一种指导抑郁症用药的基因多态性检测试剂盒及检测方法与流程

本发明属于生物医药领域，涉及一种用于指导抑郁症用药的基因多态性位点的检测试剂盒及检测方法。

背景技术：

截止2015年，全球有超过3亿人群有患有抑郁症，约占全球人口的4.4%，每年都有超过800,000抑郁症患者自杀。其中中国的抑郁症患者人数超过5000万，居全球之首。

抑郁症患者在治疗过程中常面临选药周期长（一般大约需要1年时间才能确定合适的药物，可能延误最佳治疗时机），治疗效果不佳或药物毒副作用的风险（药物有效率约30%~50%），极大增加了治疗费用，同时也给国家和社会造成了很大的负担。

药物基因组学检测有助于医生在给患者初次诊疗时，发现存在不良反应和治疗失败风险的个体，因为帮助选择合适的药物并制定科学的起始剂量；并在治疗过程中，从基因的角度寻找发生不良反应和无应答或应答率低的原因，有助于及时调整治疗方案，改善治疗效果。根据已有的多个针对抗抑郁类用药基因检测的社会经济学评估数据，药物基因组学在节省医疗成本、降低就医次数、提高治疗效果具有极大的帮助。

目前市面上针对基因多态检测的主流为高通量测序（ngs），但其测序费用较高，耗时较长，因此临床应用上有一定的局限性；也可采用实时荧光定量pcr进行多孔反应检测，虽然满足时效问题，但其通量较低，当需检测超过10个以上的位点时，其实际应用性不强。

目前存在的技术问题是：常见的检测技术，如测序、荧光定量pcr等，均需对位点逐一进行检测，当位点较多时操作复杂，费用较高；而现有的基于多重pcr的核酸质谱检测同类产品单一，基因位点的选择和组合方式，与传统的测序、实时荧光定量pcr等方法的检测产品相比偏少，缺乏能一次性同时、全面检测多个指导抑郁症用药的基因多态性的方法和产品。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种指导抑郁症用药的基因多态性的检测方法，能在同一体系中针对同一个体的多个snp进行检测；

本发明的另一目的在于提供一种指导抑郁症用药的基因多态性的检测试剂盒，配合上述检测方法使用，包含检测所需的所有试剂，方便操作，节省时间，提高效率；

本发明的另一目的在于以上检测方法以及试剂盒为抑郁症的合理用药提供参考依据。

为达前述目的，本发明提供一种指导抑郁症用药的基因多态性检测试剂盒，通过对精神类疾病药物发挥作用相关的药物代谢酶、转运体及受体相关的26个基因、55个位点进行定性分型检测，指导药物剂量与药物种类的合理选择，从而提高药物疗效、避免副反应，主要涉及精神抑郁症相关疾病。所述指导抑郁症用药的基因多态性检测试剂盒包括：用于检测55个指导抑郁症用药的基因多态性位点的扩增引物及延伸引物，分别为：

cnr1基因rs1049353位点，其扩增引物为seqidno:1-2，延伸引物为seqidno:111；por基因rs1057868位点，其扩增引物为seqidno:3-4，延伸引物为seqidno:112；cyp2c19基因rs12248560位点，其扩增引物为seqidno:5-6，延伸引物为seqidno:113；htr2c基因rs1414334位点，其扩增引物为seqidno:7-8，延伸引物为seqidno:114；drd2基因rs1799732位点，其扩增引物为seqidno:9-10，延伸引物为seqidno:115；drd2基因rs1799978位点，其扩增引物为seqidno:11-12，延伸引物为seqidno:116；adra2a基因rs1800544位点，其扩增引物为seqidno:13-14，延伸引物为seqidno:117；ugt2b15基因rs1902023位点，其扩增引物为seqidno:15-16，延伸引物为seqidno:118；grik4基因rs1954787位点，其扩增引物为seqidno:17-18，延伸引物为seqidno:119；cyp2d6基因rs28371706位点，其扩增引物为seqidno:19-20，延伸引物为seqidno:120；cyp2b6基因rs3211371位点，其扩增引物为seqidno:21-22，延伸引物为seqidno:121；cyp2b6基因rs34223104位点，其扩增引物为seqidno:23-24，延伸引物为seqidno:122；cyp2b6基因rs8192709位点，其扩增引物为seqidno:25-26，延伸引物为seqidno:123；cyp3a4基因rs35599367位点，其扩增引物为seqidno:27-28，延伸引物为seqidno:124；cyp2d6基因rs35742686位点，其扩增引物为seqidno:29-30，延伸引物为seqidno:125；cyp2b6基因rs3745274位点，其扩增引物为seqidno:31-32，延伸引物为seqidno:126；cyp2d6基因rs3892097位点，其扩增引物为seqidno:33-34，延伸引物为seqidno:127；cyp2d6基因rs5030865位点，其扩增引物为seqidno:35-36，延伸引物为seqidno:128；cyp2d6基因rs1135824位点，其扩增引物为seqidno:37-38，延伸引物为seqidno:129；cyp2d6基因rs5030655位点，其扩增引物为seqidno:39-40，延伸引物为seqidno:130；fkbp5基因rs4713916位点，其扩增引物为seqidno:41-42，延伸引物为seqidno:131；mc4r基因rs489693位点，其扩增引物为seqidno:43-44，延伸引物为seqidno:132；htr2a基因rs6313位点，其扩增引物为seqidno:45-46，延伸引物为seqidno:133；cyp3a5基因rs776746位点，其扩增引物为seqidno:47-48，延伸引物为seqidno:134；htr2a基因rs7997012位点，其扩增引物为seqidno:49-50，延伸引物为seqidno:135；rabep1基因rs1000940位点，其扩增引物为seqidno:51-52，延伸引物为seqidno:136；htr1a基因rs10042486位点，其扩增引物为seqidno:53-54，延伸引物为seqidno:137；cyp2d6基因rs1065852位点，其扩增引物为seqidno:55-56，延伸引物为seqidno:138；abcb1基因rs10245483位点，其扩增引物为seqidno:57-58，延伸引物为seqidno:139；cyp2c19基因rs12769205位点，其扩增引物为seqidno:59-60，延伸引物为seqidno:140；htr1b基因rs130058位点，其扩增引物为seqidno:61-62，延伸引物为seqidno:141；ankk1基因rs1800497位点，其扩增引物为seqidno:63-64，延伸引物为seqidno:142；cyp2b6基因rs2279343位点，其扩增引物为seqidno:65-66，延伸引物为seqidno:143；cyp2d6基因rs28371725位点，其扩增引物为seqidno:67-68，延伸引物为seqidno:144；cyp2d6基因rs16947位点，其扩增引物为seqidno:69-70，延伸引物为seqidno:145；cyp2b6基因rs28399499位点，其扩增引物为seqidno:71-72，延伸引物为seqidno:146；cyp2c19基因rs28399504位点，其扩增引物为seqidno:73-74，延伸引物为seqidno:147；abcb1基因rs4148739位点，其扩增引物为seqidno:75-76，延伸引物为seqidno:148；znf385d基因rs4261893位点，其扩增引物为seqidno:77-78，延伸引物为seqidno:149；bdnf基因rs61888800位点，其扩增引物为seqidno:79-80，延伸引物为seqidno:150；htr1a基因rs6295位点，其扩增引物为seqidno:81-82，延伸引物为seqidno:151；htr2a基因rs6311位点，其扩增引物为seqidno:83-84，延伸引物为seqidno:152；htr2c基因rs6318位点，其扩增引物为seqidno:85-86，延伸引物为seqidno:153；cyp1a2基因rs762551位点，其扩增引物为seqidno:87-88，延伸引物为seqidno:154；abcb1基因rs1045642位点，其扩增引物为seqidno:89-90，延伸引物为seqidno:155；cyp2d6基因rs1135840位点，其扩增引物为seqidno:91-92，延伸引物为seqidno:156；cyp2d6基因rs1135835位点，其扩增引物为seqidno:93-94，延伸引物为seqidno:157；fkbp5基因rs1360780位点，其扩增引物为seqidno:95-96，延伸引物为seqidno:158；cyp2c9基因rs1799853位点，其扩增引物为seqidno:97-98，延伸引物为seqidno:159；abcb1基因rs2032583位点，其扩增引物为seqidno:99-100，延伸引物为seqidno:160；abcb1基因rs2032582位点，其扩增引物为seqidno:101-102，延伸引物为seqidno:161；abcb1基因rs2235040位点，其扩增引物为seqidno:103-104，延伸引物为seqidno:162；faah基因rs324420位点，其扩增引物为seqidno:105-106，延伸引物为seqidno:163；sh2b1基因rs3888190位点，其扩增引物为seqidno:107-108，延伸引物为seqidno:164；cyp2c19基因rs4986893位点，其扩增引物为seqidno:109-110，延伸引物为seqidno:165。

在一个具体的实例中，所述扩增引物的5'端包括保护碱基序列，以使得所述扩增引物的分子量增大，可避免反应剩余的引物一并进入质谱检测过程中干扰检测效果。优选地，所述保护碱基序列包括5-10个碱基；作为一个具体的实例，所述保护碱基序列为10bp的tag：agcttggaag。

在一个具体的实例中，所述延伸引物的5'端包括碱基序列，增加所述碱基序列的目的在于当两个基因多态位点对应的延伸引物及产物的分子量接近时，通过给其中一个延伸引物或两个延伸引物都增加碱基，改变引物及其产物的分子量，与其他延伸引物及产物的分子量之间拉大差距，提高检测效果；但增加所述碱基序列后的引物及产物的分子量，都不应超出检测窗口。作为一个具体的实例，所述碱基序列同前述保护碱基序列。

具体的，所述抑郁症用药辅助的基因多态性检测试剂盒还包括：

（1）pcr反应试剂，包括：耐高温的dna聚合酶，dntps，pcr反应缓冲液；

（2）pcr产物纯化试剂，包括：碱性磷酸酶，酶切反应缓冲液；

（3）单碱基延伸反应试剂，包括：pcr产物的特异性延伸引物，耐高温的单碱基延伸酶，ddntps，延伸反应缓冲液。

具体的，所述抑郁症用药辅助的基因多态性检测试剂盒还包括：阴性质控品，阳性质控品。

具体的，所述抑郁症用药辅助的基因多态性检测试剂盒还包括：延伸产物纯化用树脂，点样及质谱检测用靶片，人基因组dna提取试剂。

本发明还提供一种基于前述抑郁症用药辅助的基因多态性检测试剂盒的检测方法，包括步骤：

（1）多重pcr：使用特异性扩增引物，在三个反应体系中，对总计55个指导抑郁症用药的基因多态性位点所在dna区域同时进行扩增，得到含55处基因多态位点的pcr产物；其中，反应体系1内包括如下基因多态性位点的扩增引物及延伸引物：

cnr1基因rs1049353位点，其扩增引物为seqidno:1-2，延伸引物为seqidno:111；por基因rs1057868位点，其扩增引物为seqidno:3-4，延伸引物为seqidno:112；cyp2c19基因rs12248560位点，其扩增引物为seqidno:5-6，延伸引物为seqidno:113；htr2c基因rs1414334位点，其扩增引物为seqidno:7-8，延伸引物为seqidno:114；drd2基因rs1799732位点，其扩增引物为seqidno:9-10，延伸引物为seqidno:115；drd2基因rs1799978位点，其扩增引物为seqidno:11-12，延伸引物为seqidno:116；adra2a基因rs1800544位点，其扩增引物为seqidno:13-14，延伸引物为seqidno:117；ugt2b15基因rs1902023位点，其扩增引物为seqidno:15-16，延伸引物为seqidno:118；grik4基因rs1954787位点，其扩增引物为seqidno:17-18，延伸引物为seqidno:119；cyp2d6基因rs28371706位点，其扩增引物为seqidno:19-20，延伸引物为seqidno:120；cyp2b6基因rs3211371位点，其扩增引物为seqidno:21-22，延伸引物为seqidno:121；cyp2b6基因rs34223104位点，其扩增引物为seqidno:23-24，延伸引物为seqidno:122；cyp2b6基因rs8192709位点，其扩增引物为seqidno:25-26，延伸引物为seqidno:123；cyp3a4基因rs35599367位点，其扩增引物为seqidno:27-28，延伸引物为seqidno:124；cyp2d6基因rs35742686位点，其扩增引物为seqidno:29-30，延伸引物为seqidno:125；cyp2b6基因rs3745274位点，其扩增引物为seqidno:31-32，延伸引物为seqidno:126；cyp2d6基因rs3892097位点，其扩增引物为seqidno:33-34，延伸引物为seqidno:127；cyp2d6基因rs5030865位点，其扩增引物为seqidno:35-36，延伸引物为seqidno:128；cyp2d6基因rs1135824位点，其扩增引物为seqidno:37-38，延伸引物为seqidno:129；cyp2d6基因rs5030655位点，其扩增引物为seqidno:39-40，延伸引物为seqidno:130；fkbp5基因rs4713916位点，其扩增引物为seqidno:41-42，延伸引物为seqidno:131；mc4r基因rs489693位点，其扩增引物为seqidno:43-44，延伸引物为seqidno:132；htr2a基因rs6313位点，其扩增引物为seqidno:45-46，延伸引物为seqidno:133；cyp3a5基因rs776746位点，其扩增引物为seqidno:47-48，延伸引物为seqidno:134；htr2a基因rs7997012位点，其扩增引物为seqidno:49-50，延伸引物为seqidno:135；

反应体系2内包括如下基因多态性位点的扩增引物及延伸引物：

rabep1基因rs1000940位点，其扩增引物为seqidno:51-52，延伸引物为seqidno:136；htr1a基因rs10042486位点，其扩增引物为seqidno:53-54，延伸引物为seqidno:137；cyp2d6基因rs1065852位点，其扩增引物为seqidno:55-56，延伸引物为seqidno:138；abcb1基因rs10245483位点，其扩增引物为seqidno:57-58，延伸引物为seqidno:139；cyp2c19基因rs12769205位点，其扩增引物为seqidno:59-60，延伸引物为seqidno:140；htr1b基因rs130058位点，其扩增引物为seqidno:61-62，延伸引物为seqidno:141；ankk1基因rs1800497位点，其扩增引物为seqidno:63-64，延伸引物为seqidno:142；cyp2b6基因rs2279343位点，其扩增引物为seqidno:65-66，延伸引物为seqidno:143cyp2d6基因rs28371725位点，其扩增引物为seqidno:67-68，延伸引物为seqidno:144；cyp2d6基因rs16947位点，其扩增引物为seqidno:69-70，延伸引物为seqidno:145；cyp2b6基因rs28399499位点，其扩增引物为seqidno:71-72，延伸引物为seqidno:146；cyp2c19基因rs28399504位点，其扩增引物为seqidno:73-74，延伸引物为seqidno:147；abcb1基因rs4148739位点，其扩增引物为seqidno:75-76，延伸引物为seqidno:148；znf385d基因rs4261893位点，其扩增引物为seqidno:77-78，延伸引物为seqidno:149；bdnf基因rs61888800位点，其扩增引物为seqidno:79-80，延伸引物为seqidno:150；htr1a基因rs6295位点，其扩增引物为seqidno:81-82，延伸引物为seqidno:151；htr2a基因rs6311位点，其扩增引物为seqidno:83-84，延伸引物为seqidno:152；htr2c基因rs6318位点，其扩增引物为seqidno:85-86，延伸引物为seqidno:153；cyp1a2基因rs762551位点，其扩增引物为seqidno:87-88，延伸引物为seqidno:154；

反应体系3内包括如下基因多态性位点的扩增引物及延伸引物：

abcb1基因rs1045642位点，其扩增引物为seqidno:89-90，延伸引物为seqidno:155；cyp2d6基因rs1135840位点，其扩增引物为seqidno:91-92，延伸引物为seqidno:156；cyp2d6基因rs1135835位点，其扩增引物为seqidno:93-94，延伸引物为seqidno:157；fkbp5基因rs1360780位点，其扩增引物为seqidno:95-96，延伸引物为seqidno:158；cyp2c9基因rs1799853位点，其扩增引物为seqidno:97-98，延伸引物为seqidno:159；abcb1基因rs2032583位点，其扩增引物为seqidno:99-100，延伸引物为seqidno:160；abcb1基因rs2032582位点，其扩增引物为seqidno:101-102，延伸引物为seqidno:161；abcb1基因rs2235040位点，其扩增引物为seqidno:103-104，延伸引物为seqidno:162；faah基因rs324420位点，其扩增引物为seqidno:105-106，延伸引物为seqidno:163；sh2b1基因rs3888190位点，其扩增引物为seqidno:107-108，延伸引物为seqidno:164；cyp2c19基因rs4986893位点，其扩增引物为seqidno:109-110，延伸引物为seqidno:165；

（2）pcr产物纯化：将步骤（1）中所得pcr产物分别在原体系中进行纯化，以减少对后续反应的干扰；

（3）单碱基延伸：使用55条特异性延伸引物，在前述反应体系中，对步骤（2）中所得纯化后pcr产物进行多重单碱基延伸以获得延伸产物，所述延伸引物在对应的snp位点处延伸一个核苷酸，所述核苷酸与所述snp位点处的基因型互补配对；

（4）延伸产物纯化：将步骤（3）中所得延伸产物进行纯化，以获得高纯的延伸产物，避免盐离子等杂质对后续检测的影响；

（5）质谱仪检测：将步骤（4）中所得高纯的延伸产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行检测；

（6）结果判读。

作为一个具体的实例，所述试剂盒以及检测方法应用于指导抑郁症用药。

本发明提供了一种利用联合多重pcr技术、单碱基延伸技术和质谱检测的技术，来检测用于指导抑郁症用药的基因多态性的方案。其中：在多重pcr中同时扩增多达55个snp的产品；在单碱基延伸过程中，对多重pcr的纯化产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在55个snp处分别延伸一个核苷酸，使得所延伸的核苷酸类型，分别与基因多态位点的基因型相关；在质谱检测过程中，通过与预先制备的55个snp位点的图谱进行比对，从而对一个或多个质谱结果进行确定，从而检测其对应的snp类型。与现有技术相比，本发明的有如下有益效果：

1．灵敏度高：本发明综合了多重pcr、单碱基延伸、质谱检测等技术为一体，既可通过pcr技术放大检测模板，又可通过质谱技术检测微量样本，使本发明具有高灵敏度；

2．特异性好：本发明使用的单碱基延伸又称为“微测序”，使用特异性探针对dna分子进行识别，具有测序技术的高准确性，特异性好、假阳性低的优点，不同于测序技术延伸数百个碱基，该技术仅延伸单个碱基，出错概率更低；

3．简便安全：操作简单、安全、自动化程度高、防污染；

4．快速：速度快、高通量，可在8-9小时内完成数百个样本的检测；

5．本发明可对多个已知患者进行检测，分别得到具有不同snp的检测结果，其中患者可以是具有单个snp突变位点，也可以是具有多个snp突变位点；

6．本发明克服了以往技术一次检测snp位点过少的缺陷，且成本低廉。

附图说明

图1为采用本发明试剂盒对人源dna样本进行检测的分型效果图，其中，从上到下d~f行分别为反应体系1、反应体系2、反应体系3；每行从左至右圆形（原图为绿色）分别代表1~5号样本孔，分别为5个临床样本，菱形（原图为红色）代表ntc孔；

图2为采用本发明试剂盒的反应体系1的ntc全体分型结果图；

图3为采用本发明试剂盒的反应体系2的ntc全体分型结果图；

图4为采用本发明试剂盒的反应体系3的ntc全体分型结果图。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例提供一种指导抑郁症用药的基因多态性检测试剂盒，包括：用于检测55个指导抑郁症用药的基因多态性位点的扩增引物及延伸引物，其序列如下所示：（相关引物在苏州金唯智生物科技有限公司进行合成）。

实施例一：引物序列

。

实施例二：试剂盒的使用

以下以一实例阐述本发明的指导抑郁症用药的基因多态性检测试剂盒的检测使用方法。

一．取样并提取样本dna

以edtana2抗凝管采集5例临床抑郁症患者的静脉血，采用核酸提取试剂盒（dneasybloodandtissuekit，qiagen公司），从每位患者的200μl全血中提取人基因组dna，以nanodrop2000（thermo公司）定量，并标化至30ng/μl。

二．多重pcr

使用abi9700型pcr仪，对55个与抑郁症用药指导相关的基因多态位点所在dna区域进行扩增。为避免不同引物序列间会存在干扰，因此将上述55个位点在如下所示的3个反应体系中进行。

反应体系1内包括如下基因多态性位点的扩增引物及延伸引物：

cnr1基因rs1049353位点，其扩增引物为seqidno:1-2，延伸引物为seqidno:111；por基因rs1057868位点，其扩增引物为seqidno:3-4，延伸引物为seqidno:112；cyp2c19基因rs12248560位点，其扩增引物为seqidno:5-6，延伸引物为seqidno:113；htr2c基因rs1414334位点，其扩增引物为seqidno:7-8，延伸引物为seqidno:114；drd2基因rs1799732位点，其扩增引物为seqidno:9-10，延伸引物为seqidno:115；drd2基因rs1799978位点，其扩增引物为seqidno:11-12，延伸引物为seqidno:116；adra2a基因rs1800544位点，其扩增引物为seqidno:13-14，延伸引物为seqidno:117；ugt2b15基因rs1902023位点，其扩增引物为seqidno:15-16，延伸引物为seqidno:118；grik4基因rs1954787位点，其扩增引物为seqidno:17-18，延伸引物为seqidno:119；cyp2d6基因rs28371706位点，其扩增引物为seqidno:19-20，延伸引物为seqidno:120；cyp2b6基因rs3211371位点，其扩增引物为seqidno:21-22，延伸引物为seqidno:121；cyp2b6基因rs34223104位点，其扩增引物为seqidno:23-24，延伸引物为seqidno:122；cyp2b6基因rs8192709位点，其扩增引物为seqidno:25-26，延伸引物为seqidno:123；cyp3a4基因rs35599367位点，其扩增引物为seqidno:27-28，延伸引物为seqidno:124；cyp2d6基因rs35742686位点，其扩增引物为seqidno:29-30，延伸引物为seqidno:125；cyp2b6基因rs3745274位点，其扩增引物为seqidno:31-32，延伸引物为seqidno:126；cyp2d6基因rs3892097位点，其扩增引物为seqidno:33-34，延伸引物为seqidno:127；cyp2d6基因rs5030865位点，其扩增引物为seqidno:35-36，延伸引物为seqidno:128；cyp2d6基因rs1135824位点，其扩增引物为seqidno:37-38，延伸引物为seqidno:129；cyp2d6基因rs5030655位点，其扩增引物为seqidno:39-40，延伸引物为seqidno:130；fkbp5基因rs4713916位点，其扩增引物为seqidno:41-42，延伸引物为seqidno:131；mc4r基因rs489693位点，其扩增引物为seqidno:43-44，延伸引物为seqidno:132；htr2a基因rs6313位点，其扩增引物为seqidno:45-46，延伸引物为seqidno:133；cyp3a5基因rs776746位点，其扩增引物为seqidno:47-48，延伸引物为seqidno:134；htr2a基因rs7997012位点，其扩增引物为seqidno:49-50，延伸引物为seqidno:135。

反应体系2内包括如下基因多态性位点的扩增引物及延伸引物：

rabep1基因rs1000940位点，其扩增引物为seqidno:51-52，延伸引物为seqidno:136；htr1a基因rs10042486位点，其扩增引物为seqidno:53-54，延伸引物为seqidno:137；cyp2d6基因rs1065852位点，其扩增引物为seqidno:55-56，延伸引物为seqidno:138；abcb1基因rs10245483位点，其扩增引物为seqidno:57-58，延伸引物为seqidno:139；cyp2c19基因rs12769205位点，其扩增引物为seqidno:59-60，延伸引物为seqidno:140；htr1b基因rs130058位点，其扩增引物为seqidno:61-62，延伸引物为seqidno:141；ankk1基因rs1800497位点，其扩增引物为seqidno:63-64，延伸引物为seqidno:142；cyp2b6基因rs2279343位点，其扩增引物为seqidno:65-66，延伸引物为seqidno:143cyp2d6基因rs28371725位点，其扩增引物为seqidno:67-68，延伸引物为seqidno:144；cyp2d6基因rs16947位点，其扩增引物为seqidno:69-70，延伸引物为seqidno:145；cyp2b6基因rs28399499位点，其扩增引物为seqidno:71-72，延伸引物为seqidno:146；cyp2c19基因rs28399504位点，其扩增引物为seqidno:73-74，延伸引物为seqidno:147；abcb1基因rs4148739位点，其扩增引物为seqidno:75-76，延伸引物为seqidno:148；znf385d基因rs4261893位点，其扩增引物为seqidno:77-78，延伸引物为seqidno:149；bdnf基因rs61888800位点，其扩增引物为seqidno:79-80，延伸引物为seqidno:150；htr1a基因rs6295位点，其扩增引物为seqidno:81-82，延伸引物为seqidno:151；htr2a基因rs6311位点，其扩增引物为seqidno:83-84，延伸引物为seqidno:152；htr2c基因rs6318位点，其扩增引物为seqidno:85-86，延伸引物为seqidno:153；cyp1a2基因rs762551位点，其扩增引物为seqidno:87-88，延伸引物为seqidno:154。

反应体系3内包括如下基因多态性位点的扩增引物及延伸引物：

abcb1基因rs1045642位点，其扩增引物为seqidno:89-90，延伸引物为seqidno:155；cyp2d6基因rs1135840位点，其扩增引物为seqidno:91-92，延伸引物为seqidno:156；cyp2d6基因rs1135835位点，其扩增引物为seqidno:93-94，延伸引物为seqidno:157；fkbp5基因rs1360780位点，其扩增引物为seqidno:95-96，延伸引物为seqidno:158；cyp2c9基因rs1799853位点，其扩增引物为seqidno:97-98，延伸引物为seqidno:159；abcb1基因rs2032583位点，其扩增引物为seqidno:99-100，延伸引物为seqidno:160；abcb1基因rs2032582位点，其扩增引物为seqidno:101-102，延伸引物为seqidno:161；abcb1基因rs2235040位点，其扩增引物为seqidno:103-104，延伸引物为seqidno:162；faah基因rs324420位点，其扩增引物为seqidno:105-106，延伸引物为seqidno:163；sh2b1基因rs3888190位点，其扩增引物为seqidno:107-108，延伸引物为seqidno:164；cyp2c19基因rs4986893位点，其扩增引物为seqidno:109-110，延伸引物为seqidno:165。

pcr的反应体系如下表所示，所用试剂除dna模板、超纯水、引物外，均来自于美国agena公司。

pcr的循环参数为：

95℃，2分钟，1个循环，

95℃，10秒，56℃，10秒，72℃，30秒，35个循环，

72℃，5分钟，1个循环，

4℃，保存。

三．pcr产物纯化

在5μl的pcr产物中，加入如下表所示的试剂，使用abi9700型pcr仪，进行酶消化反应，所加试剂除超纯水，均来自于美国agena公司。

酶消化的反应参数为：

37℃，40分钟，1个循环，

85℃，5分钟，1个循环，

4℃，保存。

四．单碱基延伸

在7μl的酶消化产物中，加入如下表所示的试剂，使用abi9700型pcr仪，进行延伸反应，所加试剂除超纯水、引物外，均来自于美国agena公司。

延伸的循环参数为：

94℃，30秒，1个循环，

94℃，5秒，52℃，5秒，80℃，5秒，40个循环，

72℃，3分钟，1个循环，

4℃，保存。

五．延伸产物纯化

在9μl的延伸产物中加入16μl超纯水，混匀后，再加入6mg树脂（resin，美国agena公司），上下颠倒混匀30分钟。

六．质谱仪检测

使用纳升点样仪（nanodispenser，美国agena公司）将纯化后的产物点至含基质的芯片上（spectrochip，美国agena公司），点样量为每次10-20nl；再使用飞行时间质谱仪（美国agena公司）对其进行检测。

另外，分别设置以上位点的野生型对照b1-b5、突变型对照c1-c5。其中，野生型对照b1-b5、突变型对照c1-c5分别来自市售或实验室保藏的人工质粒。

七．结果判读

（1）如图1所示的分型效果图，从上到下d~f行分别为反应体系1、反应体系2、反应体系3；每行从左至右圆形（原图为绿色）分别代表1~5号样本孔，分别为5个临床样本，菱形（原图为红色）代表ntc孔。

判断标准：

深绿色表示较好数据质量（＞85%callrate），浅绿色表示中等质量数据质量（51%-85%callrate），黄色表示较低数据质量（16%-50%callrate），红色菱形表示ntc（＜15%callrate）。

由图1可知，各样本的反应体系1、反应体系2样本孔均显示深绿色，具有较好的数据质量，各样本的反应体系3分别显示深绿色以及浅绿色，具有较好及中等的数据质量，说明分型效果好，其引物相互干扰小。

（2）55个基因多态位点上根据各自基因型产生的延伸产物具有不同的分子量，各分子量对应各自的质谱峰，若在某分子量处出现质谱峰，则判断为存在与该分子量对应的物质（延伸引物或产物）。

判断标准：

（1）若野生型和突变型对应的质谱峰均未出现，无论延伸引物对应的质谱峰是否存在，均判断为实验失败；

（2）若野生型或突变型对应的质谱峰仅出现一个，则判断为所出现质谱峰对应的基因型的纯合型；

（3）若野生型或突变型对应的质谱峰均出现，则判断为杂合型。

根据图2-图4的各反应系统的ntc全体分型结果图，ntc在所有野生型和突变型对应位置没有质谱峰出现，即代表背景无干扰，各引物之间的干扰也极小，能够精确反映55个位点的突变情况，假阳性低。

本发明针对不同的基因型，对用药有一定的指导作用，以下以cyp2c19基因的rs4986893位点、rs12248560位点对指导氯吡格雷用药为例，阐述本发明的用药指导提示。相似的，本发明中所涉及的其他基因及其位点的指导作用为利用本发明的试剂盒以及检测方法判读出基因型，再结合现有的研究结果判断代谢能力及对剂量的指导。

cyp2c19*1为cyp2c19基因的野生型等位基因，其编码的cyp2c19酶活性正常；

cyp2c19*3为cyp2c19基因的rs4986893位点发生突变，编码的cyp2c19酶活性降低；

cyp2c19*17为cyp2c19基因的rs12248560位点发生突变，编码的cyp2c19酶活性增强。

如上表所示，当基因型为*1/*1时，即代表rs4986893位点、rs12248560位点均未发生突变，cyp2c19酶活性正常，氯吡格雷的药物代谢速度正常，对于拥有此类基因型的患者，可按照医学指导下的标准剂量。

当基因型为*1/*17或*17/*17时，即代表rs12248560位点发生突变，cyp2c19酶活性增强，使对氯吡格雷的药物代谢速度加快，对于拥有此类基因型的患者，可考虑适当减少剂量。

当基因型为*1/*3或*3/*17或*3/*3时，即代表rs4986893位点发生突变，cyp2c19酶活性降低，使对氯吡格雷的药物代谢速度减缓，发生药物抵抗的现象，对于拥有此类基因型的患者，可考虑适当增加剂量或更换药物。

综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

序列表

<110>上海药明奥测医疗科技有限公司

<120>一种指导抑郁症用药的基因多态性检测试剂盒及检测方法

<160>165

<170>siposequencelisting1.0

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agataagaaagaactagaaggt22

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