告达亭皂苷组合物及其制备方法和用途与流程

本发明涉及一种告达亭皂苷组合物及制备方法和在制备抗癫痫、抑郁和创伤后应激障碍药物中的应用，属于中药技术领域。

背景技术：

萝藦科鹅绒藤属植物青阳参(cynanchumotophyllum)富含有c21甾体皂苷。c21甾体皂苷为一类天然来源的配糖体，由苷元和糖链两部分组成，其中苷元为c21甾体骨架结构，糖基主要由葡萄糖基和多种去氧糖基，如地支糖基等。c21甾体皂苷表现出多种药理活性，如抗癫痫【木全章等，治疗癫痫的药物，中国专利，专利号：cn1060676c；木全章等，青阳参甙丙至庚五个化合物及其制备方法，中国专利，专利号：cn1064048c；向诚等，青阳参皂苷m1的医药用途，中国专利，公开号cn104546878a；向诚等，一种青阳参皂苷组合物及其应用，中国专利，专利号：cn104644663b；向诚等，青阳参皂苷m2在制备抗癫痫药物中的应用，申请号201410785625.3】、抗美尼尔症【木全章等，青阳参甙甲、甙乙在制药中的应用，cn1064235c；抗美尼尔氏病药青阳参、用途和制备方法cn1052905c】、抗肝炎【木全章等，抗肝炎药青阳参、用途和制备方法cn1148978a】、抗抑郁【杨庆雄等，一种c21甾体配糖体在制药中的应用，zl200410079555.6】、抗创伤后应激障碍【杨庆雄等，青阳参总苷在制药中的用途，中国专利，公开号cn106727811a】、抗肿瘤、食欲抑制等。

青阳参总苷，尤其是通过以上专利提到的方法提取得到的总皂苷，在动物实验以及临床应用上，表现出较大的毒性，特别是较长时间的使用，其毒副作用就明显表现出来，动物试验中，中、高剂量组的动物经常出现体重下降、行动缓慢甚至死亡的现象；临床上使用的由青阳参总苷制成的青阳参片剂，需要隔天用药，目的就是为了减少青阳参总苷在体内的滞留效应而降低毒副作用。而以上专利对应的治疗适应症，都是需要长期用药进行治疗的，所以，青阳参总苷的毒性，明显限制了青阳参在制备用于治疗不同病症药物中的用途。

青阳参总苷中的c21甾体皂苷类化合物，结构特点较为显著，都由具有c21甾体骨架的皂苷元与不同类型和不同长度的糖链连接，成为皂苷。其中糖链上含有较多的去氧糖，所以c21甾体皂苷的极性较低，水溶性较差。同时，皂苷元部分的c21甾体骨架，由于其c-12上羟基所连接的酯基的差别，形成了不同的苷元。由于皂苷元的差异以及糖链部分组成糖链的糖基的数目及结构的差异，导致青阳参总c21甾体皂苷的组成十分复杂，其中不同化合物的药效和毒性也因结构的差异而有不同的表现。李先春等首先报道了青阳参总苷对不同诱发因素导致的癫痫的作用有不同的表现，可以表现出抑制癫痫和促癫痫的药理作用【lixianchunetal.,involvementofscn1bandkcna1ionchannelsinaudiogenicseizuresandptz-inducedepilepsyepilepsyresearch,2005,66:155～163.】，赵维民等也报道了从同属多种植物分离得到系列化合物的抗癫痫和促癫痫的实验结果【赵维民等，天然抗癫痫活性化合物及其在药物制剂中的用途，201410487432.x】，说明，青阳参总苷的组分，对生理活性的贡献可能有不同的差别，所以，对该类成分根据结构进行进一步的分离纯化，是发现青阳参毒性，并进一步降低毒性的必要过程。

青阳参总苷中结构特征，导致了组成总皂苷的化合物数量非常多，结构具有很大的相似性，这使得这些化合物的分离难度较大，从中分离得到某一种具有较高药理活性同时毒性较低的单一化合物，难度大且成本很高。所以，筛选开发青阳参中某一种单一化合物制备高效低毒的产品，具有极大的难度。同时，青阳参总苷中的有效成分不是单一的化合物，相似结构分子的组合物的药理作用经常表现为多种化合物的共同药效结果。以分离纯化单一化合物作为产品开发，未能充分利用组合物中其他组分的药理作用，也未达到对青阳参植物资源的充分利用。

组成青阳参总苷的化合物分子群虽然结构十分复杂，但具有十分明显的相同或相似结构单元。这些不同的皂苷化合物的苷元，基本由青阳参苷元(qingyanshengenin)和告达亭苷元(caudatin)两种结构组成，其他的如去乙酰萝藦苷元等皂苷元，含量都较低。不同苷元所形成的皂苷，极性不同，溶解性也有差别，如青阳参苷元的极性比告达亭苷元的极性大，分别连接上相同或相似糖基后，青阳参苷元皂苷比告达亭苷元皂苷的极性大。根据这些极性大小差异对其中不同苷元组成的c21甾体皂苷进行分组，青阳参总苷可以分为以青阳参苷元为主要苷元的青阳参苷元皂苷组，及以告达亭苷元为主要苷元的告达亭皂苷组。

通过研究发现，根据极性大小分离制备得到的c21甾体皂苷分子组合物，在动物毒性试验中表现出不同大小的毒性，其中含告达亭皂苷组的组合物，毒性最小，并同时保留了总皂苷的抗癫痫、抗抑郁和抗创伤后应激障碍等药理活性，是对青阳参总苷利用的改进，改变了青阳参总苷毒性大、不能长期使用等不足，是创新性的改进。同时与单独使用青阳参中某一单一组分作为制备药物的原料相比，兼顾了青阳参植物资源充分利用的成本问题，也考虑了多种相似结构告达亭皂苷之间的协同药理作用。

目前为止，从青阳参总苷中分离并应用告达亭皂苷组合物的相关研究工作未见有报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种低毒、安全的告达亭皂苷组合物及其制备方法和在制备抗癫痫、抑郁和创伤后应激障碍药物中的用途。

为实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案：

一种告达亭皂苷组合物，它是从青阳参的根或根茎中提取出的青阳参总苷中分离得到的，其c21甾体皂苷成分主要为告达亭苷元。

具体地说，该组合物经酸水解后的总皂苷元中告达亭苷元含量为60％～100％。

如前所述告达亭皂苷组合物的制备方法：以青阳参的根或根茎为原料，用70％～100％低级醇溶剂按常规方法提取分离，制得青阳参总苷；取青阳参总苷上c18或c8烷基键合硅胶填料的色谱柱，先以60％～70％的甲醇或乙醇水溶液洗脱2～5个柱体积，再以80％-100％甲醇或乙醇水溶液洗脱2～5个柱体积，收集80％～100％范围的洗脱部位，浓缩除去溶剂后，干燥、粉碎，得固体粉末，即告达亭皂苷组合物。

本发明所述告达亭皂苷组合物在制备抗癫痫药物中的应用。

本发明所述告达亭皂苷组合物在制备抗抑郁药物中的应用。

本发明所述告达亭皂苷组合物在制备抗创伤后应激障碍药物中的应用。

本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明从青阳参总苷中分离出以告达亭苷元为主要苷元的告达亭皂苷组合物，该组合物不仅有效降低了青阳参总苷的毒性，其抗癫痫、抗抑郁和抗创伤后应激障碍的药理活性也较显著，将其用作药物的应用前景明显优于青阳参总苷；而且，与从青阳参总苷中分离单一化合物相比，其难度及成本大大降低，并能充分利用青阳参中结构类似的低毒性成分。

附图说明

图1是不同剂量qys-90对小鼠听源性癫痫发作的时间(即潜伏期)的影响(1：50mg·kg-1；2：100mg·kg-1；3：200mg·kg-1qys-90)。

图2是不同剂量qys-90对强噪音诱导听源性惊厥发作的强直百分数的影响(1：50mg·kg-1；2：100mg·kg-1；3：200mg·kg-1qys-90)。

图3是慢性不可预知温和应激大鼠给药前后对体重的影响。

图4是qys-90组合物对慢性温和应激动物糖水偏爱的影响。

图5是qys-90组合物对慢性温和应激动物旷场行为的影响。

图6是qys-90组合物对(a)慢性温和应激大鼠悬尾实验和(b)强迫游泳实验不动时间的影响(*p<0.05,**p<0.01vsmodel；##p<0.05vscontrol)。

图7是qys-90组合物对无环境线索诱发基础惊反射的影响*p<0.05。

图8是qys-90组合物对恐惧情境诱发的惊反射增强的抑制作用(**p<0.01,*p<0.05)。

图9是qys-90组合物对恐惧线索诱发惊反射增强的抑制作用(**p<0.01,*p<0.05)。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明。

具体实施方式

实施例1：取野生青阳参根10kg，粉碎，80％乙醇提取三次，合并提取液，浓缩回收溶剂。浓缩液用水稀释，石油醚萃取三次，水层再用氯仿萃取三次，合并氯仿部分。回收氯仿，得浅黄色粉末230克，所得浅黄色粉末为青阳参总苷。取青阳参总苷100g，溶于60％甲醇水溶液，上ods反相色谱柱，先以60％甲醇水溶液洗脱2个柱体积，再以70％甲醇水溶液洗脱2个柱体积，最后以90％甲醇水溶液洗脱2～3个柱体积，收集各个梯度的洗脱液，减压蒸馏，除去溶剂，分别得到60％、70％、90％三个洗脱部位(分别标注为qys-60，qys-70，qys-90)。

以告达亭苷元(caudatin)为对照品，参照药品标准(ws3-b-2343-97)方法，测得qys-90中，总皂苷含量为90.5％；采用酸水解法，将青阳参总苷和qys-90部位水解后，经氯仿萃取、减压蒸馏除去氯仿等溶剂，得到青阳参总苷的总苷元和qys-90部位的总苷元，然后以告达亭苷元(caudatin)为标准品，hplc外标法测量两种总苷元中caudatin含量，测得青阳参总苷元中caudatin含量为35.6％，qys-90总苷元中caudatin含量为70.5％。

取qys-60、qys-70、qys-90部位少量，进行lieberman-burchard和keller-killiani反应试验，qys-60未表现典型的甾体颜色反应，而qys-70和qys-90两组均呈阳性，表示后两个部位均为含2-去氧糖的甾体化合物。

实施例2：取栽培青阳参根10kg，粉碎，80％乙醇提取三次，合并提取液，浓缩回收部分乙醇溶剂，使浸膏中乙醇含量不超过50％，过滤或离心，除去不溶物，得清亮溶液，然后上预先处理好的非极性聚苯乙烯型大孔吸附树脂柱(ab-8、d101、hp20等)，先以50％乙醇洗脱3个柱体积后，再以95％乙醇洗脱3个柱体积，95％乙醇收集洗脱液，减压浓缩除去溶剂，干燥后得浅黄色粉末310克，得率为3.1％。所得浅黄色粉末为青阳参总苷。取青阳参总苷100g，溶于60％甲醇水溶液，上c8反相色谱柱，先以70％甲醇水溶液洗脱3个柱体积，再以90％甲醇水溶液洗脱2～3个柱体积，收集各个梯度的洗脱液，减压蒸馏，除去溶剂，分别得到70％、90％洗脱部位(分别标注为qys-70，qys-90)。以caudatin为对照品，参照药品标准(ws3-b-2343-97)方法，测得qys-90中，总皂苷含量为94.5％；采用酸水解法，将qys-90部位水解后，制备得到总皂苷元，然后以caudatin为标准品，hplc外标法测得总苷元中，caudatin含量为75.5％。

实施例3：取栽培青阳参根10kg，粉碎，95％乙醇提取三次，合并提取液，浓缩回收部分乙醇溶剂，加入适量水，使浸膏中乙醇含量不超过50％，过滤或离心，除去不溶物，得清亮溶液，然后上预先处理好的非极性聚苯乙烯型大孔吸附树脂柱(ab-8、d101、hp20等)，先以50％乙醇洗脱3个柱体积后，再以95％乙醇洗脱3个柱体积，95％乙醇收集洗脱液，减压浓缩除去溶剂，干燥后得浅黄色粉末326克，得率为3.26％。所得浅黄色粉末为青阳参总苷。取青阳参总苷100g，溶于60％甲醇水溶液，上ods反相色谱柱，先以70％甲醇水溶液洗脱3个柱体积，再以90％甲醇水溶液洗脱2个柱体积，收集各个梯度的洗脱液，减压蒸馏，除去溶剂，分别得到70％、90％两个洗脱部位(分别标注为qys-70，qys-90)。以caudatin为对照品，参照药品标准(ws3-b-2343-97)方法，测得qys-90中，总皂苷含量为92.0％；采用酸水解法，将qys-90部位水解后，制备得到总皂苷元，然后以caudatin为标准品，hplc外标法测得总苷元中，caudatin含量为84.5％。

实施例4：取野生青阳参根5kg，粉碎，70％甲醇/乙醇提取三次，合并提取液，浓缩回收溶剂。浓缩液用水稀释，石油醚萃取三次，水层再用氯仿萃取三次，合并氯仿部分。回收氯仿，得浅黄色粉末，所得浅黄色粉末为青阳参总苷。取青阳参总苷100g，溶于60％甲醇水溶液，上c18色谱柱，先以60％甲醇水溶液洗脱3个柱体积，再以100％甲醇洗脱2～3个柱体积，收集各个梯度的洗脱液，减压蒸馏，除去溶剂，分别得到60％、100％两个洗脱部位(分别标注为qys-60，qys-100)。以caudatin为对照品，参照药品标准(ws3-b-2343-97)方法，测得qys-100中，总皂苷含量为90.5％；采用酸水解法，将qys-100部位水解后，制备得到总皂苷元，然后以caudatin为标准品，hplc外标法测得总苷元中，caudatin含量为71.5％。

实施例5：取栽培青阳参根5kg，粉碎，100％甲醇/乙醇提取三次，合并提取液，浓缩回收部分乙醇溶剂，使浸膏中乙醇含量不超过50％，过滤或离心，除去不溶物，得清亮溶液，然后上预先处理好的非极性聚苯乙烯型大孔吸附树脂柱(ab-8、d101、hp20等)，先以50％乙醇洗脱3个柱体积后，再以95％乙醇洗脱3个柱体积，95％乙醇收集洗脱液，减压浓缩除去溶剂，干燥后得浅黄色粉末，所得浅黄色粉末为青阳参总苷。取青阳参总苷100g，溶于60％乙醇水溶液，上c8反相色谱柱，先以60％乙醇水溶液洗脱2～5个柱体积，再以80％乙醇水溶液洗脱2～3个柱体积，收集各个梯度的洗脱液，减压蒸馏，除去溶剂，分别得到60％、80％两个洗脱部位(分别标注为qys-60，qys-80)。以caudatin为对照品，参照药品标准(ws3-b-2343-97)方法，测得qys-80中，总皂苷含量为89.0％；采用酸水解法，将qys-80部位水解后，制备得到总皂苷元，然后以caudatin为标准品，hplc外标法测得总苷元中，caudatin含量为68.5％。

试验例：

一、急性毒性试验：

采用实施例1中的方法，制备青阳参总苷组合物(qys总苷)、青阳参皂苷组合物(qys-70)、告达亭皂苷组合物(qys-90)。

取小鼠150只，按qys总苷、qys-70、qys-90三个样品分别分组，每个样品按5个给药剂量分成5组，每组10只，腹腔注射给药一次，连续观察7天，计算死亡小鼠，根据通用的ld50计算方法，计算ld50。

表1青阳参总苷不同部位的急性毒性试验结果

急性毒性试验结果(表1)显示，青阳参总苷的ld50为494.3mg·kg^-1，属于中等毒性物质，所以青阳参总苷在使用中具有较多的限制，临床上青阳参片的使用中，由于其毒性特征，要求隔日使用，以保证用药安全。经过对总苷进行分段后，其中qys-70、qys-90部位的ld50分别为38.8mg·kg^-1和3598.7mg·kg^-1，急性毒性差别非常显著，说明毒性成分基本富集在qys-70部位，该部位的毒性已经可视为高毒性物质了，而qys-90部位则表现出很低的毒性，属于低毒性物质。

二、小鼠听源型惊厥(听源性癫痫)实验

dba/2j小鼠先天性对强噪音敏感，采用高强度的声音刺激会相继出现狂奔、阵挛、强直性痉挛等异常行为，是研究癫痫病理机制和筛选抗癫痫药物常用的实验动物，惊厥试验也是抗癫痫活性筛选的动物模型。

1、实验动物和试剂

实验动物购自北京维通利华实验动物公司。所有动物自由饮水进食。实验开始前至少适应性饲养7天，所有实验程序均符合动物实验伦理准则的要求。

qys-90组合物根据实施例1中方法制备。

2、实验方法

将3～4周dba/2j小鼠随机分成5组(每组5只)，为模型组、阳性对照组(托吡酯)、qys-90低剂量组(50mg/kg)、中剂量组(100mg/kg)、高剂量组(200mg/kg)。采用腹腔注射，隔天给药，连续3次分别给与生理盐水(空白组)和对应药品，在第3次给药1小时和24小时后分别进行强噪音暴露及行为学测试。采用托吡酯作为阳性对照，剂量为20mg·kg^-1。

将动物置入40×40×30cm的玻璃缸内，适应1分钟后，通过固定在玻璃缸顶部的电铃(直径10cm)给与强噪音，声强为115dbspl，持续时间为60秒或动物出现强直性痉挛为止。惊厥发作程度按ross的标准【ross,k.c.andcolemanj.r.,developmentandgeneticaudiogenicseizuresmodels:behaviorandbiologicalsubstrates.neuroscibiobehav2000,24(6):639-653.】进行划分：0级无任何反应；1级：狂奔(wildrunning)；2级：阵挛(clonicseizure)；3级：强直性痉挛(tonicseizure)；4级：动物死亡。

观察动物的表现，记录动物听源性癫痫发作的潜伏期(即给动物刺激到出现明显的狂奔现象的时间)和惊厥发作的严重程度。分别统计各组动物听源性癫痫发作的潜伏期的平均值；以强直百分数(tonus％，发生强制性痉挛的动物占总数的百分比)作为动物听源性癫痫发作的严重程度。

3、实验结果

连续3次腹腔注射不同剂量的qys-90后，结果显示(图1)，模型组动物听源性惊厥发作的潜伏期较短。而给予qys-90后，可以非常明显地延长强噪音诱导的ags发作的潜伏期，同时，并且随着剂量的增加，表现出剂量相关性，在最大剂量(200mg·kg^-1)时，与阳性对照托吡酯(tmp)的作用相当。

模型组中，dba/2j小鼠在受到强噪音刺激后，听源性癫痫发作的潜伏期都较短，而且全部发生强直性痉挛，即强直百分数(touns％)为100％，不同剂量qys-90给药后，强直百分数降低(图2)，强直百分数也随着qys-90剂量的增大而逐渐降低，呈现剂量依赖性的趋势。在最大剂量(200mg·kg^-1)时，与阳性对照托吡酯(tmp)的作用接近。

以上实验结果表明，qys-90能够显著地延长强噪音诱导的听源性癫痫发作的潜伏时间，并能够显著减弱听源性惊厥发作的严重程度，抗癫痫作用呈现量效依赖的趋势，说明qys-90具有显著的抗癫痫作用。

三、qys-90抗抑郁药理实验(慢性不可预知温和应激，cums)

1、实验动物和材料

成年雄性sd大鼠72只，初始体重250-280g，单笼饲养(购自北京维通利华实验动物公司)。所有动物自由饮水进食。实验开始前至少适应性饲养7天，所有实验程序均符合动物实验伦理准则的要求。新进大鼠适应7天，使其适应动物房的环境。适应期第3天开始触摸大鼠直至适应期结束，同时在适应期的第5、6、7天进行糖水训练。在第8天进行糖水偏爱第一次测试，根据糖水偏爱第一次的实验结果对动物进行平衡分组，分为不造模对照组(control)、应激造模组(model)、阳性药氟西汀组(flu，2.5mg·kg^-1)、qys-90低剂量组(qys-90-1,5mg·kg^-1)、中剂量组(qys-90-2,15mg·kg^-1)和高剂量组(qys-90-3,45mg·kg^-1)共六组，每组12只动物。青阳参来源的告达亭皂苷组合物(qys-90)根据实施例1中的方法制备。

2、实验方法

2.1慢性不可预知温和应激：糖水偏爱基线值测试后，根据测试结果进行平衡分组，分为应激组和对照组。应激组分为青阳参总苷组和盐水处理组。慢性温和应激方式共包括：彻夜光照、高温应激、低温应激、频闪灯应激和倾斜鼠笼和湿笼子等。动物每天遭受1-2种应激，每天的应激方式都不相同，应激方式随机。应激期内以7天为一个周期，每一个周期结束后测试糖水偏爱。

2.2应激反应测试：应激开始后全体动物每隔7天进行一次糖水测试，观察动物随着应激时间的延长糖水偏爱的变化。应激结束后按文献方法进行悬尾实验、强迫游泳实验和旷场实验测定。

2.3给药方式和给药时间：从应激开始后的第14天开始口服灌胃隔天给药1次，一直持续到应激结束，氟西汀口服灌胃每天给药1次。

2.4统计分析：研究采用spss19.0进行数据处理，以p<0.05为差异有统计学意义。

3、实验结果

3.1qys-90组合物对应激动物体重的影响

如图3，应激过程中，在应激开始的前两周，大鼠体重有降低的趋势，而未应激的对照组大鼠体重则开始增长。分别给药后，阳性对照组与qys-90不同剂量组在第三周开始改变体重降低趋势，到第五周时，与模型组对比，显著性增加体重，具有明显的体重增加趋势。

3.2qys-90组合物对慢性温和应激糖水偏爱的影响

如图4所示，应激2周后，与对照组相比，应激组的糖水偏爱率都明显减少，应激第三周，阳性对照和qys-90高剂量组均有恢复糖水偏爱的趋势，在慢性应激后第四周，阳性对照组、qys-90中、高剂量组能够显著恢复慢性温和应激动物的糖水偏爱，慢性应激过后第五周开始，qys-90三个剂量组都能够显著恢复慢性温和应激动物的糖水偏爱，并随着剂量的增加，改善效果也增加，表现出对剂量的依赖性。

3.3qys-90组合物对慢性温和应激大鼠旷场行为的影响

如图5(5-1、5-2、5-3)所示，经慢性不可预知温和应激的模型大鼠的不动时间明显大于空白对照组大鼠，在中心区域出现的频率显著降低，而且其总运动距离显著减少，阳性对照氟西汀和qys-90组合物均能改变模型组大鼠的这些行为，说明能有效改变由于cums应激诱导的自主活动减少的趋势，具有抗抑郁作用。氟西汀组与空白对照组对比，不动时间缩短，说明氟西汀表现出一定的兴奋作用，而qys-90组合物不同剂量组都未表现出兴奋作用，对不动时间的缩短基于其抗抑郁作用。旷场实验结果说明，qys-90组合物具有抗抑郁作用，并对应激动物无兴奋作用。

3.4qys-90组合物对慢性温和应激大鼠悬尾不动时间的影响

悬尾实验结果显示(图6a)，与正常对照组比较，模型组悬尾不动时间明显延长，阳性对照氟西汀能显著缩短模型组大鼠的悬尾不动时间，qys-90组合物不同剂量组也能不同程度的缩短应激大鼠的悬尾不动时间。

3.5qys-90组合物对慢性温和应激大鼠强迫游泳不动时间的影响

强迫游泳实验结果显示(图6b)，与正常对照组比较，模型组强迫游泳不同时间显著延长，阳性对照组氟西汀能显著缩短不动时间，给予不同剂量qys-90组合物后，均能不同程度地缩短应激大鼠的强迫游泳不动时间。

以上cums实验结果均提示，qys-90组合物具有显著的抗抑郁作用。四、qys-90抗创伤后应激障碍活性实验(大鼠足底电击)

创伤后应激障碍(ptsd)是由于异乎寻常的威胁性或灾难性应激，导致延迟出现或长期持续的应激障碍，ptsd表现有明显的生理和心理症状，它的复杂性表现在常与相关的精神失调合并发展，如常与抑郁、焦虑等共病疾患。大鼠足底电击模型常常作为创伤后应激障碍药理筛选模型。

1、实验动物和材料：

1.1实验动物：雄性sd大鼠60只，初始体重为250g–280g(购自北京维通利华实验动物技术公司)，单笼饲养，自由饮水、取食。适应期每天抚摸捉拿动物，使其适应实验主试人员操作，排除非实验特异性的应激因素对实验的干扰。动物接受应激处理后分为6组：空白组、模型组、阳性对照组(托吡酯)、qys-90组合物低、中、高剂量组，每组10只。

1.2实验装置：惊反射测试箱(美国sandiegoinstruments，inc)和恐惧条件反射箱(美国med公司)。

2、实验方法

短程强电击应激程序：将动物放入恐惧条件反射箱适应3分钟后，给予动物足底电击强应激，应激采用1.5ma电流强度，电流持续时间5秒，共进行5次电击，每次电击间隔60-180s。最后一次电击结束后60s取出大鼠，将大鼠送回饲养笼。用5％酒精清洁电击箱。

惊反射测试程序：惊反射测试箱，将测试动物放入由圆形有机玻璃制成的束缚盒中适应5分钟，测试不同声音强度(95db、105db和115db)诱发的惊吓反射。

应激后2周的基础惊反射测试：在动物接受应激前测试惊反射基值，共30个trials，适应5min后，95db、105db、115db各10个trials，随机播放，记录每个trial下惊反射的幅值，取各个分贝下诱发惊反射10个trials的平均值作为该声音诱发的惊跳反射值。在应激后14天按照相同程序进行测试。

恐惧增强高唤醒测试(fps)：全部动物进行fps测试。fps测试分为前测、训练和后测三个阶段。fps前测目的是比较在伴随光线和不伴随光线的条件下动物对不同强度声音的惊反射是否有差异，并为接下来的以光线作为条件信号的fps训练提供基线值，fps后测目的是测量动物在恐惧条件化训练后，在恐惧情境和条件恐惧信号条件下惊反射的变化。

适应期后，进行一次惊反射基值测试。其后将所有动物进行足底电击，以应激当天为day0。实验采用口服灌胃给药，采用隔天给药方式。从应激第一天开始给药，持续14天。停药后24小时进行基础惊反射测试，其后进行fps惊反射测试。

统计分析：研究采用spss19.0进行数据处理，以p<0.05为差异有统计学意义。

3、实验结果

3.1qys-90组合物对应激后无环境线索诱发的基础惊反射变化的影响

动物经受创伤应激后会产生高唤醒状态，实验采用不同强度的白噪音刺激(95db、105db和115db)诱发的惊吓反射来测量动物的唤醒程度。方差分析结果表明，与应激前比较，应激后的动物在115db的白噪音条件下诱发的惊反射显著升高。95db和105db的白噪音诱发的惊反射在应激前后没有显著差异。说明短时强电击应激后，应激后无环境线索诱发的基础上，需要较大分贝的强噪音刺激，使动物产生高唤醒症状。创伤经历后动物接受不同剂量的qys-90组合物处理后，在低噪音刺激下，qys-90组合物对各组动物惊反射的作用没有显著差异，如图7(7-1、7-2、7-3)。而在115db刺激下，对于应激后无环境线索诱发的惊反射增强，青阳参来源的qys-90组合物有一定的抑制作用。

3.2qys-90组合物对应激后恐惧情境诱发惊反射的作用

创伤应激处理后，各组动物接受14天的不同剂量的qys-90组合物处理，接着在惊反射测试箱内进行恐惧条件化学习，然后在恐惧情境(惊反射箱，不呈现条件线索)中检测不同强度的白噪音(95，105，115db)诱发的惊反射强度的变化。方差分析结果发现，在恐惧情境中能显著增加105db声音刺激下动物的惊反射强度。qys-90组合物对各组动物在恐惧情境诱发的惊反射强度增加的作用存在显著的差异，处理与测试的交互作用显著。进一步的分析表明，不同剂量的qys-90组合物均能显著抑制恐惧情境下105db和115db诱发惊反射的增强，并呈现剂量依赖性(图8-1、8-2、8-3)。

3.3qys-90组合物对恐惧条件信号诱发惊反射的作用

在fps训练开始之前的基线水平测试，光刺激条件下和无光刺激条件下动物的惊反射水平无显著影响，说明作为条件信号的光刺激在条件化训练前对惊反射无干扰作用。在fps训练结束后，比较动物在恐惧相关的条件信号和没有条件信号的情况下不同声音强度的白噪音诱发的惊反射的变化，方差分析结果表明，测试主效应显著，不同分贝噪音刺激下，恐惧条件线索均能显著增加动物的惊反射强度。给予qys-90组合物后，在95db声音刺激条件下，qys-90组合物对惊反射增强的抑制作用不显著，但在105db和115db声音刺激下，中高剂量qys-90组合物的抑制效果显著，低剂量的药物有一定的抑制作用(图9-1、9-2、9-3)，表现出剂量依赖的趋势。实验结果说明qys-90组合物能显著抑制恐惧条件信号诱发的惊反射增强。

高唤醒是ptsd的核心症状，并且能推进其他症状的发展变化。高唤醒主要表现为愤怒、睡眠障碍、烦躁不安、高警戒状态和惊吓反应的增加等。稳定性较好的惊反射作为高唤醒的测量工具已经广泛应用。本实验结果显示，恐惧应激情境和恐惧线索刺激能够使动物的惊反射显著升高，qys-90组合物能显著抑制恐惧情境和恐惧线索诱发的惊反射增加，也提示了qys-90可以作为制备治疗ptsd的药物。