一种提高灵芝细胞培养中灵芝酸含量的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体是一种通过对灵芝细胞进行单核化，然后经两阶段培养提高灵芝酸的方法。

背景技术：

灵芝又名仙草，是中国传统的药用真菌，是真菌界，担子菌亚门，层菌纲，多孔菌目，多孔菌科，灵芝属的高等真菌。灵芝具有抗癌，调节血糖，调节血压，保护肝脏，增强免疫力等作用。四环三萜类化合物灵芝酸是灵芝的主要活性成分之一，具有抗hiv、抗癌及抗氧化等药理活性。研究表明，不同的单体灵芝酸具有不同的生物学活性，例如：灵芝酸mk可通过线粒体途径抑制hela细胞的增殖并诱导细胞调亡（liurm，etal.phytomedicine,2011;18,349-355;tangw,etal.lifesciences,2006;80,205-211）。灵芝酸t具有诱导肺癌细胞凋亡活性（tangw,etal.lifesciences,2006;80,205-211）。而灵芝酸me具有抑制肺癌细胞转移的活性（chennh,etal.journalofpharmacologicalsciences,2008;108,212-216wangg,etal.internationalimmunopharmacology,2007;7,864-870）。经检索发现，提高细胞内灵芝酸含量的方法主要分为以下几大类：一、发酵策略的开发，如中国发明申请cn1375557a公开了如下内容：生物反应器中灵芝细胞两阶段培养生产灵芝酸的方法，可以高效率生产灵芝酸，总灵芝酸含量达5mg/100mg细胞干重；二、培养过程中添加诱导剂，如中国发明专利cn101692772a中公开了一种在灵芝细胞的两阶段培养中添加苯巴比妥或咪康唑来提高灵芝酸含量的方法，此方法使单体灵芝酸的含量分别提高了32%-55%和10%-28%，总灵芝酸含量比对照提高了45%和15%。中国发明专利cn105483197b公开了一种通过添加钙离子和水杨酸提高灵芝液体发酵中三萜含量的方法，此方法能够显著提高灵芝菌丝中三萜的含量，菌丝中三萜含量达4.89mg/100mg细胞干重，比对照组高48.26%。三、基因工程技术改造菌株，如中国发明专利cn105567578a公开了一种过表达se基因提高灵芝细胞中灵芝酸含量的方法，使se转化菌株的单体灵芝酸含量相较于对照提高了20%-150%。中国发明专利cn105296367b公开一种异源表达vgb基因提高灵芝酸含量的方法，vgb转化菌株的单体灵芝酸含量是对照的2.1-3.6倍。细胞单核化目前主要应用在灵芝的杂交育种方面；而通过单核化来提高两阶段培养中灵芝酸含量的方法尚未见报道。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供了一种通过灵芝细胞单核化提高两阶段培养中灵芝酸含量的方法。

本发明方法是将双核的灵芝细胞通过原生质体单核化，将单核化的细胞作为初始菌种，在25-30℃下进行两阶段培养发酵，实现提高灵芝酸含量的目的；通过本发明方法的实施，灵芝中单体灵芝酸含量和总灵芝酸含量均显著提高，与双核灵芝细胞相比，单核灵芝细胞的单体灵芝酸ga-mk、ga-t、ga-me的含量和总灵芝酸含量分别提高了2.4-4倍、2-2.6倍、1.7-2.2倍和1.5倍以上。

本发明的方法的具体操作步骤如下：

一、双核灵芝细胞种子液的制备

1、配制土豆琼脂培养基

2、灵芝细胞活化：利用接种铲从灵芝双核菌株斜面中取出两块1cm³的菌块，将菌块置于新配制的土豆琼脂培养基斜面上，培养5-7天待用。

3、配制液体种子培养基

利用接种铲将生长于土豆琼脂培养基斜面上的细胞接入含有直径5mm玻璃珠的液体种子培养基中，25-30℃下静置培养4-5天，获得一级种子培养液；将一级种子培养液，接入含有直径5mm玻璃珠的液体种子培养基中，25-30℃下静置培养2-3天，获得二级种子液。

二、原生质体的制备与再生

1、配制柠檬酸缓冲液

2、在12000rpm下离心收集二级种子液细胞，然后用柠檬酸缓冲液将收集的细胞清洗两次，称重；

3、根据细胞重量称取溶壁酶，按每200-300mg（湿重）细胞称取溶壁酶0.04g的比例，在称好的溶壁酶中添加柠檬酸缓冲液并定容，然后使用无菌的0.22μm滤膜过滤后加入装有细胞的离心管中，轻弹混匀；

4、将混匀的细胞置于30℃、100rpm的摇床中，酶解150min，每隔30min颠倒摇晃一次；

5、将酶解完毕的细胞在1700g下离心5min，弃上清，然后用柠檬酸缓冲液清洗残留物两次；清洗完毕后加入适量柠檬酸缓冲液，轻弹混匀，然后用520目的尼龙网过滤，除去碎菌丝；

6、吸取100μl步骤5滤液，将其置于血球计数板上在显微镜下观察，计算原生质体个数；

7、配制原生质体再生培养基(cym)

8、取1×10⁴-1×10⁵个原生质体加入到15mlcym培养基中，然后将培养基倒入直径9cm培养皿中，于25-30℃下培养3-5天。

三、单核化鉴定

从25-30℃培养箱中取出平板，挑取单菌落接种于新鲜的土豆琼脂培养基斜面上，待其生长4-5天，再从斜面上取出一块置于倒有土豆琼脂培养基的培养皿上，并在离菌块1cm处斜插下玻璃片（经过灭菌），将培养皿放置于25-30℃中培养4-6天。

1、4',6-二脒基-2-苯基吲哚（dapi）核染色鉴定

将所得的带有菌丝的玻璃片放入0.1μg/ml的dapi溶液中染色5min，然后用镊子夹出玻璃片，放入ph为7的0.01mol/l的磷酸缓冲盐溶液（pbs）漂洗5min，置于倒置荧光显微镜下观察。

2、snp位点鉴定

将所得的菌丝用接种铲刮下，利用十六烷基三甲基溴化铵（ctab）法提取基因组dna，

以基因组dna为模板，使用引物mip-f:atgacacggacctcatagcct；

mip-r：atgtcgctcagcctgtccaa，进行pcr扩增；然后回收pcr产物，测序。

四、单双核灵芝两阶段培养

1、配制发酵培养基

2、将鉴定为单核和双核的灵芝分别接种于土豆培养基斜面上，25-30℃下培养5-7天；

3、利用接种铲将生长于土豆培养基斜面上的细胞接入液体种子培养基中，25-30℃下振荡培养4-5天，获得发酵一级种子培养液；

4、将一级种子培养液接入液体种子培养基中，25-30℃下振荡培养2-3天，获得二级种子液；

5、将单核和双核的二级种子液分别接种到发酵培养基中，接种量是每50ml发酵培养基接种5ml二级种子培养液，进行两阶段培养；所述两阶段培养是将单核化的灵芝细胞接种到液体种子培养基中进行培养，获得种子液，将种子液接种于液体发酵培养基中，在25-30℃下振荡培养2-4天后，发酵液在25-30℃下继续静置培养8-10天。

五、提取灵芝酸及测定灵芝酸含量。

采用常规方法从发酵产物中提取收集灵芝酸并进行单体灵芝酸含量的测定（方法参照xujw,etal.appliedmicrobiologyandbiotechnology,2010:85,941-949;xujw,etal.appliedandenvironmentalmicrobiology,2012:78,7968-7976）。

本发明中涉及的双核灵芝菌株(ganodermalucidum)为cgmcc5.26、cgmcc5.616、cgmcc5.542，菌株均从中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(cgmcc)购买。

本发明优点和技术效果：

1、利用本发明将灵芝菌株进行单核化，然后以单核化的菌株进行两阶段培养，可使灵芝细胞中单体灵芝酸含量和总灵芝酸含量显著提高，相较于双核灵芝，本发明可使细胞中单体灵芝酸ga-mk，ga-t，ga-me含量和总灵芝酸含量分别提高2.4-4倍，2-2.6倍，1.7-2.2倍和1.5倍；

2、本发明方法简单、易操作，适于工业化生产和市场推广应用。

附图说明

图1为双核菌丝细胞荧光显微镜下形态图；

图2为双核菌丝细胞dapi染色结果示意图图；

图3为双核菌丝细胞的snp位点测序结果；

图4为单核菌丝细胞荧光显微镜下形态图；

图5为单核菌丝细胞dapi染色图；

图6为单核菌丝细胞的snp位点测序结果。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂，本发明方法适用的菌株也不限于下述三种灵芝菌株。

实施例1

一、双核灵芝细胞种子液制备

1、配制土豆琼脂培养基

土豆琼脂培养基的配方：200g去皮土豆加1l水煮沸30min过滤得到的滤液、葡萄糖10g、无水硫酸镁1.5g、磷酸二氢钾3g、维生素b10.05g、琼脂20g，用水定容至1l，ph为5.5。

2、灵芝细胞活化：利用接种铲分别从灵芝双核菌株(ganodermalucidum)cgmcc5.26、cgmcc5.616、cgmcc5.542的原始培养基斜面中取出两块1cm³的菌块，将菌块置于新配制的土豆琼脂培养基斜面上，30℃下培养5天待用；

3、配制液体种子培养基

种子培养基的配方：葡萄糖35g、蛋白胨5g、酵母粉2.5g、无水硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1g、维生素b10.05g，用水定容至1l，ph为5.5。

利用接种铲将生长于土豆琼脂培养基斜面上的细胞接入含有直径5mm玻璃珠的液体种子培养基中，30℃下静置培养4天，获得一级种子培养液；将一级种子培养液，接入含有直径5mm玻璃珠的液体种子培养基中，30℃下静置培养3天，获得二级种子液。

二、原生质体制备及再生

1、配制柠檬酸缓冲液

柠檬酸缓冲液的配方：（1）柠檬酸溶液配制：称取21.91g甘露醇和4.2g柠檬酸，定容至200ml；（2）柠檬酸钠溶液配制：称取54.78g甘露醇和14.7g柠檬酸钠，定容至500ml；（3）将柠檬酸溶液缓慢倒入柠檬酸钠溶液中，至ph为5.5时停止加入。

2、在12000rpm下离心收集二级种子液细胞，然后用柠檬酸缓冲液将收集的细胞清洗两次，称重；

3、取每种细胞200mg（湿重），在0.04g溶壁酶中添加柠檬酸缓冲液并定容至1.7ml，然后使用无菌的0.22μm滤头过滤后加入装有细胞的离心管中，轻弹混匀；

4、将混匀的细胞置于30℃、100rpm的摇床中，酶解150min，每隔30min颠倒摇晃一次；

5、将酶解完毕的细胞在1700g下离心5min，弃上清，然后用柠檬酸缓冲液清洗残留物两次；清洗完毕后加入柠檬酸缓冲液，轻弹混匀，然后用520目的尼龙网过滤，除去碎菌丝；

6、吸取100μl步骤5滤液，将其置于血球计数板上在显微镜下观察，计算原生质体个数；

7、配制原生质体再生培养基(cym)

原生质体再生培养基（cym）配方：葡萄糖20g、蛋白胨2g、酵母粉2g、无水硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾2.3g、麦芽糖1g、甘露醇109.56g、低熔点琼脂糖10g，用水定容至1l；8、取1×10⁵个原生质体加入到15mlcym里，然后将培养基倒入直径9cm培养皿中，于30℃的培养箱中培养4天。

三、单核化鉴定

从30℃的培养箱中取出平板，挑取单菌落接种于新鲜的土豆琼脂培养基斜面上，待其生长4天，再从斜面上取出一块置于倒有土豆琼脂培养基的培养皿上，并在离菌块1cm处斜插下玻璃片（经过灭菌），将培养皿放置于30℃中培养5天。

1、dapi核染色鉴定

将带有菌丝的玻璃片放入0.1μg/ml的dapi溶液中染色5min，然后用镊子夹出玻璃片，放入ph为7的0.01mol/l的pbs缓冲液中漂洗5min，即时置于倒置荧光显微镜下观察（图1、2、4、5）；从图中可以看出在波长为358nm紫外光的激发下，dapi染色的细胞，细胞核会发出波长为461nm的蓝光；双核菌株在染色后，在一根菌丝上会出现两个发蓝光的细胞核，单核细胞的菌丝仅有一个。

2、snp位点鉴定

将上一步所得菌丝用接种铲刮下，利用ctab法提取基因组dna，然后使用引物mip-f:atgacacggacctcatagcct；mip-r：atgtcgctcagcctgtccaa进行pcr扩增，pcr扩增体系（50μl）为25μl2×taqpcrmastermixⅱ、2μlmip-f、2μlmip-r、1μldna、20μlddh2o；

pcr扩增条件为：（1）94℃，5min；（2）94℃，30s；（3）55℃，30s；（4）72℃，30s；（5）72℃，5min；（6）4℃，30min；（2）至（4）循环30次，然后回收pcr产物，测序；结果见图3、6；双核菌株的序列峰图上多个位点会出现多个重叠峰和双峰，图3中箭头指向位置，而单核菌株序列峰图的对应位置则只有单峰（图6）。

通过对灵芝cgmcc5.26、cgmcc5.616、cgmcc5.542三种双核菌株进行单核化后，分别获得到上述三种菌株对应的单核菌株cgmcc5.26-1、cgmcc5.616-1、cgmcc5.542-1。

实施例2：单核和双核灵芝的两阶段培养

1、配制发酵培养基

发酵培养基的配方：乳糖35g、蛋白胨5g、酵母粉5g、无水硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1g、维生素b10.05g，用水定容至1l，ph为6.0；

2、将鉴定为cgmcc5.26的双核和cgmcc5.26-1的单核菌株分别接种于土豆琼脂培养基斜面上，30℃下培养5天；

3、利用接种铲将生长于土豆培养基斜面上的细胞接入液体种子培养基中，30℃下震荡培养5天，获得发酵一级种子培养液；

4、将一级种子培养液接入液体种子培养基中，30℃下振荡培养2天，获得二级种子液；

5、将单核化菌株的二级种子液和双核菌株的二级种子液分别接种到发酵培养基中，接种量是每50ml发酵培养基接种5ml二级种子培养液，30℃下振荡培养2天；

6、将发酵培养液分别倒入直径为9cm的培养皿中，30℃下静置培养9天；

7、总灵芝酸的提取分析

将步骤6发酵液离心收集细胞，37℃干燥5天，称重研磨，称取25mg磨碎的细胞干粉，加入0.5ml体积浓度70%的乙醇溶液浸泡过夜，4℃超声1.5h，10000rpm离心5min，吸取上清液，40℃下真空干燥两天，加250μl水分散涡旋，加250μl氯仿萃取分散后的水相两次，收集合并氯仿相，共计0.5ml，取0.5ml质量浓度5%的碳酸氢钠溶液和氯仿相混合涡旋三次，收集合并上层水相，共计1.5ml，用2mol/l盐酸将水相ph调至3.0以下，然后使用与水相等体积的氯仿萃取两次，收集合并氯仿相，室温下干燥，利用500μl无水乙醇溶解，245nm测吸光值。

8、单体灵芝酸的提取分析

将步骤6发酵液离心收集细胞，37℃干燥5天，称重研磨，称取100mg磨碎的细胞干粉，加入2ml体积浓度70%的乙醇溶液浸泡过夜，4℃下超声2.5h，12000rpm离心5min，吸取上清液，40℃下真空干燥，加200μl甲醇，涡旋，用0.22μm滤膜过滤，高效液相色谱分析三种单体灵芝酸的含量。

结果如表1所示，双核菌株的细胞干重是5.882±0.02g/l，单体灵芝酸ga-mk、ga-t、ga-me和总灵芝酸分别是19.63±0.194μg/100mg细胞干重，62.881±1.963μg/100mg细胞干重，5.682±0.252μg/100mg细胞干重和1.299±0.043mg/100mg细胞干重。

单核菌株的细胞干重是12.155±0.072g/l，单体灵芝酸ga-mk、ga-t，ga-me和总灵芝酸分别是84.214±6.404μg/100mg细胞干重，163.936±7.638μg/100mg细胞干重，12.235±1.751μg/100mg细胞干重和1.991±0.029mg/100mg细胞干重。

与双核菌株相比，单核菌株的细胞干重、单体灵芝酸、总灵芝酸都显著提高，单核菌株的细胞干重是双核菌株的2.3倍，单核菌株的单体灵芝酸ga-mk、ga-t、ga-me含量分别是双核菌株的4.3、2.6、2.2倍，单核菌株的总灵芝酸含量是双核菌株的1.5倍。

表1

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实施例3：单核和双核灵芝的两阶段培养

1、配制发酵培养基

发酵培养基的配方：乳糖35g、蛋白胨5g、酵母粉5g、无水硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1g、维生素b10.05g，用水定容至1l，ph为5.5；

2、将鉴定为cgmcc5.616的双核和cgmcc5.616-1的单核菌株分别接种于土豆琼脂培养基斜面上，28℃下培养5天；

3、利用接种铲将生长于土豆培养基斜面上的细胞接入液体种子培养基中，28℃下震荡培养5天，获得发酵一级种子培养液；

4、将一级种子培养液接入液体种子培养基中，28℃下振荡培养2天，获得二级种子液；

5、将单核化菌株的二级种子液和双核菌株的二级种子液分别接种到发酵培养基中，接种量是每50ml发酵培养基接种5ml二级种子培养液，28℃下振荡培养3天；

6、将发酵培养液分别倒入直径为9cm的培养皿中，28℃下静置培养8天；

7、总灵芝酸的提取分析

将步骤6发酵液离心收集细胞，于37℃干燥5天，称重研磨，称取25mg磨碎的细胞干粉，加入0.5ml体积浓度70%的乙醇溶液浸泡过夜，4℃超声1.5h，10000rpm离心5min，吸取上清液，40℃下真空干燥两天，加250μl水分散涡旋，加250μl氯仿萃取分散后的水相两次，收集合并氯仿相，共计0.5ml，取0.5ml质量浓度5%的碳酸氢钠溶液和氯仿相混合涡旋三次，收集合并上层水相，共计1.5ml，用2mol/l盐酸将水相ph调至3.0以下，然后使用与水相等体积的氯仿萃取两次，收集合并氯仿相，室温下干燥，利用500μl无水乙醇溶解，245nm测吸光值。

8、单体灵芝酸的提取分析

将步骤6发酵液离心收集细胞，于37℃干燥5天，称重研磨，称取100mg磨碎的细胞干粉，加入2ml体积浓度70%的乙醇溶液浸泡过夜，4℃下超声2.5h，12000rpm离心5min，吸取上清液，40℃下真空干燥，加200μl甲醇，涡旋，用0.22μm滤膜过滤，高效液相色谱分析三种单体灵芝酸的含量。

结果如表2所示，双核菌株的细胞干重是10.451±0.112g/l，单体灵芝酸ga-mk、ga-t、ga-me和总灵芝酸分别是25.451±0.889μg/100mg细胞干重、131.343±0.773μg/100mg细胞干重、66.617±7.355μg/100mg细胞干重和0.562±0.011mg/100mg细胞干重。

单核菌株的细胞干重是12.512±0.639g/l，单体灵芝酸ga-mk、ga-t、ga-me和总灵芝酸分别是73.617±0.577μg/100mg细胞干重、292.911±2.721μg/100mg细胞干重、115.151±4.327μg/100mg细胞干重和0.863±0.014mg/100mg细胞干重。

与双核菌株相比，单核菌株的细胞干重、单体灵芝酸、总灵芝酸都显著提高，单核菌株的细胞干重是双核菌株的1.2倍，单核菌株的单体灵芝酸ga-mk、ga-t、ga-me含量分别是双核菌株的2.9、2.2、1.7倍，单核菌株的总灵芝酸含量是双核菌株的1.5倍。

表2

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实施例4：单核和双核灵芝的两阶段培养

1、配制发酵培养基

发酵培养基的配方：乳糖35g、蛋白胨5g、酵母粉5g、无水硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1g、维生素b10.05g，用水定容至1l，ph为5.8；

2、将鉴定为cgmcc5.616的双核和cgmcc5.616-1的单核菌株分别接种于土豆琼脂培养基斜面上，25℃下培养5天；

3、利用接种铲将生长于土豆培养基斜面上的细胞接入液体种子培养基中，25℃下震荡培养5天，获得发酵一级种子培养液；

4、将一级种子培养液接入液体种子培养基中，25℃下振荡培养2天，获得二级种子液；

5、将单核化菌株的二级种子液和双核菌株的二级种子液分别接种到发酵培养基中，接种量是每50ml发酵培养基接种5ml二级种子培养液，25℃下振荡培养4天；

6、将发酵培养液分别倒入直径为9cm的培养皿中，25℃下静置培养10天；

7、总灵芝酸的提取分析

将步骤6发酵液离心收集细胞，于37℃干燥5天，称重研磨，称取25mg磨碎的细胞干粉，加入0.5ml体积浓度70%的乙醇溶液浸泡过夜，4℃超声1.5h，10000rpm离心5min，吸取上清液，40℃下真空干燥两天，加250μl水分散涡旋，加250μl氯仿萃取分散后的水相两次，收集合并氯仿相，共计0.5ml，取0.5ml质量浓度5%的碳酸氢钠溶液和氯仿相混合涡旋三次，收集合并上层水相，共计1.5ml，用2mol/l盐酸将水相ph调至3.0以下，然后使用与水相等体积的氯仿萃取两次，收集合并氯仿相，室温下干燥，利用500μl无水乙醇溶解，245nm测吸光值。

8、单体灵芝酸的提取分析

将步骤6发酵液离心收集细胞，于37℃干燥5天，称重研磨，称取100mg磨碎的细胞干粉，加入2ml体积浓度70%的乙醇溶液浸泡过夜，4℃下超声2.5h，12000rpm离心5min，吸取上清液，40℃下真空干燥，加200μl甲醇，涡旋，用0.22μm滤膜过滤，高效液相色谱分析三种单体灵芝酸的含量。

结果如表3所示，双核菌株的细胞干重是9.311±0.672g/l，单体灵芝酸ga-mk、ga-t、ga-me和总灵芝酸分别是27.068±1.079μg/100mg细胞干重，95.072±0.773μg/100mg细胞干重，41.541±2.167μg/100mg细胞干重和0.557±0.03mg/100mg细胞干重。单核菌株的细胞干重是11.778±0.268g/l，单体灵芝酸ga-mk、ga-t、ga-me和总灵芝酸分别是64.496±1.215μg/100mg细胞干重、188.263±0.447μg/100mg细胞干重、73.718±1.083μg/100mg细胞干重和0.813±0.015mg/100mg细胞干重。

与双核菌株相比，单核菌株的细胞干重、单体灵芝酸、总灵芝酸都显著提高，单核菌株的细胞干重是双核菌株的1.3倍，单核菌株的单体灵芝酸ga-mk、ga-t、ga-me含量分别是双核菌株的2.4、2.0、1.8倍，单核菌株的总灵芝酸含量是双核菌株的1.5倍；

表3

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序列表

<110>昆明理工大学

<120>一种提高灵芝细胞培养中灵芝酸含量的方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>1

atgacacggacctcatagcct21

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>2

atgtcgctcagcctgtccaa20