第二个组分冷冻干燥处理，得到肽粉B3-1I ;其中色谱纯化条件为:色谱柱为XBridge? pre C18柱，流动相为A相-B相，所述A相为乙腈，B相为体积分数为0.2%的三氟乙酸水溶液。洗脱程序为:0-7min内采用A相体积分数为5% ;7_12min内A相体积分数逐渐增加至38%;12-20min内A相体积分数逐渐增加至55%，20_25min内A相体积分数逐渐增加至90%，25-30min内A相的体积分数为90%。
[0049]本实施得到的麻虾抗氧化肽，即肽粉B3-1I，通过UPLC-MS-MS测定肽的分子量为408.1798Da 和氨基酸序列为 Gly-Phe-Trp。
[0050]实施例4
[0051](I)将麻虾打成浆状，再与水按质量比1:1混合，加入木瓜蛋白酶和胰酶的混合酶，酶添加量为3500U/g原料，酶解pH为7.5，酶解温度为50°C的条件下酶解2h ;然后在950C的水中保温20min灭酶，冷却，取上清液，浓缩，喷雾干燥得到麻虾酶解液粉末，酶解液的水解度为21.1±0.2% ；
[0052](2)得到的麻虾酶解液粉末首先采用弱极性树脂XAD-16，通过蒸馏水和体积分数为25 %、45 %、65 %及85 %的乙醇溶液对麻虾酶解液粉末进行浓度梯度洗脱，收集25 %的乙醇溶液洗脱组分进行冷冻干燥处理，得到肽粉B ;
[0053](3)将步骤⑵得到的肽粉B进行凝胶色谱葡聚糖凝胶S^hadex G_15柱层析分离纯化，以蒸馏水为流动相进行洗脱，按洗脱的时间先后依次得到三个组分，收集第三个组分进行冷冻干燥处理，得到肽粉B3 ;
[0054](4)将步骤(3)得到的肽粉B3，采用反相高效液相色谱进行进一步纯化，按洗脱的时间先后依次得到两个组分，收集第二个组分冷冻干燥处理，得到肽粉B3-1I ;其中色谱纯化条件为:色谱柱为XBridge? pre C18柱，流动相为A相-B相，所述A相为乙腈，B相为体积分数为0.1%的三氟乙酸水溶液。洗脱程序为:0-7min内采用A相体积分数为5% ;7_12min内A相体积分数逐渐增加至38%;12-20min内A相体积分数逐渐增加至55%，20_25min内A相体积分数逐渐增加至90%，25-30min内A相的体积分数为90%。
[0055]本实施得到的麻虾抗氧化肽，即肽粉B3-1I，通过UPLC-MS-MS测定肽的分子量为408.1798Da 和氨基酸序列为 Gly-Phe-Trp。
[0056]实施例5
[0057](I)将麻虾打成浆状，再与水按质量比1:0.5混合，加入胰酶，酶添加量为1000U/g原料，酶解pH为7.0，酶解温度为50°C的条件下酶解2.7h ;然后在100°C的水中保温1min灭酶，冷却，取上清液，浓缩，喷雾干燥得到麻虾酶解液粉末，酶解液的水解度为21.9±0.3% ；
[0058](2)得到的麻虾酶解液粉末首先采用弱极性树脂XAD-16，通过蒸馏水和体积分数为20 %、40 %、60 %及80 %的乙醇溶液对麻虾酶解液粉末进行浓度梯度洗脱，依次得到A、B、C、D、E五个组分，收集25%的乙醇溶液洗脱组分进行冷冻干燥处理，得到肽粉B ;
[0059](3)将步骤⑵得到的肽粉B进行凝胶色谱葡聚糖凝胶Sephadex G_15柱层析分离纯化，以蒸馏水为流动相进行洗脱，按洗脱的时间先后依次得到B1、B2、B3三个组分，该三个组分的吸光度如图1所示；收集第三个组分进行冷冻干燥处理，得到肽粉B3 ;
[0060](4)将步骤(3)得到的肽粉B3，采用反相高效液相色谱进行进一步纯化，按洗脱的时间先后依次得到B3-1、B3-1I两个组分，该两个组分的色谱图如图2所示；收集第二个组分冷冻干燥处理，得到肽粉B3-1I ;其中色谱纯化条件为:色谱柱为XBridge? pre C18柱，流动相为A相-B相，所述A相为乙腈，B相为体积分数为0.1%的三氟乙酸水溶液。洗脱程序为:0-7min内采用A相体积分数为5%;7_12min内A相体积分数逐渐增加至38%;12_20min内A相体积分数逐渐增加至55%，20-25min内A相体积分数逐渐增加至90%，25_30min内A相的体积分数为90%。
[0061]本实施得到的麻虾抗氧化肽，即肽粉B3-1I，通过UPLC-MS-MS测定肽的氨基酸序列，结果如图3所示，由图3可以得出，本实施的麻虾抗氧化肽的分子量为408.1798Da，氨基酸序列为Gly-Phe-Trp。
[0062]对本实施例步骤(I)得到的麻虾酶解液粉末与步骤(2)中得到的五个组分的抗氧化活性进行测定，结果如图4所示，由图4可以看出，肽粉B的抗氧化活性最高。
[0063]对本实施例步骤(3)得到的三个组分的抗氧化活性进行测定，结果如图5所示，由图5可以看出，肽粉B3的活性最高。
[0064]对本实施例步骤⑷中得到的两个组分的抗氧化活性进行测定，结果如图6所示，由图6可以看出，本实施例得到的麻虾抗氧化肽(组分B3-1I)的抗氧化活性最高，其氧自由基吸收能力为最初麻虾酶解液粉末的30倍左右。
[0065]在本发明中，米用ORAC (Oxygen radical absorbance capacity,氧自由基吸收能力)ORAC法来测定抗氧化肽的活性。
[0066]ORAC法:主要参考 Zheng等人的方法(Zheng, L., Su, G., Ren, J., et al.1solat1nand Characterizat1n of an Oxygen Radical Absorbance Activity Peptide fromDefatted Peanut Meal Hydrolysate and Its Ant1xidant Properties.Journal ofAgricultural and Food Chemistry，2012，60 (21)，5431-5437.)，并略作修改。在 96 孔板中加入 40 μ L 荧光素(FL，3.5nmol/L)和 20 μ L 的样品(0.I_0.2mg/ml)，在 37°C下预热 15分钟。然后快速加入140 UL的AAPH自由基(12.8mmol/L)，振荡后运行程序。在37°C下以激发波长485nm，发射波长538nm进行测定，每2分钟测定一次焚光值fi，初始读数记为fO，而样品的荧光值曲线的面积(AUC) = l+fl/f0+f2/f0+f3/f0+...+fn/f0，净面积(Net AUC)=AUC - AUCe自，Net AUC值与Trolox浓度Trolox (0-100 μ mol/L)作标准曲线。根据标准曲线计算得的样品ORAC值用μπιο? Trolox/g表示。
[0067]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种麻好抗氧化肽，其特征在于:所述抗氧化肽具有Gly-Phe-Trp的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的一种麻虾抗氧化肽的分离提取方法，其特征在于:包括以下操作步骤: (1)将麻虾打成浆状，然后与水按质量比为1:(0.5?5)混合，加入蛋白酶酶解I?6h，灭酶，冷却，上清液浓缩干燥，得到麻虾酶解液粉末； (2)将麻虾酶解液粉末采用弱极性树脂进行分离，依次用蒸馏水、体积分数为10%?29 %、30 %?49 %、50 %?69 %及70 %?89 %的乙醇溶液梯度洗脱，收集10 %?29 %的乙醇溶液洗脱组分进行冷冻干燥处理，得到肽粉B ; (3)将肽粉B用葡聚糖凝胶色谱柱分离，以蒸馏水为流动相进行洗脱，按洗脱的时间先后依次得到三个组分，收集第三个组分冷冻干燥，得到肽粉B3 ; (4)将肽粉B3采用反相高效液相色谱进行进一步分离纯化，以A相-B相为流动相进行洗脱，其中A相为乙腈，B相为体积分数为0.1%?0.2%的三氟乙酸水溶液，按洗脱的时间先后依次得到两个组分，收集第二个组分冷冻干燥处理，得到氨基酸序列为Gly-Phe-Trp的麻虾抗氧化肽。
3.根据权利要求2所述的一种麻虾抗氧化肽的分离提取方法，其特征在于:步骤(I)中所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶和胰酶中的一种或两种。
4.根据权利要求2所述的一种麻虾抗氧化肽的分离提取方法，其特征在于:步骤(I)中所述蛋白酶的添加量为500?5000U/g原料。
5.根据权利要求2所述的一种麻虾抗氧化肽的分离提取方法，其特征在于:步骤(I)中所述酶解的pH为6.5?8.0，酶解温度为45?55°C。
6.根据权利要求2所述的一种麻虾抗氧化肽的分离提取方法，其特征在于:步骤(I)中所述的灭酶是指在85?100°C下保温10?30min。
7.根据权利要求2所述的一种麻虾抗氧化肽的分离提取方法，其特征在于:步骤(2)中所述的弱极性树脂是指XAD-16树脂。
8.根据权利要求2所述的一种麻虾抗氧化肽的分离提取方法，其特征在于:步骤(3)中所述的葡聚糖凝胶色谱柱是指Sephadex G_15葡聚糖凝胶色谱柱。
9.根据权利要求2所述的一种麻虾抗氧化肽的分离提取方法，其特征在于步骤(4)中所述的分离纯化条件为: 色谱柱为XBridge? pre C18柱，洗脱程序为:0_7min内采用A相体积分数为5 % ；7-12min内A相体积分数逐渐增加至38% ；12-20min内A相体积分数逐渐增加至55%，20-25min内A相体积分数逐渐增加至90%，25_30min A相的体积分数为90%。
10.权利要求1所述的麻虾抗氧化肽在食品、化妆品和医药领域中的应用。
【专利摘要】本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种麻虾抗氧化肽及其分离提取方法与应用。所述麻虾抗氧化肽具有Gly-Phe-Trp的氨基酸序列，其分离提取方法为：将麻虾用蛋白酶酶解得到麻虾蛋白酶解产物；然后用弱极性树脂对其进行分离，得到肽粉B；将肽粉B用葡聚糖凝胶色谱柱分离，得到肽粉B3；将肽粉B3用反相高效液相色谱柱进一步纯化，即得麻虾抗氧化肽。本发明的麻虾抗氧化肽具有很强的抗氧化性能，可应用于食品、化妆品、医药等领域。
【IPC分类】C07K5-083, C12P21-06, C07K1-20, C07K1-16
【公开号】CN104558105
【申请号】CN201510007057
【发明人】赵强忠, 赵谋明, 苏国万, 刘钧发
【申请人】华南理工大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月4日