g1lpmp1462_e2fpmp1462_b2vpmp1462_e3glmp1462_d3dtmp1462_f1eg实施例25：通过体外选择设计和产生从插入gfp特异性纳米抗体的第一个暴露的β-转角中的二硫桥接的同型二聚体构建的megabody。在此描述了还可以怎样将免疫球蛋白结构域刚性嫁接到称为4qyb的同型二聚体上。这种来自新洋葱伯克霍尔德菌(burkholderiacenocepacia)j2315的未知功能的小蛋白是其中两个单体由单个分子间二硫桥连接的同型二聚体，如通过所报道的这种蛋白质的晶体结构证实的(halavaty等，未公开数据，pdb编码4qyb)。另外，一个单体的n-末端非常接近同一单体的c-末端。因此，我们构建了编码刚性抗体嵌合体的随机文库，所述嵌合体是根据图2从嫁接到4qyb单体上的纳米抗体构建的，其中两个短肽连接纳米抗体与支架。此处描述的51kda同型二聚mbnb2074yqb分子从嵌合多肽自我装配，该嵌合多肽根据图52由直接连接的单结构域免疫球蛋白的部分和支架蛋白的部分构建。使用的免疫球蛋白是如seqidno:1中所示的gfp结合纳米抗体。使用的支架蛋白是来自新洋葱伯克霍尔德菌j2315的4yqb的单体(pdb4yqb，seqidno:200)。将所有部分以以下给出的顺序彼此从氨基末端连接羧基末端(seqidno:201-204)：抗gfp-纳米抗体的β链a(seqidno:1的残基1-12)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，4yqb蛋白(seqidno:200的残基8-121)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，gfp结合纳米抗体的β-链b到g(seqidno:1的残基16-126)，6xhis/epea标签。这种刚性抗原结合嵌合蛋白自我装配成含有2个拷贝的纳米抗体的二硫桥接的同型二聚体(图52)。为了选择其中两个短肽连接纳米抗体与支架的这些抗原结合嵌合蛋白的功能性代表(seqidno:201-204)并将它们在大肠杆菌周质中表达，我们使用标准方法构建了编码上述抗原结合嵌合蛋白(seqidno:205-108)的开放阅读框的文库：指引融合蛋白分泌至大肠杆菌周质中的pelb前导序列，抗gfp纳米抗体的β链a(seqidno:1的残基1-12)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，4yqb蛋白(seqidno:200的残基8-121)，具有随机组成的一个或两个氨基酸的肽接头，gfp结合纳米抗体的β-链b到g(seqidno:1的残基16-126)，6xhis/epea标签。将这些dna片段在pmesp载体中作为hindiii-spi片段克隆。将这种新形成的质粒称为pmesp4qybxxnbgfp207。为了选择可以在体外重组表达和正确装配的mbnb2074yqb蛋白，在质粒水平构建了抗原结合嵌合蛋白的文库。将这些文库用于转化大肠杆菌细胞，用于鉴定正确装配的同型二聚体。按照实施例7中所述的，在大肠杆菌中表达了单个克隆并进行elisa，以筛选结合gfp的克隆。将表达抗原结合嵌合蛋白并结合gfp的几个克隆作为单个菌落生长并接受dna测序，以确定连接纳米抗体与支架蛋白的肽接头的序列。序列表>seqidno:1:nbgfp207gfp-特异性纳米抗体＝nb207>seqidno:2:铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)pp7衣壳蛋白单体的细菌噬菌体>seqidno:3-6:mbnb207cpp7x2l二聚体(nbgfp207序列是粗体，环状排列接头是斜体，pp7序列是下划线的，是可变长度(1或2个氨基酸)的短肽接头，标签是小写字母的)>seqidno:7:cablys3鸡蛋白溶菌酶特异性纳米抗体(pdb1mel)>seqidno:8:大肠杆菌衣壳蛋白单体的细菌噬菌体(pdb2ms2)>seqidno:9:mbcablys3cms2x2l二聚体(nbgfp207链a和cablys3，序列是粗体的，环状排列接头是斜体，ms2序列是下划线的,标签是小写字母的)>seqidno:10-13:mbcablys3cms2x2l二聚体>seqidno:14:n2bnb207cablys3lnano2body(nbgfp207是粗体和cablys3序列是下划线的)>seqidno:15:pelb_n2bnb207cablys3l_标签，amber终止密码子(*)_蛋白3nano2body(pelb前导序列，nbgfp207是粗体的，cablys3序列是下划线的，标签是小写字母，amber终止密码子为*，蛋白3是斜体的_)>seqidno:16:dsba_n2bnb207cablys3l_标签，amber终止密码子(*)_蛋白3nano2body(dsba前导序列，nbgfp207是粗体，cablys3序列是下划线的，标签是小写字母，amber终止密码子为*，蛋白3是斜体的_)>seqidno:17:nbfedf9f18菌毛粘附素fedf特异性纳米抗体的凝集素结构域(pdb4w6y)>seqidno:18:n2bnb207nbfedf9lnano2body(nbgfp207是粗体的，且nbfedf9序列是下划线的)>seqidno:19:幽门螺杆菌菌株g27hopq粘附素结构域蛋白(pdb5lp2)>seqidno:20:mbnb207chopq(nbgfp207序列是粗体，环状排列接头是斜体，hopq序列是下划线的)>seqidno:21:chopq环状排列接头肽>seqidno:22:mbnb207chopq_aga2p_acp蛋白序列(apps4前导序列，megabodychopqnbgfp207以粗体表示，柔性(gggs)n多肽接头，aga2p蛋白序列是下划线的，cmyc标签)>seqidno:23:dsba-mbnb207chopq>seqidno:24:β2肾上腺素能受体-gs蛋白复合物特异性纳米抗体的nb35gβ/gα亚基>seqidno:25:mbnb35chopq(环状排列变体是斜体，hopq序列是下划线的，nb35β-链b至g是粗体，6xhis标签，epea标签)>seqidno:26:nb80β2肾上腺素能受体特异性纳米抗体>seqidno:27:mbnb80chopq(环状排列接头是斜体，hopq序列是下划线的，nb80β-链b至g是粗体，6xhis标签，epea标签)>seqidno:28:nb25gabaa-特异性纳米抗体>seqidno:29:mbnb25chopq(环状排列接头是斜体，hopq序列是下划线的，nb25β-链b至g是粗体，6xhis标签，epea标签)>seqidno:30-33:mbnb207chopq随机接头(nbgfp207序列是粗体，是可变长度(1或2个氨基酸)和混合组成的短肽接头，环状排列接头是斜体，hopq序列是下划线的)>seqidno:34-37:mbnb207chopq随机接头_aga2p_acp蛋白序列(apps4前导序列，megabodychopqnbgfp207随机接头是粗体的，是可变长度(1或2个氨基酸)和混合组成的短肽接头，柔性(gggs)n多肽接头是斜体，aga2p蛋白序列是下划线的，cmyc标签)>seqidno:38:大肠杆菌ygjk蛋白(pdb3wfs)>seqidno:39-42:mbnb207cygjkq随机接头(nbgfp207序列是粗体，环状排列接头是斜体，ygjk序列是下划线的,是可变长度(1或2个氨基酸)和混合组成的短肽接头，6xhis&epea标签)>seqidno:43:cygjk环状排列接头肽>seqidno:44-47:mbnb207cygjk随机接头_aga2p_acp蛋白序列(apps4前导序列，megabodycygjkqnbgfp207随机接头文库以粗体表示，柔性(gggs)n多肽接头，aga2p蛋白序列是下划线的，cmyc标签)＞seqidno：48：mbnb207chopqc357-c425(nbgfp207序列是粗体，环状排列接头是斜体，hopq序列是下划线的，连接纳米抗体与支架的半胱氨酸是反着打印的)＞seqidno：49：mbnb207chopqc358-c488(nbgfp207序列是粗体，环状排列接头是斜体，hopq序列是下划线的，连接纳米抗体与支架的半胱氨酸是反着打印的)＞seqidno：50：mbnb207chopqc359-c490(nbgfp207序列是粗体，环状排列接头是斜体，hopq序列是下划线的，连接纳米抗体与支架的半胱氨酸是反着打印的)>seqidno:51:mbnb207chopqc15-c534(nbgfp207序列是粗体，环状排列接头是斜体，hopq序列是下划线的)>seqidno:52:铜绿假单胞菌azurin(pdb2tsa)m121a突变蛋白>seqidno:53-60:mbnb207azurinq随机接头(nbgfp207序列是粗体，azurin序列是下划线的,是可变长度(1或2个氨基酸)和混合组成的短肽接头)>seqidno:61-68:mbnb207azurinq连接文库_aga2p_acp蛋白序列(apps4前导序列，megabodyazurinnbgfp207_随机接头文库以粗体表示，柔性(gggs)n多肽接头，aga2p蛋白序列是下划线的,cmyc标签)>seqidno:69:多形拟杆菌susb蛋白(pdb3wfa)>seqidno:70-77:mbnb207susb随机接头megabody文库蛋白序列(nbgfp207序列是粗体，是可变长度(1或2个氨基酸)和混合组成的短肽接头，susb序列是下划线的)>seqidno:78-85:同型二聚的megabodymbnb207susb随机接头_aga2p_acp蛋白序列(apps4前导序列，susbnbgfp207随机接头megabody文库以粗体表示，柔性(gggs)n多肽接头，aga2p蛋白序列是下划线的，cmyc标签)>seqidno:86:大肠杆菌酰基载体蛋白(pdb1t8k)>seqidno:87-90:nanotoolmbnb207acp随机接头(nbgfp207序列是粗体的，是可变长度(1或2个氨基酸)和混合组成的短肽接头，acp序列是下划线)>seqidno:91-94:nanotoolmbnb207acp随机接头_aga2p蛋白序列(apps4前导序列，nanotoolacpnbgfp207随机接头，是可变长度(1或2个氨基酸)和混合组成的短肽接头，柔性(gggs)n多肽接头，aga2p蛋白序列是下划线的，)>seqidno:95:mbnb207chopqmp1251_a7(环状排列接头是斜体的，hopq序列是下划线的，纳米抗体mp1251_a7的β-链a至g)>seqidno:96:mbnb207chopqmp1252_d10(环状排列接头是斜体，hopq序列是下划线的，纳米抗体mp1252_d10的β-链a至g)>seqidno:97:mbnb207chopqmp1251_d10(环状排列接头是斜体，hopq序列是下划线的，纳米抗体mp1251_d10的β-链a至g)>seqidno:98:mbnb207chopqmp1251_a10(环状排列接头是斜体，hopq序列是下划线的，纳米抗体mp1251_a10的β-链a至g)>seqidno:99:mbnb207chopqmp1251_d4(环状排列接头是斜体，hopq序列是下划线的，纳米抗体mp1251_d4的β-链a至g)>seqidno:100:mbnb207chopqmp1252_c10(环状排列接头是斜体，hopq序列是下划线的，纳米抗体mp1252_c10的β-链a至g)>seqidno:101:mbnb207chopqmp1251_h6(环状排列接头是斜体，hopq序列是下划线的，纳米抗体mp1251_h6的β-链a至g)>seqidno:102:mbnb207chopqmp1251_a5(环状排列接头是斜体，hopq序列是下划线的，纳米抗体mp1251_a5的β-链a至g)>seqidno:103:mbnb207chopqmp1263_c9(环状排列接头是斜体，hopq序列是下划线的，纳米抗体mp1263_c9的β-链a至g)>seqidno:104-107:mbnb207chopq_β转角cc’_随机接头蛋白序列(是可变长度(1或2个氨基酸)和混合组成的短肽接头，环状排列接头是斜体，hopq序列是下划线的，nb207β-链c’至g是粗体的，6xhis标签，epea标签)。>seqidno:108-111:mbnb207chopq_β转角cc’_随机接头_aga2p_acp蛋白序列(apps4前导序列，megabodychopqnbgfp207_β转角cc’_随机接头文库以粗体表示，柔性(gggs)n多肽接头，aga2p蛋白序列是下划线的，cmyc标签)>seqidno:112:deinococcusradioduransmonobodyns1(来自pdb5e59)>seqidno:113-116:mbns1chopq_随机接头(是可变长度(1或2个氨基酸)和混合组成的短肽接头，hopq序列是下划线的，环状排列接头是斜体，ns1β-链b至g是粗体的，6xhis标签，epea标签)>seqidno:117-120:mbns1chopq_随机接头_aga2p_acp蛋白序列(apps4前导序列，chopqns1_随机接头megabody文库是以粗体表示，柔性(gggs)n多肽接头，aga2p蛋白序列是下划线的，cmyc标签)。>seqidno:121:nbgfp207(dna)＝nb207>seqidno:122:tu89正向引物(sapi消化位点)(dna)>seqidno:123:ep230反向引物(sapi消化位点)(dna)>seqidno:124:tu64引物(dna)>seqidno:125:tu65引物(dna)>seqidno:126:tu131引物(dna)>seqidno:127:tu132引物(dna)>seqidno:128:tu133引物(dna)>seqidno:129:tu134引物(dna)>seqidno:130:nb38gabaa-特异性纳米抗体>seqidno:131:mbnb38chopq(环状排列接头是斜体，hopq序列是下划线的,nb38β-链b至g是粗体，6xhis标签，epea标签)>seqidno:132:nb60hopq-特异性纳米抗体>seqidno:133:mbnb60c7hopqn277kt270r(hopq序列是下划线的，n277kt270r突变，nb60β-链b至g是粗体的，6xhis标签，epea标签)>seqidno:134:mbnb60c7hopqn277kt270re197r(hopq序列下划线的,n277kt270re197r突变,nb60β-链b至g是粗体的,6xhis标签,epea标签)>seqidno:135:mbnb60cygjkqe2(nbgfp207序列是粗体的，环状排列接头是斜体，ygjk序列是下划线的，一个氨基酸接头，6xhis&epea标签)＞seqidno：136：mbnb207c7hopq(hopq序列是下划线的，nbgfp207β-链b至g是粗体，6xhis标签，epea标签)＞seqidno：137-140：分别是mbnb207c7hopqa5、a12、b7和g10。＞seqidno：141：mbnb207cygjke2(nbgfp207序列是粗体，y短肽接头，ygjk序列是下划线的，环状排列接头是斜体，ygik序列是下划线的，d短肽接头，6xhis&epea标签)＞seqidno：142-144：分别是mbnb207cygjka2、c4和f5。＞seqidno：145：mbnb207c7hopqc14-c512(hopq序列是下划线的，nbgfp207β-链b至g是粗体的，连接纳米抗体与支架的半胱氨酸是反着打印的，6xhis标签，epea标签)＞seqidno：146：mbnb207c7hopqc402-c474(hopq序列是下划线的，nbgfp207β-链b至g是粗体的，连接纳米抗体与支架的半胱氨酸是反着打印的，6xhis标签，epea标签)＞seqidno：147：mbnb207c7hopqc316-c472(hopq序列是下划线的，nbgfp207β-链b至g是粗体，连接纳米抗体与支架的半胱氨酸是反着打印的,6xhis标签，epea标签)＞seqidno：148：mbnb207c7hopqc314-c472(hopq序列是下划线的，nbgfp207β-链b至g是粗体，连接纳米抗体与支架的半胱氨酸是反着打印的，6xhis标签，epea标签)＞seqidno：149：mbnb207c7hopqc312-c453(hopq序列是下划线的，nbgfp207b-链b至g是粗体，连接纳米抗体与支架的半胱氨酸是反着打印的,6xhis标签，epea标签)＞seqidno：150：mbnb207c7hopqc349-c452(hopq序列是下划线的，nbgfp207β-链b至g是粗体，连接纳米抗体与支架的半胱氨酸是反着打印的，6xhis标签，epea标签)＞seqidno：151-158：分别是mbnb207azurina8、d9、d10、d11、g6、b8、b2和c8。＞seqidno：159：mbnb207cpp7x2a3(mp1403_a3)(nbgfp207序列是粗体，接头是斜体，pp７序列是下划线的，标签是小写字母)＞seqidno：160-165：分别是mbnb207cpp7x2d3、g5、e6、d7、a9、b9(mp1403)＞seqidno：166：ap205不动杆菌属噬菌体衣壳蛋白np_085472.1＞seqidno：167：mbnb207ap205x2xx(nbgfp207序列是粗体，随机接头是斜体，x是(1个氨基酸的)短肽接头，ap205序列是下划线的，标签是小写字母)＞seqidno：168-172：分别是mbnb207ap205x2c5、b7、b8、d3、a4。＞seqidno：173：mbnb207ap205xx(nbgfp207序列是粗体的，随机接头是斜体的，x是(1个氨基酸的)短肽接头，ap205序列是下划线的,标签是小写字母)>seqidno:174-183:分别是mbnb207ap205c12、a4、e8、d10、a3、a10、d10、d2、c10、f1>seqidno:184:n2bnb207nbfedf9e(nbgfp207是粗体，且nbfedf9序列是下划线的，接头序列是斜体)>seqidno:185:n2bnb207nbfedf9q(nbgfp207是粗体，且nbfedf9序列是下划线的，接头序列是斜体)>seqidno:186:n2bnb207nbfedf9ca14543(mp1411_b3)>seqidno:187:n2bnb207nbfedf9ca14544(mp1411_c6)>seqidno:188:n2bnb207nbfedf9ca14546(mp1438_a5)>seqidno:189:n2bnb207nbfedf9ca14548(mp1438_b11)>seqidno:190:n2bnb207nbfedf9ca14550(mp1438_d2)>seqidno:191:n2bnb207nbfedf9ca14552(mp1440_c5)>seqidno:192:结核分枝杆菌dodecinrv1498a蛋白(genbank登录号:3205040)>seqidno:193:mbnb207dodecin随机接头megabody(nbgfp207序列是粗体,是(1个氨基酸的)混合组成的短肽接头，dodecinrv1498a蛋白序列是下划线的，6xhis标签，epea标签)>seqidno:194:mbnb35cygjke2>seqidno:195:mbnb80cygjke2>seqidno:196:mbnb25cygjke2>seqidno:197:mbnb38cygjke2>seqidno:198:nb22原肌球蛋白相关激酶受体b(trkb)-特异性纳米抗体>seqidno:199:mbnb22cygjke2>seqidno:200:新洋葱伯克霍尔德菌4qyb蛋白(pdb4qyb)>seqidno:201-204:mbnb2074qyb随机接头(nbgfp207序列是粗体，(x)1-2是(1或2个氨基酸)的混合组成的短肽接头，4qyb蛋白序列是下划线的，6xhis标签，epea标签)>seqidno:205-208:pelb_mbnb2074qyb随机接头(nbgfp207序列是粗体，(x)1-2是(1或2个氨基酸)的混合组成的短肽接头，4qyb蛋白序列是下划线的,6xhis标签，epea标签)>seqidno:209:亲和性标签(us9518084b2)epea>seqidno:210-213:来自图8c的序列。参考文献bliven,s.,prlic,a.(2012).circularpermutationinproteins.ploscomput.biol.8(3):e1002445.boder,e.t.,和wittrup,k.d.(1997).yeastsurfacedisplayforscreeningcombinatorialpolypeptidelibraries.natbiotechnol15,553-557.chao,g.,lau,w.l.,hackel,b.j.,sazinsky,s.l.,lippow,s.m.,andwittrup,k.d.(2006).isolatingandengineeringhumanantibodiesusingyeastsurfacedisplay.natprotoc1,755-768.chothia,c.,lesk,a.m.(1987).canonicalstructuresforthehypervariableregionsofimmunoglobulins.mol.biol.196(4):901–17.coscia,f.,estrozi,l.f.,hans,f.,malet,h.,noirclerc-savoye,m.,schoehn,g.,andpetosa,c.(2016).fusiontoahomo-oligomericscaffoldallowscryo-emanalysisofasmallprotein.naturescientificreports.6:30909.doi:10.1038/srep30909.desmytera,transuet.r.,ghahroudim.a.,thim.h.,poortmansf.,hamersr.,muyldermanss.andwynsl.(1996).crystalstructureofacamelsingle-domainvhantibodyfragmentincomplexwithlysozyme.naturestructuralbiology3,803-811.ehrenmann,f.,kaas,q.,lefranc,m-p.(2010).imgt/3dstructure-dbandimgt/domaingapalign:adatabaseandatoolforimmunoglobulinsorantibodies,tcellreceptors,mhc,igsfandmhcsf.nucleicacidsres,38:d301–7.doi:10.1093/nar/gkp946.ehrenmann,f.,lefranc,m-p.(2011).imgt/3dstructure-db:queryingtheimgtdatabasefor3dstructuresinimmunologyandimmunoinformatics(igorantibodies,tr,mh,rpi,andfpia).coldspringharbprotoc,6:750–61.doi:10.1101/pdb.prot5637.harmsen,m.m.,ruuls,r.c.,nijman,i.j.,niewold,t.a.,frenken,l.g.j.,anddegeus,b.(2000).llamaheavy-chainvregionsconsistofatleastfourdistinctsubfamiliesrevealingnovelsequencefeatures.molecularimmunology37,579-590.henderson,r.(1995).thepotentialandlimitationsofneutrons,electronsandx-raysforatomicresolutionmicroscopyofunstainedbiologicalmolecules.quarterlyreviewsofbiophysics.28:171-193.hunte,c.,和michel,h.(2002)crystallisationofmembraneproteinsmediatedbyantibodyfragments.curropinstructbiol12,503-508.hunynhk.等，(2015)analysisofproteinstabilityandligandinteractionsbythermalshiftassay.currprotocproteinsci.；79:28.9.1–28.9.14.javaheri,a.,kruse,t.,moonens,k.,mejías-luque,r.,debraekeleer,a.,asche,c.i.,tegtmeyer,n.,kalali,b.,bach,n.c.,sieber,s.a.,hill,d.j.,v.,hauck,c.r.,moskalenko,r.,haas,r.,busch,d.h.,klaile,e.,slevogt,h.,schmidt,a.,backert,s.,remaut,h.,singer,b.b.,andgerhard,m.(2016).helicobacterpyloriadhesinhopqengagesinavirulence-enhancinginteractionwithhumanceacams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