专利名称:生地低聚糖及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药有效部位及其提取分离技术领域：
，具体涉及一种生地低聚糖及其制备方法和应用。
背景技术：
生地为常用中药，性味平和，功能清热凉血、养阴生津。生地黄的化学成分复杂，主要成分为环烯醚萜苷类及糖类[阴健主编.中药现代研究与应用(第二卷)[M].学苑出版社，1752(1997)]。文献报道，[毕小利，张炜，辽宁中医杂志，26(3)，110(1999)]，[毕小利，张炜，辽宁中医杂志，25(12)，561(1998)]，[张炜，毕小利，实用中医药杂志，16(3)，3(2003)]，[江淳娟，毕小利，王跃，实用中医药杂志，18(8)，7(2002)]由单味生地制成的生地注射液在临床应用中，可观察到改善慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者肺容量、肺通气功能，显著提高COPD患者CD4数值和NK细胞活性，提高CD4/CD8比值，使患者的细胞免疫功能得到改善，并能改善血栓前状态，降低血粘度和红血球压积。但目前国内外尚未就生地中具有这方面活性作用的化学成分进行提取分离的研究报道。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于对生地活性成份进行提取分离，获得纯度高，药效作用明确，具有药用价值的活性部位。
本发明公开的生地活性部位是以生地药材为原料，经水提后获得生地总糖，然后通过凝胶柱层析分离得到的分子量范围在381～1012的低聚糖，该低聚糖主要由水苏糖、棉籽糖和甘露糖组成，其中水苏糖含量≥60％。
本发明公开的生地低聚糖由下述方法制得1、将干燥后的生地药材切片或粉碎，用水煎煮提取，提取液经大孔吸附树脂除杂，水洗脱，洗脱液用活性炭脱色，低温浓缩干燥得生地总糖；2、生地总糖加水溶解，经凝胶柱层析分离，用水或稀盐溶液洗脱，薄层层析法检识，收集合并层析图谱中斑点A、B部分，低温浓缩、冷冻干燥即得生地低聚糖部位；或生地总糖溶液依次通过截留分子量为1000的纳滤膜和截留分子量为200的纳滤膜，收集两膜间的溶液，冷冻干燥即得生地低聚糖部位。
本发明所述切片或粉碎后的生地药材用水煎煮提取，其中生地与水的重量比优选为生地∶水＝1∶10～17，煎煮次数为2～4次。
所述的大孔吸附树脂为非极性大孔吸附树脂，选自HPD100和D101。
经大孔吸附树脂除杂、活性炭脱色后的提取液，低温浓缩干燥得生地总糖，其采用的浓缩方式为低于70℃真空浓缩。干燥方式采用冷冻干燥。
所述生地总糖经凝胶柱层析分离所采用的凝胶为Sephadex G型，Sephacryl S型，也可尝试用Superose型或Superdex型。选用的分离范围为1×102～1.5×103道尔顿。优选Sephadex G-25或SephadexG-15。
生地总糖的凝胶柱层析分离可用水或稀盐溶液洗脱，所述的稀盐溶液为浓度是0.1mol/L NaCl溶液。当采用稀盐溶液洗脱时，洗脱液需经SephadexG-10脱盐。
凝胶柱层析所用的薄层层析法检识中的薄层层析条件为低聚糖通用的薄层色谱条件，优选的薄层层析条件为薄层板经0.1mol/LNaH2PO4处理的硅胶G；展开剂∶正丁醇-吡啶-水＝4∶4∶1；展距8～10cm；显色剂苯胺-二苯胺-磷酸系统(苯胺2ml，二苯胺2g，磷酸20ml，加丙酮至200ml)；105℃烘10～20min。在层析图谱中斑点A、B为极性较大的四糖部位和三糖部位(见图1)。
经HPLC检测表明生地低聚糖部位主要由三种低聚糖组成(见图2)。
用本发明方法获得的生地低聚糖部位，经MS分析显示其主要分子离子峰[M+Na]+的质荷比为m/z689和m/z527，所含成分分子量范围主要在1000以下(见图3)。LC-MS分析显示，该低聚糖部位主要由三个成分组成；分子量为667的水苏糖及分子量均为504的棉籽糖和甘露三糖(见图4)。三者分别具有下式结构
本发明所要解决的再一技术问题在于公开上述生地低聚糖在制备治疗慢性阻塞性肺疾病(COPD)药物中的应用。
经药效学实验研究表明，用本发明方法获得的生地低聚糖部位可明显抑制LPS诱导的白细胞总数和中性粒细胞数目升高、TNF-α水平升高、O2-水平升高、MPO水平升高、肺组织中性粒细胞浸润、气管黏膜水肿和组织损伤。具有明显抑制大肠杆菌脂多糖(LPS)诱导的大鼠肺部炎症的作用。本发明提取的生地低聚糖部位可用于制备治疗慢性阻塞性肺疾病的药物。
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
图1生地总糖经凝胶柱层析分离洗脱液薄层色谱图所用条件为薄层板经0.1mol/LNaH2PO4处理的硅胶G；展开剂正丁醇-吡啶-水(4∶4∶1)；展距8～10cm；显色剂苯胺-二苯胺-磷酸系统(苯胺2ml，二苯胺2g，磷酸20ml，加丙酮至200ml)；105℃烘10～20min。其中斑点A为四糖部位，斑点B为三糖部位，斑点C为双糖部位，斑点D为单糖部位。
图2生地低聚糖部位HPLC图分析柱为Shodex Asahipak NH2P-50(4.6mm×250mm，5μm)；流动相乙腈-水(70∶30)；流速1.0ml/min；RID检测器。分析表明生地低聚糖部位主要由三种低聚糖组成。
图3生地低聚糖部位MS图谱显示其主要分子离子峰[M+Na]+的质荷比为m/z689和m/z527，所含成分分子量范围主要在1000以下。
图4生地低聚糖部位LC-MS图谱显示生地低聚糖部位主要含的三种低聚糖分子量分别为504、504、667。
具体实施方式实施例1将生药生地500g洗净干燥，切片，用12倍去离子水煎煮3次，每次0.5小时，过滤，合并滤液，离心，上清液通过D101大孔吸附树脂柱，用5倍树脂床体积的水洗脱，收集流出液和水洗脱液，0.1％活性炭脱色2次，过滤，合并滤液，得到生地总糖溶液，依次通过截留分子量为1000的纳滤膜和截留分子量为200的纳滤膜，收集两膜间的浓缩液，冷冻干燥获得生地低聚糖部位87g。
实施例2将生药生地500g洗净干燥，切片，用14倍去离子水煎煮3次，每次0.5小时，过滤，合并滤液，离心，上清液通过HPD100大孔吸附树脂柱，用5倍树脂床体积的水洗脱，收集流出液和水洗脱液，0.1％活性炭脱色3次，过滤，合并滤液，60℃减压浓缩，冷冻干燥，即获得生地总糖210g。称取生地总糖5g溶于20mL蒸馏水中，过滤。取滤液上Sephadex G-15凝胶柱，用水洗脱，流速为2mL/min，每管收集8-12mL，用薄层层析法检识，收集合并含三、四糖斑点部分，60℃减压浓缩，冷冻干燥，即获得生地低聚糖部位2.3g。
实施例3将生药生地500g洗净干燥，粉碎成5mm大小块状，用12倍去离子水煎煮2次，每次1小时，过滤，合并滤液，离心，上清液通过HPD100大孔吸附树脂柱，用5倍树脂床体积的水洗脱，收集流出液和水洗脱液，0.15％活性炭脱色3次，过滤，合并滤液，65℃减压浓缩，冷冻干燥，即获得生地总糖225g。称取生地总糖6g溶于25mL蒸馏水中，过滤。取滤液上Sephadex G-25凝胶柱，用水洗脱，流速为2mL/min，每管收集8-12mL，用薄层层析法检识，收集合并含三、四糖斑点部分，65℃减压浓缩，冷冻干燥，即获得生地低聚糖部位2.8g。
实施例4将生药生地500g洗净干燥，粉碎成5mm大小块状，用12倍去离子水煎煮2次，每次1小时，过滤，合并滤液，离心，上清液通过HPD100大孔吸附树脂柱，用5倍树脂床体积的水洗脱，收集流出液和水洗脱液，0.1％活性炭脱色3次，过滤，合并滤液，65℃减压浓缩，冷冻干燥，即获得生地总糖225g。称取生地总糖6g溶于25mL蒸馏水中，过滤。取滤液上Sephadex G-15柱，用0.1mol/LNaCl洗脱，流速为2mL/min，每管收集8～12mL，用薄层层析法检识，收集合并含三、四糖斑点部分，经Sephadex G-10柱脱盐，65℃减压浓缩，冷冻干燥，即获得生地低聚糖部位3g。
实施例5 生地低聚糖部位药理作用研究静脉注射生地低聚糖部位对LPS诱导大鼠肺部炎症的影响的药理实验一、肺部炎症大鼠模型的建立SD大鼠称重后，用10％的水合氯醛麻醉大鼠，按3.5ml/kg腹腔注射给药。麻醉后的大鼠立即手术，暴露气管，用微量注射器直接从气道滴入LPS(3mg/kg)，滴入LPS 6h后处死大鼠，收集支气管肺泡灌洗液(BALF)、取肺组织做病理切片。
二、实验设计随机分组，每组8～10只大鼠，分正常对照组、模型组、样品组；采用静脉注射给药方式；给药两次，第一次给药于气道滴入LPS前5min，第二次给药于气道滴入LPS 3h后。
三、检测指标支气管肺泡灌洗液中白细胞总数和中性粒细胞数目，肿瘤坏死因子(TNF-α)、超氧阴离子(O2-)、中性粒细胞髓过氧化酶含量(MPO)。
四、实验结果1.对炎症细胞聚集的影响生地低聚糖部位可明显抑制LPS诱导的白细胞总数和中性粒细胞数目升高。
对LPS诱导的大鼠肺BALF炎症细胞聚集的影响(n＝8，
X±S)
与模型组比较***P＜0.001；与正常组比较##P＜0.01，###P＜0.0012.对TNF-α水平的影响生地低聚糖部位可明显抑制LPS诱导的TNF-α水平升高。
对LPS诱导的大鼠肺BALF中TNF-α水平的影响(n＝7～8，
X±S)
与模型组比较**P＜0.01；与正常组比较##P＜0.013.对O2-水平的影响生地低聚糖部位可明显抑制LPS诱导的O2-水平升高。
对LPS诱导的大鼠肺BALF中O2-水平的影响(n＝7～8，
X±S)
与模型组比较***P＜0.001；与正常组比较##P＜0.014.对MPO水平的影响生地低聚糖部位可明显抑制LPS诱导的MPO水平升高。
对LPS诱导的大鼠肺BALF中MPO水平的影响(n＝7～8，
X±S)
与模型组比较**P＜0.01；与正常组比较#P＜0.055.病理检查结果生地低聚糖部位可明显抑制LPS诱导的肺组织中性粒细胞浸润、气管黏膜水肿和组织损伤。
对LPS诱导的大鼠肺炎症病理变化的影响(n＝8，
X±S)
与模型组比较***P＜0.001；与正常组比较###P＜0.001
五、结论静脉注射生地低聚糖部位，能显著抑制LPS诱导产生的大鼠肺组织白细胞总数升高、中性粒细胞聚集，对肺BALF中TNF-α、MPO和O2-水平升高以及肺组织炎症细胞浸润、气道黏膜水肿和损伤等变化有明显抑制作用，提示生地低聚糖部位是生地治疗COPD的有效部位，抗炎、抑制细胞因子释放、抑制炎症介质释放和抗氧化方面的作用，是生地黄及其低聚糖部位(RGOS)治疗COPD的机制之一。
权利要求
1.一种生地低聚糖，其特征在于该低聚糖是以生地药材为原料，经水提后获得生地总糖，然后通过凝胶柱层析分离而得，分子量范围在381～1012，主要由水苏糖、棉籽糖和甘露糖组成，其中水苏糖含量≥60％。
2.一种如权利要求
1所述生地低聚糖的制备方法，其特征在于该制备方法为1)将干燥后的生地药材切片或粉碎，用水煎煮提取，提取液经大孔吸附树脂除杂，水洗脱，洗脱液用活性炭脱色，低温浓缩干燥得生地总糖；2)生地总糖加水溶解，经凝胶柱层析分离，用水或稀盐溶液洗脱，薄层层析法检识，收集合并层析图谱中斑点A、B部分，低温浓缩、冷冻干燥即得生地低聚糖部位；或生地总糖溶液依次通过截留分子量为1000的纳滤膜和截留分子量为200的纳滤膜，收集两膜间的溶液，冷冻干燥即得生地低聚糖部位。
3.根据权利要求
2所述的生地低聚糖的制备方法，其特征在于其中所述的生地药材用水煎煮提取时生地与水的重量比为生地∶水＝1∶10～17，煎煮次数为2～4次。
4.根据权利要求
2所述的生地低聚糖的制备方法，其特征在于其中所述的大孔吸附树脂为HPD100和D101。
5.根据权利要求
2所述的生地低聚糖的制备方法，其特征在于其中所述的低温浓缩干燥中低温浓缩是指低于70℃真空浓缩；干燥方式为冷冻干燥。
6.根据权利要求
2所述的生地低聚糖的制备方法，其特征在于其中所述的凝胶柱层析分离所采用的凝胶为Sephadex G型、Sephacryl S型，分离范围为1×102～1.5×103道尔顿。
7.根据权利要求
2所述的生地低聚糖的制备方法，其特征在于其中所述的稀盐溶液为浓度是0.1mol/L的NaCl溶液。
8.根据权利要求
2所述的生地低聚糖的制备方法，其特征在于其中所述的凝胶柱层析分离用稀盐溶液洗脱时，洗脱液需经SephadexG-10脱盐。
9.根据权利要求
2所述的生地低聚糖的制备方法，其特征在于其中所述的凝胶柱层析用薄层层析法检识，其薄层层析条件为薄层板经0.1mol/LNaH2PO4处理的硅胶G；展开剂正丁醇∶吡啶∶水＝4∶4∶1；展距8～10cm；显色剂配比苯胺2ml，二苯胺2g，磷酸20ml，加丙酮至200ml；105℃烘10～20min。
10.权利要求
1所述生地低聚糖在制备治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的应用。
专利摘要
本发明涉及一种生地低聚糖及其制备方法和应用。本发明公开的生地低聚糖是以生地药材为原料，经水提后获得生地总糖，然后通过凝胶柱层析分离得到的分子量范围在381～1012的低聚糖，主要由水苏糖、棉籽糖和甘露糖组成，其中水苏糖含量≥60％。经药效学实验研究表明，用本发明方法获得的生地低聚糖具有明显抑制大肠杆菌脂多糖(LPS)诱导的大鼠肺部炎症的作用，可用于制备治疗慢性阻塞性肺疾病的药物。
文档编号C07H1/08GK1990494SQ200510112424
公开日2007年7月4日 申请日期2005年12月30日
发明者刘力, 徐德生, 唐岚 申请人:上海中医药大学附属曙光医院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan