精神类药物相关基因的检测引物组、试剂盒、体系和方法与流程

本发明涉及基因检测
技术领域：
，特别涉及精神类药物相关基因的多态性检测引物组、试剂盒、反应体系和方法。
背景技术：
：目前，精神疾病的临床治疗方法和手段仍然是以药物治疗为主，而且精神疾病患者一般需要长期用药甚至终身服药，即精神疾病患者对药物的依赖性和粘性较高。因此，精神类药物在临床应用治疗和挽救患者的同时，精神类药物引起的不良反应也不容忽视。临床实践表明，在药物的代谢、转运、受体等不同的阶段，不同个体在接受同一种药物治疗时，其治疗效果、产生的毒副作用及其对药物的耐受性等方面存在着明显的差异。而基因多态性是造成人与人之间药物反应个体差异的本质原因。因此对精神类治疗药物相关基因的基因型进行检测，有助于改善许多患者精神药物治疗的效果，特别是那些存在药代动力学异常的患者，对于综合衡量药物药效及不良反应、实现个体化用药具有重要意义。目前，对精神类药物相关基因的检测主要有pcr-sanger测序法以及荧光定量pcr法等，而传统常规的pcr-sanger测序法虽然是公认的检测基因分型的金标准，但检测周期长、检测通量低，所以对于多基因多位点的检测并不适用；荧光定量pcr方法虽然具有灵敏度高，分型准确，操作简便快捷等优点，但同样无法方便快捷地满足临床对于多基因的数十个至数百个位点检测的需求。技术实现要素：本发明提供了精神类药物相关基因的多态性检测引物组、试剂盒、反应体系和方法，对15个精神类药物相关基因62个多态性位点中的任意一个或多个进行多态性检测，能够有效地缩短检测时间。精神类药物相关15个基因及其对应的62个多态性位点以及这些多态性位点的突变类型分别如下表1和表2所示，特别地，对于精神类药物相关cyp2d6基因来说，其涉及43种基因突变，具体如表2所示。若采用传统常规pcr分别对精神类药物相关15个基因及其对应的62个多态性位点进行扩增，需要消耗比较长的时间。多重pcr是在常规pcr基础上发展的一种新型扩增技术，即可在一个反应体系中加入两对及两对以上的引物对，以同时扩增多个核酸片段。在很大程度上弥补了常规pcr检测周期长、检测通量低等的缺点。表1表2序号突变突变类型1-1770g>a点突变2-1584c>g点突变3-1426c>t点突变4-1235a>g点突变5-1000g>a点突变6-740c>t点突变7-678g>a点突变8-138a>g点突变931g>a点突变10100c>t点突变11124g>a点突变12137_138inst插入/缺失13310g>t点突变14843t>g点突变15883g>c点突变161023c>t点突变171039c>t点突变181659g>a点突变191661g>c点突变201707delt插入/缺失211758g>t点突变221846g>a点突变231863-1864ins(tttcgcccc)2插入/缺失241973_1974insg插入/缺失252097a>g点突变262483g>a点突变272539-2542delaact插入/缺失282549dela插入/缺失292573insc插入/缺失302587-2590delgact插入/缺失312615-2617delaag插入/缺失322850c>t点突变332935a>c点突变342988g>a点突变353183g>a点突变363259-3260insgt插入/缺失373384a>c点突变383582a>g点突变393584g>a点突变403790c>t点突变414180g>c点突变424481g>a点突变43整个基因缺失插入/缺失为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：基于多重pcr，可以针对精神类药物相关基因的多态性位点，来设计特异性扩增基因多态性位点区域的上下游引物。基于文献调研，本发明提供了针对精神类药物相关基因的突变位点ankk1基因snp位点rs1800497、cyp1a2基因snp位点rs762551、cyp1a2基因snp位点rs2069514、cyp2c9基因snp位点rs1057910和rs1799853、cyp2c19基因snp位点rs4244285、rs4986893和rs12248560、htr1a基因snp位点rs6295、scn1a基因snp位点rs3812718、ephx1基因snp位点rs1051740、rs2234922、c3基因snp位点rs2277984、drd2基因snp位点rs1799732、epm2a基因snp位点rs1415744、lepr基因snp位点rs1137101、mc4r基因snp位点rs489693、ugt1a9基因snp位点rs2741049、fkbp5基因snp位点rs4713916、cyp2d6基因的43种突变的多态性检测引物组、多态性检测试剂盒、多态性检测反应体系和多态性检测方法。通过ncbi查找各外显子的dna序列，设计并合成最佳的扩增引物，保证各扩增片段之间不会相互作用产生非特异性产物或二聚体。在本发明中提及的引物对是指包含有上游引物和下游引物的用于扩增特异性基因的引物。第一方面，本发明提供了精神类药物相关基因的多态性检测引物组，包括至少一个下述引物对：用于扩增基因ankk1snp位点rs1800497的引物对pg1，所述pg1的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seqidno.1和seqidno.2所示；用于扩增基因cyp1a2snp位点rs762551的引物对pg2，所述pg2的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seqidno.3和seqidno.4所示；用于扩增基因cyp1a2snp位点rs2069514的引物对pg3，所述pg3的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seqidno.5和seqidno.6所示；用于扩增基因cyp2c9snp位点rs1057910的引物对pg4，所述pg4的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seqidno.7和seqidno.8所示；用于扩增基因cyp2c9snp位点rs1799853的引物对pg5，所述pg5的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seqidno.9和seqidno.10所示；用于扩增基因cyp2c19snp位点rs4244285和rs4986893的引物对pg6，所述pg6的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seqidno.11和seqidno.12所示；用于扩增基因cyp2c19snp位点rs12248560的引物对pg7，所述pg7的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seqidno.13和seqidno.14所示；用于扩增基因htr1asnp位点rs6295的引物对pg8，所述pg8的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seqidno.15和seqidno.16所示；用于扩增基因scn1asnp位点rs3812718的引物对pg9，所述pg9的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seqidno.17和seqidno.18所示；用于扩增基因ephx1snp位点rs2234922的引物对pg10，所述pg10的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seqidno.19和seqidno.20所示；用于扩增基因c3snp位点rs2277984的引物对pg11，所述pg11的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seqidno.21和seqidno.22所示；用于扩增基因drd2snp位点rs1799732的引物对pg12，所述pg12的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seqidno.23和seqidno.24所示；用于扩增基因epm2asnp位点rs1415744的引物对pg13，所述pg13的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seqidno.25和seqidno.26所示；用于扩增基因leprsnp位点rs1137101的引物对pg14，所述pg14的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seqidno.27和seqidno.28所示；用于扩增基因mc4rsnp位点rs489693的引物对pg15，所述pg15的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seqidno.29和seqidno.30所示；用于扩增基因ugt1a9snp位点rs2741049的引物对pg16，所述pg16的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seqidno.31和seqidno.32所示；用于扩增基因fkbp5snp位点rs4713916的引物对pg17，所述pg17的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seqidno.33和seqidno.34所示；用于扩增基因ephx1snp位点rs1051740的引物对pg18，所述pg18的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seqidno.35和seqidno.36所示；用于扩增基因cyp2d6突变的第一引物对pg19，所述pg19的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seqidno.37和seqidno.38所示；用于扩增基因cyp2d6突变的第二引物对pg20，所述pg20的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seqidno.39和seqidno.40所示。优选地，上述精神类药物相关基因的多态性检测引物组分为三个引物组；所述三个引物组中的第一引物组可包含pg3、pg4、pg5、pg12、pg15、pg16、pg17、pg20中的任意一个或多个引物对；所述三个引物组中的第二引物组可包含pg6、pg7、pg8以及pg9中的任意一个或多个引物对；所述三个引物组中的第三引物组可包含pg1、pg2、pg10、pg11、pg13、pg14、pg18以及pg19中的任意一个或多个引物对。其中，pg1、pg2、pg3、…、pg18、pg19及pg20是对不同snp位点对应的不同引物对的标记，在本发明中其用来表征不同引物对，比如pg1表征用于扩增基因ankk1snp位点rs1800497的引物对、pg8用于扩增基因htr1asnp位点rs6295的引物对等等，在此不再赘述。值得说明的是，用于扩增cyp2d6突变的第一引物对pg19，针对表2中的序列号1至17的突变；用于扩增cyp2d6突变的第二引物对pg20，针对表2中的序列号18至42的突变。另外，序列号43的突变由第一引物对pg19和第二引物对pg20共同决定，其中，序列号43整个基因缺失，该2对引物均无扩增产物。优选地，上述精神类药物相关基因的多态性检测引物组包括上述20个引物对，以相对最大程度的提高检测通量。具体地，将上述20个引物对分为三个引物组，其中，pg3、pg4、pg5、pg12、pg15、pg16、pg17以及pg20处于同一引物组，pg6、pg7、pg8以及pg9处于同一引物组，pg1、pg2、pg10、pg11、pg13、pg14、pg18以及pg19处于同一引物组。优选地，所述第一引物组中各个引物对摩尔比为pg3：pg4：pg5：pg12：pg15：pg16：pg17：pg20＝0.5～2：0.5～2：0.5～2：0.5～2：0.5～2：0.5～2：0.5～2：0.5～2；所述第二引物组中各个引物对摩尔比为pg6：pg7：pg8：pg9＝0.5～2：0.5～2：0.5～2：0.5～2；所述第三引物组中各个引物对摩尔比为pg1：pg2：pg10：pg11：pg13：pg14：pg18：pg19＝0.5～2：0.5～2：0.5～2：0.5～2：0.5～2：0.5～2：0.5～2：0.5～2。由于小的序列变化既可能导致引物扩增效率显著降低、特异性变差，本发明分别针对不同多态性位点设计特异性引物，同时设计了多重pcr引物组，在经过多次优化后，综合产物片段长度和基因/外显子情况，本发明得到了扩增效果优选引物组，覆盖了表1和表2给出的所有基因位点。其中，多重pcr引物组中各个上游引物和下游引物的核苷酸序列以及产物大小如下表3所示。优选地，将下述表3中的核苷酸序列划分为三个组，其具体划分结果如下表4所示。其中，第一组、第二组以及第三组只是为了区分核苷酸序列的分组情况，并不特指排序。可以理解地，下述表3中的核苷酸序列还可进行其他方式的分组，在此不再一一赘述。表3表4值得说明的是，不管是表3还是表4中，引物名称中的f表征扩增用上游引物，r表征扩增用下游引物。比如，pg3-f表征用于扩增基因cyp1a2snp位点rs2069514的引物对中的上游引物，pg3-r表征用于扩增基因cyp1a2snp位点rs2069514的引物对中的下游引物，pg9表征用于扩增基因scn1asnp位点rs3812718的引物对，pg10表征用于扩增基因ephx1snp位点rs2234922的引物对。第二方面，基于上述内容，本发明还提供了一种精神类药物相关基因的多态性检测试剂盒，包括：上述任一种精神类药物相关基因的多态性检测引物组。在第二方面基础上，优选地，多态性检测试剂盒，其特征在于，分为三个区域，其中，所述三个区域中的第一区域可包含pg3、pg4、pg5、pg12、pg15、pg16、pg17、pg20中的任意一个或多个引物对；所述三个区域中的第二区域可包含pg6、pg7、pg8以及pg9中的任意一个或多个引物对；所述三个区域中的第三区域可包含pg1、pg2、pg10、pg11、pg13、pg14、pg18以及pg19中的任意一个或多个引物对。其中，所述第一区域中各个引物对摩尔比为pg3：pg4：pg5：pg12：pg15：pg16：pg17：pg20＝0.5～2：0.5～2：0.5～2：0.5～2：0.5～2：0.5～2：0.5～2：0.5～2；所述第二区域中各个引物对摩尔比为pg6：pg7：pg8：pg9＝0.5～2：0.5～2：0.5～2：0.5～2；所述第三区域中各个引物对摩尔比为pg1：pg2：pg10：pg11：pg13：pg14：pg18：pg19＝0.5～2：0.5～2：0.5～2：0.5～2：0.5～2：0.5～2：0.5～2：0.5～2。另外，上述多态性检测试剂盒还可进一步包括利用所述引物对进行目的基因片段pcr扩增反应的试剂。其中，进行目的基因片段pcr扩增反应的试剂可包括：pcrbuffer、dntp(deoxy-ribonucleosidetriphosphate，脱氧核糖核苷三磷酸)、mg2+以及dna聚合酶中的任意一种或多种。另外，所述多态性检测试剂盒，可进一步包括以下一种或多种试剂：用于从样品提取基因组dna的试剂；用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于测序技术中的试剂；以及用于对处理后的扩增产物进行测序的试剂。上述用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于测序技术中的试剂可以为能用于sanger测序技术中的试剂或者能用于焦磷酸测序技术中的试剂、能用于化学降解法测序技术中的试剂、能用于自动化测序技术中的试剂、能用于基因芯片测序技术中的试剂等。第三方面，本发明提供的精神类药物相关基因的多态性检测反应体系包括：上述任意一种精神类药物相关基因的多态性检测引物组。在第三方面基础上，优选地，上述精神类药物相关基因多态性检测反应体系进一步包括：dna聚合酶、pcr反应缓冲液、dntp和模板dna。更优选地，精神类药物相关基因的多态性检测反应体系包括：浓度为20-300nm的所述精神类药物相关基因的多态性检测引物组，该浓度为20nm到300nm中的任意一个值，例如可以为20nm、30nm、50nm、60nm、65nm、80nm、93nm、100nm、120nm、150nm、160nm、180nm、200nm、250nm以及300nm等；用量0.2-4.0u的dna聚合酶，该用量可为0.2u到4.0u中的任意一个值，例如可以为0.2u、0.3u、0.5u、0.6u、0.7u、1.0u、1.2u、1.5u、1.6u、1.8u、2.0u、2.5u、2.8u、3.0u、3.4u、3.6u、4.0u等；2*pcr反应缓冲液，浓度为200-800μm的dntp，该dntp的浓度可以为200μm到800μm中的任意一个值，例如可以为200μm、220μm、250μm、300μm、320μm、350μm、360μm、380μm、400μm、410μm、420μm、450μm、500μm、530μm、550μm、570μm、580μm、600μm、640μm、680μm、700μm、710μm、730μm、760μm、780μm、800μm等；以及用量为10-100ng的模板dna，该模板dna的用量可以为10ng到100ng中的任意一个值，例如可以为10ng、11ng、12ng、15ng、17ng、30ng、40ng、50ng、70ng、80ng、90ng以及100ng等。dna聚合酶可以选用taq酶等。优选地，精神类药物相关基因的多态性检测反应体系的体积可为10-50μl，即精神类药物相关基因的多态性检测反应体系的体积可为10μl到50μl中的任一值，比如可以为10μl、11μl、12μl、15μl、17μl、20μl、30μl、40μl及50μl等。另外，可以理解地，可补充超纯水，以满足对精神类药物相关基因的多态性检测反应体系的体积、dna聚合酶、pcr反应缓冲液、dntp和模板dna的配比和用量的要求。优选地，所述模板dna为人类基因组dna。第四方面，用于非诊断目的精神类药物相关基因的多态性检测方法包括：使用上述任一所述的多态性检测引物组或上述任一所述的检测产品或上述任一所述的多态性检测反应体系，通过pcr扩增反应扩增精神类药物相关基因；pcr扩增反应的反应条件为94～98℃2～10min，然后进行25～40个循环，每个循环中94～98℃10～90s，然后55～68℃10～90s，然后68～72℃30～300s，然后68～72℃5～20min；通过测序技术对pcr扩增产物进行测序；将测序结果与精神类药物相关基因的参考序列比对，确定多态性位点。其中，测序技术可以为sanger测序、焦磷酸测序、化学降解法测序、自动化测序以及基因芯片测序等中的任意一种。可以理解地，上述pcr扩增反应的反应条件为94～98℃之间的任一值如94℃、94.5℃、95℃、96.5℃、97.5℃、98℃等，2～10min中的任一值如2min、2.5min、4min、5min、5.5min、7min、9min、10min等，然后进行25～40个循环中的任一值如25个循环、27个循环、28个循环、30个循环、31个循环、32个循环、35个循环、37个循环、39个循环、40个循环等，每个循环中94～98℃中的任一值如94℃、94.5℃、95℃、95.5℃、97℃、98℃等10～90s中的任一值如10s、11s、15s、20s、25s、30s、40s、50s、60s、80s、90s等，然后55～68℃中的任一值如55℃、58℃、60℃、61℃、65℃、68℃等10～90s中的任一值如10s、13s、17s、22s、29s、32s、41s、50s、70s、85s、90s等，然后68～72℃中的任一值如68℃、69℃、69.5℃、70℃、70.5℃、71℃、72℃等30～300s中的任一值如30s、43s、47s、50s、59s、100s、141s、150s、170s、185s、190s、200s、220s、250s、260s、280s、300s等，然后68～72℃中的任一值如68℃、68.5℃、69℃、69.5℃、70℃、70.5℃、71℃、72℃等5～20min中的任一值如5min、5.5min、7min、10min、10.5min、15min、17min、20min等。另外，优选地，在上述通过pcr扩增反应扩增精神类药物相关基因之后，在通过测序技术对pcr扩增产物进行测序之前，可进一步通过电泳检测所述pcr产物，以验证所述pcr产物的扩增片段大小。与现有技术相比，本发明至少可以具有以下有益效果：(1)检测成本低，检测时间短，方便快捷，易于普及。由于采用的是pcr扩增反应结合测序的方法，可检测精神类药物的15个相关基因的62个多态性位点，操作起来非常简便。通过扩增体系及程序优化有效的缩短了扩增时间，整个检测流程3～4h便可以完成。另外，由于引物无需标记荧光，大大节约了检测成本，加上无需昂贵、复杂的设备，任何检测机构均可开展。(2)提高检测通量：本发明提供的方案可通过多重pcr同时检测8个引物对，通过一次3管多重pcr扩增反应体系可以对15个基因的62个多态性位点进行检测。可以同时检测30多例样本，不仅提高了检测效率，也很大程度的节约了成本费用。(3)扩增结果判读直观准确：本发明提供的方案能够使各个引物对的扩增产物大小充分区分，保证各扩增片段之间不会相互作用产生非特异性产物或二聚体，确保了结果的准确性。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中m为marker，a1、a2为样本1、2的第一引物组；b1、b2为样本1、2的第二引物组；c1、c2为样本1、2的第三引物组；a3、b3、c3分别为第一引物组、第二引物组、第三引物组的空白对照；图2为pcr扩增产物的部分测序结果示例。具体实施方式非特殊说明，本发明实施所采用的试剂均为市售商品，本发明实施所采用的数据库均为公开的在线数据库。以下实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例1待测dna样本的制备方法用口腔拭子收集的口腔脱落细胞或收集的新鲜外周血样本采用天根口腔拭子基因组dna提取试剂盒(dp322)或血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒(dp304)提取基因组dna，并采用np80-touch(德国implen)测定dna的浓度及纯度，然后保存基因组dna。实施例2非诊断目的精神类药物相关基因的多态性检测根据文献调研选择15个精神类药物相关基因的62种基因多态性位点如上述表1和表2所示，通过ncbi查找各多态性位点的dna序列，设计并合成本发明实施例的扩增引物，对于设计引物来说，可采用primerquest、primerpremier5.0、dnaman等在线/离线的数据库或软件对引物进行设计及二聚体、茎环错配等分析，保证各扩增片段之间不会相互作用产生非特异性产物或二聚体，然后，根据需要稀释到所需的浓度如10μm，本发明实施例的扩增引物的核苷酸序列及产物大小如表3所示。本实施例所提供的引物组覆盖了表1和表2所示的所有基因突变位点。按照实施例1步骤准备dna样本。根据表4所列的3引物组，将20个引物对分在3管扩增试剂中进行多重pcr扩增，第一组引物组合浓度配比为：pg-3：pg-4：pg-5：pg-12：pg-15：pg-16：pg-17：pg-20＝1：1：1：1：2：1：1：1；第二组引物组合浓度配比为：pg-6：pg-7：pg-8：pg-9＝1：2：1：1；第三组引物组合浓度配比为：pg-1：pg-2：pg-10：pg-11：pg-13：pg-14：pg-18：pg-19＝1：1：1：2：1：2：1：1，其对应的pcr扩增体系如表5所示。另外，引物组摩尔配比还可为第一组引物组合浓度配比为：pg-3：pg-4：pg-5：pg-12：pg-15：pg-16：pg-17：pg-20＝1：0.5：1：0.5：2：1：1：2；第二组引物组合浓度配比为：pg-6：pg-7：pg-8：pg-9＝1：0.5：1：2；第三组引物组合浓度配比为：pg-1：pg-2：pg-10：pg-11：pg-13：pg-14：pg-18：pg-19＝1：0.5：1：2：1：2：1：1，引物组摩尔配比还可为第一组引物组合浓度配比为：pg-3：pg-4：pg-5：pg-12：pg-15：pg-16：pg-17：pg-20＝2：1：1：1：2：1：1：1；第二组引物组合浓度配比为：pg-6：pg-7：pg-8：pg-9＝2：0.5：1：2；第三组引物组合浓度配比为：pg-1：pg-2：pg-10：pg-11：pg-13：pg-14：pg-18：pg-19＝2：1：1：2：1：2：2：1等。表5pcr反应体系第一组第二组第三组2*pcr反应缓冲液25μl25μl25μl2.0mmdntp12.5μl12.5μl12.5μl10μm引物组5μl4μl5μldna聚合酶2μl2μl2μlddh2o3.5μl4.5μl3.5μldna2μl2μl2μltotal50μl50μl50μl其中，扩增试剂为购买的商品化扩增试剂，包括pcrbuffer、dntp、mg2+、dna聚合酶等，本实施例采用东洋纺(toyobo)公司kodfxneo酶系(货号：kfx-201)；dna用量50ng。上述2*pcr反应缓冲液为配置pcr反应体系时pcr反应缓冲液的使用量；2.0mmdntp为配置pcr反应体系时dntp的使用浓度，10μm引物组为配置pcr反应体系时引物组的使用浓度。另外，可以理解地，通过调整2*pcr反应缓冲液、2.0mmdntp、10μm引物组、dna聚合酶、ddh2o以及模板dna的体积，使得精神类药物相关基因多态性检测反应体系中所述精神类药物相关基因多态性检测引物组浓度位于20-300nm范围中的任意一个值，例如可以为20nm、30nm、50nm、60nm、65nm、80nm、93nm、100nm、120nm、150nm、160nm、180nm、200nm、250nm以及300nm等，dna聚合酶用量位于0.2-4.0u范围中的任意一个值，例如可以为0.2u、0.3u、0.5u、0.6u、0.7u、1.0u、1.2u、1.5u、1.6u、1.8u、2.0u、2.5u、2.8u、3.0u、3.4u、3.6u、4.0u等，dntp浓度位于200-800μm范围中的任意一个值，例如可以为200μm、220μm、250μm、300μm、320μm、350μm、360μm、380μm、400μm、410μm、420μm、450μm、500μm、530μm、550μm、570μm、580μm、600μm、640μm、680μm、700μm、710μm、730μm、760μm、780μm、800μm等以及模板dna用量位于10-100ng范围中的任意一个值，例如可以为10ng、11ng、12ng、15ng、17ng、30ng、40ng、50ng、70ng、80ng、90ng以及100ng等。根据选取的扩增酶系，对退火及延伸的温度及时间进行优化，保证15个精神类药物相关基因共20个引物对在琼脂糖凝胶电泳的结果中均有明亮且单一的条带，并且扩增时间最短，其中，确定出的pcr扩增程序如表6所示。表6值得说明的是，上述预变性温度可为94～98℃之间的任一值如94℃、94.5℃、95℃、96.5℃、97.5℃、98℃等；预变性时间可为2～10min中的任一值如2min、2.5min、4min、5min、5.5min、7min、9min、10min等，变性温度可为94～98℃中的任一值如94℃、94.5℃、95℃、95.5℃、97℃、98℃等；变性时间可为10～90s中的任一值如10s、11s、15s、20s、25s、30s、40s、50s、60s、80s、90s等，退火温度可为55～68℃中的任一值如55℃、58℃、60℃、61℃、65℃、68℃等，退火时间可为10～90s中的任一值如10s、13s、17s、22s、29s、32s、41s、50s、70s、85s、90s等，延伸温度可为68～72℃中的任一值如68℃、69℃、69.5℃、70℃、70.5℃、71℃、72℃等；延伸时间可为30～300s中的任一值如30s、43s、47s、50s、59s、100s、141s、150s、170s、185s、190s、200s、220s、250s、260s、280s、300s等，上述从变性程序到延伸程序中涉及到的循环次数可为68～72℃中的任一值如68℃、69℃、69.5℃、70℃、70.5℃、71℃、72℃等30～300s中的任一值如30s、43s、47s、50s、59s、100s、141s、150s、170s、185s、190s、200s、220s、250s、260s、280s、300s等，最后延伸温度可为68～72℃中的任一值如68℃、68.5℃、69℃、69.5℃、70℃、70.5℃、71℃、72℃等；最后延伸时间可为5～20min中的任一值如5min、5.5min、7min、10min、10.5min、15min、17min、20min等。琼脂糖凝胶电泳验证并测序预先配制2％的琼脂糖凝胶，取上一步扩增的pcr扩增产物5ul点样与凝胶上，电压120v，电泳40min后于凝胶成像仪上观察pcr产物片段的大小，并拍摄清晰照片保存，其拍摄的pcr产物片段的大小反映在凝胶上的结果如图1所示。图1中所示出的m为marker，a1、a2为样本1、2的第一引物组；b1、b2为样本1、2的第二引物组；c1、c2为样本1、2的第三引物组；a3、b3、c3分别为第一引物组、第二引物组、第三引物组的空白对照。根据空白对照的电泳结果可知，环境因素对待测样本的电泳检测结果无不良影响。根据各个待测样本的电泳结果可知，存在的亮带分别对应于扩增引物对分别对应的pcr扩增产物，亮带数量与理论保持一致；亮带清晰且间隔明显，不同亮带间无重叠、无拖影等，亮带效果良好。如此，可以说明上述利用引物组进行pcr扩增时，仅生成了预期的目标产物，而未生成其他无关产物，引物组合理。验证扩增片段大小正确后将pcr扩增产物送至测序公司(北京诺赛基因组研究中心有限公司)进行序列测定。测序结果是.ab1格式的数据，通过chromas序列分析软件分析可获得精神类药物相关基因所有位点的基因突变情况，部分测序结果如图2所示。通过比较普通pcr和多重pcr测序方法，所获得的结果一致，所提供的检测方案具有较好的特异性和适用性。以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本
技术领域：
的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。sequencelisting<110>北京和合医学诊断技术股份有限公司<120>精神类药物相关基因的多态性检测引物组、试剂盒、体系和方法<160>40<170>patentinversion3.3<210>1<211>28<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因ankk1snp位点rs1800497的上游引物<400>1gtggttccacaggccaatccatctctaa28<210>2<211>28<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因ankk1snp位点rs1800497的下游引物<400>2cctcttcacctggctgcacagaataact28<210>3<211>27<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因cyp1a2snp位点rs762551的上游引物<400>3ataggctccctaccctgaaccctaaag27<210>4<211>28<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因cyp1a2snp位点rs762551的下游引物<400>4gccactgacaccaccacctgattgtaag28<210>5<211>27<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因cyp1a2snp位点rs2069514的上游引物<400>5ttgttggtgggaagaccttggaggtta27<210>6<211>27<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因cyp1a2snp位点rs2069514的下游引物<400>6cagaatcgcttgaatctgggaggaaga27<210>7<211>30<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因cyp2c9snp位点rs1057910的上游引物<400>7tcgttccatcttcttgccaagctgaccact30<210>8<211>30<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因cyp2c9snp位点rs1057910的下游引物<400>8cacacactgccagacactaggacctgttac30<210>9<211>29<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因cyp2c9snp位点rs1799853的上游引物<400>9ccagagaagtcagtgaggctgaccataca29<210>10<211>32<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因cyp2c9snp位点rs1799853的下游引物<400>10tcggagtcctaggtggagtccatagagagata32<210>11<211>30<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因cyp2c19snp位点rs4244285和rs4986893的上游引物<400>11tttcatcctgggctgtgctccctgcaatgt30<210>12<211>30<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因cyp2c19snp位点rs4244285和rs4986893的下游引物<400>12cacgtgccatggtggtctcctgcacctatg30<210>13<211>29<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因cyp2c19snp位点rs12248560的上游引物<400>13ggagaccaggaggtcaagaagccttagtt29<210>14<211>29<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因cyp2c19snp位点rs12248560的下游引物<400>14tgttgagctcatagctggcagaactggga29<210>15<211>30<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因htr1asnp位点rs6295的上游引物<400>15gtgtccccgactctccattcacactcttct30<210>16<211>30<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因htr1asnp位点rs6295的下游引物<400>16actgagggagtaaggctggactgttagatg30<210>17<211>31<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因scn1asnp位点rs3812718的上游引物<400>17ttctagtggcaaacttcctcaggaagagacc31<210>18<211>23<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因scn1asnp位点rs3812718的下游引物<400>18ccgagacattgcccaggtccaca23<210>19<211>31<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因ephx1snp位点rs2234922的上游引物<400>19gggcactaagggtggcaggactcaatatcta31<210>20<211>29<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因ephx1snp位点rs2234922的下游引物<400>20ggagcttggtccagcagagaggtctaatg29<210>21<211>29<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因c3snp位点rs2277984的上游引物<400>21gaggtgtcttggggtctgagggatctgag29<210>22<211>30<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因c3snp位点rs2277984的下游引物<400>22tgagacagggtctaagtcccactccttatc30<210>23<211>30<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因drd2snp位点rs1799732的上游引物<400>23tgaccggccggtgcttaccttcaagccata30<210>24<211>30<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因drd2snp位点rs1799732的下游引物<400>24ccacccagcctgcaatcacagcttattact30<210>25<211>30<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因epm2asnp位点rs1415744的上游引物<400>25tgggcagagatgattggaaacctggaagag30<210>26<211>29<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因epm2asnp位点rs1415744的下游引物<400>26gcttacataactagaggtgagaagccaggt30<210>27<211>32<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因leprsnp位点rs1137101的上游引物<400>27ggagcagtctctgacaaacatgagcctctaag32<210>28<211>30<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因leprsnp位点rs1137101的下游引物<400>28ctccaacagccaaactcaacgacactctcc30<210>29<211>30<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因mc4rsnp位点rs489693的上游引物<400>29gtgagagctctaccctgtggtctcagtttc30<210>30<211>30<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因mc4rsnp位点rs489693的下游引物<400>30ggtgatcaagggccaaacaggctgatctta30<210>31<211>29<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因ugt1a9snp位点rs2741049的上游引物<400>31cgcacctgccatggatggtatagacaaag29<210>32<211>29<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因ugt1a9snp位点rs2741049的下游引物<400>32gtcagggaaagccgttgcctatggtaagt29<210>33<211>29<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因fkbp5snp位点rs4713916的上游引物<400>33ctgtagtcccagctactcgggaagttgag29<210>34<211>30<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因fkbp5snp位点rs4713916的下游引物<400>34cagcaaccctaacctctctggactcctaca30<210>35<211>30<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因ephx1snp位点rs1051740的上游引物<400>35tctgagccaccccacttggcctgggtctaa30<210>36<211>29<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因ephx1snp位点rs1051740的下游引物<400>36tttgggagtagccagtgatgtgggaaact29<210>37<211>30<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因cyp2d6的上游引物<400>37cagtggcctggcacagatcatagcctatac30<210>38<211>30<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因cyp2d6的下游引物<400>38catgcatccaccacccactccaaccctatg30<210>39<211>30<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因cyp2d6的上游引物<400>39gtagtgggaggtaggtagccctggcatata30<210>40<211>29<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>用于pcr扩增基因cyp2d6的下游引物<400>40actgggagcaaggtggatgcacaaagagt29当前第1页12