一种生物转化类固醇类化合物获取羟基化化合物的方法与流程

文档序号：18670296发布日期：2019-09-13 21:03阅读：822来源：国知局

本发明属于生物技术领域，特别地，涉及一种利用重组大肠杆菌生物转化类固醇类化合物(steroid)获得羟基化化合物的方法。

背景技术：

甾体药物在医药上占有重要地位，除了薯蓣皂苷元天然化合物在甾体药物的广泛应用外，一些甾醇如胆固醇、谷甾醇和菜籽甾醇等现在也被认为是具有巨大潜能的甾体激素类药物的起始原料。甾体激素药物对机体起着非常重要的调节作用，被誉为“生命的钥匙”。甾体化合物又称类固醇化合物，是环戊烷多氢菲类化合物的总称，普遍存在于动植物组织内。甾族化合物都含有一个由四个环组成的基本骨架，即由三个六元环和一个五元环稠合的碳结构，这个骨架是甾族化合物的母核，即环戊烷多氢菲。四个环用字母a、b、c和d表示，并将17个碳原子按特定顺序编号。大多数甾体化合物在环戊烷多氢菲的母核上还有三个侧链,它们分别连在c-10,c-13和c-17的碳原子上。

许多甾体化合物都具有很强的生理活性，如皮质酮、氢化可的松、睾酮、雄酮、孕酮和雌二酮等，对机体起着非常重要的调节作用，如肾上腺皮质激素能治疗或缓解胶原性疾病、过敏性休克等难治或危险的疾病，也是治疗阿狄森氏病等内分泌疾病不可缺少的药物。各种性激素是医治雄性器官衰退和某些妇科疾病的主要药物，是治疗乳腺癌、前列腺癌的辅助治疗药物，也是近年来需求旺盛的口服避孕药的主要成分。甾体类药物还被开发成为麻醉药、抗心率失常药、抗细菌药、抗胆碱酯酶药、抗凝血剂、抗真菌药、抗肿瘤药、抗原生动物药、胆汁分泌剂、诊断剂、神经调节阻断剂、胆石分散剂、止血剂、钙调节剂、脂调节剂、神经病治疗药、泻药、安定药等。由于甾体药物不可取代的用途及其治疗适应症的不断扩大，越来越引起人们的重视。

甾体激素药物是仅次于抗生素的第二大类药物，由于其结构非常复杂，利用化学合成法比较困难，通常以具有甾体母核结构的天然产物作为原料制得。利用生物转化能够得到前体所不具有的新特性化合物。来源于不同微生物的羟化酶能选择性地对甾体母核上的次甲基进行羟基化，同时非对映体选择性地把该次甲基上的一个氢催化成α-或β-羟基。例如自从发现黑根霉能够将黄体酮转化成羟基黄体酮之后，人们又发现银样链霉菌能将孕酮转化成11-α羟基孕酮，随后又相继发现细菌、酵母、霉菌和放线菌的某些种类都能够使甾体化合物的特定位置发生有价值的转化反应。其中，16位上羟基化后，既可以使抗炎及糖代谢作用保持不变，又可以使药物的贮盐副作用消失。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种利用基因工程技术改造获得重组大肠杆菌生物转化类固醇类化合物获得羟基化化合物的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种利用基因工程技术改造获得重组大肠杆菌生物转化类固醇类化合物获得羟基化化合物的方法，包括以下步骤：

(1)制备共表达重组大肠杆菌：用定点突变试剂盒对阿维链霉菌ma4680的编码cyp105d7的sav7469基因在r70a/r190a位置进行双突变以获得双突变基因序列sav7469r70a/r190a，用ndei和spei酶切获得的双突变基因序列和载体pt7ns-camab，并进行连接获得重组载体pet11::sav7469r70a/r190a::cama-camb，将重组载体导入到大肠杆菌bl21(de3)中，最终获得共表达重组大肠杆菌；所述阿维链霉菌ma4680的编码cyp105d7的sav7469r70a/r190a基因的基因序列如seqidno.2所示，载体pt7ns-camab的基因序列如seqidno.4所示，重组载体pet11::sav7469r70a/r190a::cama-camb的基因序列如seqidno.5所示；

(2)重组大肠杆菌的前培养和扩大培养：将重组大肠杆菌加入lb培养基中，在ph为7.4-7.6范围内，温度为37℃、转速为200rpm条件下培养18小时，得重组大肠杆菌的种子液；将重组大肠杆菌的种子液接种到m9培养基中进行扩大培养、发酵；种子液和m9培养基的体积比为1:100，接种后，重组的大肠杆菌继续在37℃、培养至菌液od600值达到0.6～0.8左右，然后加入iptg和5-氨基乙酰丙酸盐诱导菌体大量表达蛋白，iptg的终浓度为0.2mm，5-氨基乙酰丙酸盐的终浓度为0.5mm；再将温度降低至22℃，转速降低为180rpm，继续培养20h；

(3)菌体的收集：在4℃，4000rpm条件下离心10min，收集沉淀的菌体；并采用4℃的磷酸钠缓冲液对菌体进行洗涤两次，收集洗涤后的菌体，并将其悬浮于磷酸钠缓冲液中，得到反应液，用于对柚皮素进行生物转化；

(4)类固醇类化合物的生物转化：将化合物溶解在甲醇后，添加到步骤3中得到的反应液中进行生物转化，得转化液；化合物的终浓度为0.1mm，生物转化的条件为180rpm、30℃的条件下培养20h；待反应结束后，加入与转化液等量的乙酸乙酯停止反应，乙酸乙酯和转化液充分混合使产物全部进入到乙酸乙酯有机相中，混合物震荡2min，将混合液13000rpm离心10min，收集上清液；对上清液进行干燥得到羟基化化合物。

本发明的有益效果是：本发明建立了一种以类固醇类化合物为底物，利用细胞色素p450(cyp105d7)的重组大肠杆菌生物合成2β位和16β位羟基化产物的方法。利用细胞色素p450酶对类固醇类化合物进行转化和乙酸乙酯作为萃取剂分离羟基化产物。该方法证明了细菌的p450酶也可以对睾酮、孕酮和雄烯二酮进行区域选择性单加氧化，并定向生成羟基化化合物。本发明的优势在于：①此发明与传统的化学合成方法相比，可以在低污染、低能耗、高选择性的条件下进行；②细胞色素p450酶cyp105d7的重组菌可生物转化睾酮、孕酮和雄烯二酮等类固醇类化合物并生成2β位和16β位羟基化产物；③经过定点突变，构建了更高效的重组突变株，转化率比野生型提高了近20倍；④利用重组菌的生物转化可大大减少副反应产物，易于分离出所要的产物，因此达到高效率。

附图说明

图1为本发明的方法流程图；

图2为实验样品的hplc图谱，其中，a为睾酮，b为孕酮，c为雄烯二酮；

图3为底物睾酮及其反应20小时的产物对应的质谱图：a为睾酮，b为2β-羟基睾酮；

图4为底物孕酮及其反应20小时的产物对应的质谱图：a为孕酮，b为2β-羟基孕酮，c为16β-羟基孕酮，d为2β，16β-二羟基孕酮；

图5为底物雄烯二酮及其其反应20小时的产物对应的质谱图，a为雄烯二酮，b为2β-羟基雄烯二酮，c为16β-羟基雄烯二酮。

具体实施方式

细胞色素p450酶可在温和条件下区域、立体选择性引入氧原子到非活性烃类复杂化合物,进行结构改造或修饰，具备化学催化剂难以比拟的优势。尤其微生物来源p450酶因稳定性好，催化活性高而备受关注，目前广泛应用在医药工业中间体、抗生素、维生素等重要工业产品的生产中。

据我们的研究发现，阿维链霉菌来源的细胞色素p450酶cyp105d7可选择性催化类固醇类化合物2β位和16β位羟基化反应。据研究表明，类固醇类化合物的16位羟基化既可以使抗炎及糖代谢作用保持不变，又可以使药物的副作用消失。构建重组大肠杆菌进行生物转化可大大减少副反应产物，易于分离出所要的产物，提高生产效率，是高效生产类固醇类羟基化产物的有效方法。

下面，结合具体的实施方式对本发明作进一步地说明。

本发明生物转化类固醇类化合物获得羟基化化合物的方法包括以下步骤：

1、获得共表达重组大肠杆菌

sav7469r70a/r190a基因由阿维链霉菌ma4680的编码cyp105d7的sav7469基因(其基因序列如seqidno.1所示)(http://avermitilis.ls.kitasato-u.ac.jp)利用定点突变试剂盒用pcr法，使用三对引物seqidno.3：5′-agcggctttcctccgacgcgacgctgcccaggttccc-3′与反向引物seqidno.3：5′-gggaacctgggcagcgtcgcgtcggaggaaagccgct-3′；5′-ccgaggtccaggacgccgcggcccaactggacgacta-3′与反向引物seqidno.3：5′-tagtcgtccagttgggccgcggcgtcctggacctcgg-3′；5′-ggaattccatatgacagagcccggtacgt-3′与反向引物seqidno.3：5′-ccgctcgagttaccaggtcacggggag-3′扩增获得的。载体pt7ns-camab(国际专利号us2006/0234337a1，其基因序列如seqidno.4所示)中cama基因与camb基因各编码恶臭假单胞菌的假单胞氧还蛋白还原酶与假单胞氧还蛋白。用ndei和spei酶切pcr扩增产物与载体pt7ns-camab，并进行连接获得重组载体pet11::sav7469r70a/r190a::cama-camb(其基因序列如seqidno.5所示)。此重组载体导入到大肠杆菌bl21(de3)中，最终获得共表达重组大肠杆菌。

2、重组大肠杆菌的前培养和扩大培养

将重组大肠杆菌加入lb培养基中，在ph为7.4-7.6范围内，温度为37℃、转速为200rpm条件下培养18小时，得重组大肠杆菌的种子液。将重组大肠杆菌的种子液接种到m9培养基中进行扩大培养、发酵；种子液和m9培养基的体积比为1:100，接种后，重组的大肠杆菌继续在37℃、培养至菌液od600值达到0.6～0.8左右，然后加入iptg和5-氨基乙酰丙酸盐诱导菌体大量表达蛋白，iptg的终浓度为0.2mm，5-氨基乙酰丙酸盐的终浓度为0.5mm；再将温度降低至22℃，转速降低为180rpm，继续培养20h。

m9培养基可以通过以下方法制备：m9盐溶液中添加质量浓度为1％的酪蛋白氨基酸、质量浓度为0.4％的葡萄糖、0.1mmcacl2、1mmmgcl2、0.1mmfecl3。

lb培养基可以通过以下方法制备：在950ml去离子水中加入10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gnacl，再用5mol/lnaoh调ph至7.0.用去离子水定容至1l，在15psi高压下蒸汽灭菌20min。

3、菌体的收集

重组大肠杆菌在扩大培养20h之后，在4℃，4000rpm条件下离心10min，收集沉淀的菌体。并采用4℃的磷酸钠缓冲液(由1mm的edta、2mm二硫苏糖醇和体积比为10％的甘油组成，溶剂为水，ph＝7.2)对菌体进行洗涤两次，收集洗涤后的菌体，并将其悬浮于磷酸钠缓冲液中，得到反应液，用于对柚皮素进行生物转化。

4、类固醇类化合物的生物转化

将类固醇类化合物溶解在甲醇后，添加到步骤3中得到的反应液中进行生物转化，得转化液；类固醇类化合物的终浓度为0.1mm。生物转化的条件为180rpm、30℃的条件下培养20h；待反应结束后，加入与转化液等体积的乙酸乙酯停止反应，乙酸乙酯和转化液充分混合使产物全部进入到乙酸乙酯有机相中，混合物震荡2min，将混合液13000rpm离心10min，收集上清液。对上清液进行干燥得到羟基化化合物。

本实施方式中，对三种类固醇类化合物包括睾酮、孕酮和雄烯二酮进行了生物转化，睾酮、孕酮和雄烯二酮的反应流程及最终得到的羟基化化合物如图1所示。

将上述干燥产物用甲醇溶解，进行hplc检测分析和lc/ms分析。本发明中hplc分析具体是采用的日本的lc-20athplc体系和cosmosil填充柱，流动相采用的是35％-100％甲醇水梯度洗脱20min，检测波长是245nm，流速是1ml/min。lc/ms的具体实施条件是采用agilent6230飞行时间质谱，色谱柱采用的是安捷伦的反向ods柱，流动相采用的是35％-100％甲醇水梯度洗脱40min，流速是0.6ml/min，检测波长是245nm。

图2为实验样品的hplc图谱，图中a分别为睾酮的标准品和反应20个小时的图谱，保留时间分别为18.128min和15.180min，b为孕酮的标准品和反应20个小时的图谱，保留时间分别为20.218min，17.350min，16.727min和12.624min，c为雄烯二酮的标准品和反应20个小时的的图谱，保留时间分别为17.151min，14.107min和13.534min。

图3，图4，图5分别为底物睾酮、孕酮和雄烯二酮及其反应20小时的产物的质谱图。ms分析选用正离子模式。图3为睾酮和其反应20小时的产物对应的质谱图，保留时间分别为18.128min和15.180min的[m+na]⁺分子量分别为311.1980和327.1931；图4为孕酮和其反应20小时的产物对应的质谱图，保留时间分别为20.218min，17.350min，16.727min和12.624min的[m+na]⁺分子量分别为337.2136,353.2089和353.3088，369.2030；图5为雄烯二酮和其反应20小时的产物对应的质谱图，保留时间分别为17.151min，14.107min和13.534min的[m+na]⁺分子量分别为309.1824，325.1779和325.1781。由图3-5可知，反应20小时的产物相对于底物都增加了一个羟基基团分子量，所以可以推测转化产物为羟基化产物，并通过核磁鉴定反应20小时的化合物，确定均为2β和16β位特定羟基化化合物，其中，睾酮生成了2β-羟基睾酮；孕酮生成了2β-羟基孕酮、16β-羟基孕酮和2β，16β-二羟基孕酮；雄烯二酮生成了2β-羟基雄烯二酮和16β-羟基雄烯二酮。

此发明与传统的化学合成方法相比，可以在低污染、低能耗、高选择性的条件下进行；②细胞色素p450酶cyp105d7的重组菌可生物转化睾酮、孕酮和雄烯二酮等类固醇类化合物并生成2β位、16β位羟基化产物或2β位和16β位同时羟基化化合物；③经过定点突变，构建了更高效的重组突变株，转化率比野生型提高了近20倍；④利用重组菌的生物转化可大大减少副反应产物，易于分离出所要的产物，因此达到高效率。

序列表

<110>浙江理工大学

<120>一种生物转化类固醇类化合物获取羟基化化合物的方法

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1506

<212>dna

<213>阿维链霉菌(streptomycesavermitilis)

<400>1

atgacagagcccggtacgtccgtgtcagcgcccgtcgccttcccccaggaccgcacgtgt60

ccctacgacccgcccacagcctacgacccgctgcgcgaggggcgtccgctgtcgcgggtc120

tccctctacgacggacgcagcgtgtgggtggtcaccgggcacgccgccgcccgtgcactc180

ctctccgaccagcggctttcctccgaccgcacgctgcccaggttccccgcgaccaccgag240

cggttcgaggccgtacgcacccgccgggtggcgctgctcggtgtggacgaccccgagcac300

cgcacccagcgccgcatgctggtcccgagctttaccctcaagcgggccgccgccctgcgc360

ccgcgcatccaggagaccgtcgacgggctgctcgacgccatggaggcacagggcccgccg420

gccgagctggtgagcgcgttcgcgctgccgctgccctcgatggtgatctgcgccctgctc480

ggcgtcccgtacgccgaccacgacttcttcgagtcccagtcccgcaggctgctgcggggc540

cccgggatcgccgaggtccaggacgcccgtgcccaactggacgactacctgtacgcgttg600

atcgaccggaagcggaaggaacccggggacgggctcctggacgatctcatccaggagcag660

ctgaaccggggcacggtggatcgcgccgagctggtctccctggcgacgctcctgctgatc720

gccggacacgagacgacggcgaacatgatctcgctcggtacgttcaccctgctccggcat780

cccgaacagctggccgagctgcgggccgagccgggcctcatgcccgccgccgtggaggag840

ctgctgcgtttcctgtccatcgccgacgggctgctgcgggtggccaccgaggacatcgaa900

gtggccggtacgaccatcagggccgatgagggcgtcgtcttcgcgacctccgtcatcaac960

cgcgacgcggccggcttcgccgagcccgacgccctggactggcatcgctcggcccgccac1020

catgtcgccttcggtttcggcatccaccagtgcctcgggcagaacctggccagggccgag1080

atggagatcgccctgggcacgctctcgagcggctgcccggcctgcggctggcggcgccgg1140

ccgacgagatccccttcaaaccgggcgacacgatccaggggatgctggaactccccgtga1200

cctggtaagaggctgcggtccatgcacaacgacagcaacaacagcaacggcaacaactcc1260

cacagcaacggcaacgtcaacagcaacggcagcaacagcgacgacaacgtgatcgtgatc1320

gaccgggacctctgcatcggtgccgggcagtgcgccctgaccgcgcccggtgtcttcacc1380

caggacgacgacggattcagcgaactgctgcccggccgggaggacggggcaggcgacccg1440

atggtgcgcgaggccgcacggtcctgcccggtgggggccatcacggtcccgcggtcggca1500

agctga1506

<210>2