地为利用如上所述的靶标多核苷酸中的任意一种制备重组 载体或者制备病毒颗粒。
[0029] 其中所述的重组载体选自本领域常规的由逆转录病毒衍生的载体。所述的病毒 衍生的载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关载体、疱瘆病毒载体或痘苗病毒载体 等，本发明优选慢病毒载体。慢病毒载体的优点是它们能使编码小干扰核糖核酸（siRNA) 的多核苷酸片段整合到宿主细胞的基因组中，得以产生特定基因被特异性阻抑的细胞系， 某些病毒载体可用于体内转化细胞，从而实现直接操纵宿主体内的基因表达及其调控。
[0030] 其中所述病毒颗粒是本领域常规的病毒颗粒，较佳地是以人类免疫缺陷型病毒 (HIV)为基础，通过去除其中的env、vif、vpr、vpu等毒性基因改造而来，用水泡口炎病毒 G糖蛋白来代替HIV-I的包膜进行包装，所得慢病毒载体的宿主范围非常广泛，能显著增加 病毒的滴度。慢病毒载体的毒性基因已被删除并被外源基因取代，属于假型病毒，而且该病 毒感染细胞后不能再感染其它细胞，生物安全性高。慢病毒载体对分裂细胞和非分裂细胞 均具有感染能力，并可以在体内较长期稳定的表达。
[0031] 本发明所述慢病毒颗粒制备方法较佳地包括以下步骤：将本发明所述靶标核苷酸 构建到慢病毒载体中，然后与包装载体共转染到真核细胞中，所述真核细胞优选地为293T 细胞，经过培养后进行慢病毒的回收纯化，即得包装好的慢病毒颗粒。
[0032] 本发明所述靶标多核苷酸在抗多发性骨髓瘤药物中的应用较佳地为作为将其作 为药物靶点。所述药物靶点是指药物在体内的作用结合位点，选择确定新颖的有效药物靶 点是新药开发的首要任务。合理化药物设计（rational drug design)可以依据生命科学研 宄中所揭示的包括酶、受体、离子通道、核酸等潜在的药物作用靶位，或其内源性配体以及 天然底物的化学结构特征来设计药物分子，以发现选择性作用于靶点的新药。通过药物靶 点的选择和利用，可以显著提高筛选抗肿瘤药物的效率，有效缩短抗肿瘤药物研宄的周期。
[0033] 本发明解决上述技术问题采取的技术方案之七是：一种如上所述的小干扰核糖核 酸在制备抗多发性骨髓瘤药物中的应用。
[0034] 本发明所述小干扰核糖核酸的应用方法较佳地为制备抗多发性骨髓瘤的药物组 合物。所述药物组合物的性质如前文所述。
[0035] 本发明所述的应用方法较佳地为利用所述小干扰核糖核酸制备SUMO-I基因沉默 的细胞模型。其中所述细胞模型为本领域常规的细胞模型，较佳地为真核细胞，更佳地为肿 瘤细胞，最佳地为多发性骨髓瘤细胞。本发明所述的SUMO-I基因沉默的细胞模型的制备方 法为本领域常规制备方法，较佳地为利用本发明所述小干扰核糖核酸转染细胞株或者将包 含所述小干扰核糖核酸的慢病毒颗粒转染真核细胞。
[0036] 其中所述的转染方法为本领域常规方法，较佳地为DEAE-葡聚糖法，磷酸钙法，阳 离子脂质体法，阳离子聚合物法，病毒介导法，生物颗粒传法（基因枪粒子轰击法），显微注 射法，电穿孔法等，最佳地为阳离子脂质体法。其中所述细胞系较佳地为真核细胞系，更佳 地为多发性骨髓瘤细胞。
[0037] 本发明所述的SUMO-I基因沉默的细胞模型的制备方法的一较佳实例包括：将小 干扰核糖核酸转染多发性骨髓瘤细胞，挑取筛选的肿瘤细胞克隆，用western-blot方法检 测不同的肿瘤细胞克隆的SUMO-I蛋白量的情况。其中SUMO-I蛋白表达量显著下降的细胞 株即为构建成功的SUM0-1基因沉默的细胞模型。
[0038] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0039] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0040] 本发明的积极进步效果在于：本发明建立并筛选了针对SUM0-1基因的小干扰核 糖核酸的靶标多核苷酸，并构建相应的小干扰核糖核酸（siRNA)，该siRNA能够显著下调 SUM0-1基因的mRNA表达和蛋白的表达。利用本发明所述小干扰核糖核酸的靶标多核苷酸 以及小干扰核糖核酸，能够有效抑制SUM0-1基因的表达，显著降低多发性骨髓瘤细胞的增 殖速度。本发明有助于针对骨髓瘤进展的根源，进一步阐明多发性骨髓瘤的预后及调节机 制；针对多发性骨髓瘤复发的关键，开发新的更有效的治疗靶标，实现更安全有效的抗骨髓 瘤治疗，最终避免多发性骨髓瘤的复发，实现治愈，具有十分重要的现实意义。
【附图说明】
[0041] 图1为原代骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞系中β -catenin和SUMO化修饰的表达水 平。其中图1㈧和图（C)为原代骨髓瘤细胞中β -catenin和SUM0-1的表达水平；图I (B) 和图I (D)为骨髓瘤细胞系中β -catenin和SUM0-1的表达水平。
[0042] 图2为siRNA干扰骨髓瘤细胞SUM0-1表达后抑制SUMO化修饰的β -catenin表 达的结果图。其中图2(A)表示的检测对象为多发性骨髓瘤NCI-H929细胞；图2(B)采用免 疫荧光共沉淀方法检测β -catenin和SUM0-1在骨髓瘤细胞内的内源性结合；图2 (C)选取 骨髓瘤细胞NCI-H929,检测不同浓度SUMO-siRNA处理细胞前后β -catenin的变化水平； 图2(D)选取骨髓瘤细胞NCI-H929和RPMI-822,检测SUMO-siRNA处理前后不同基因的表达 水平。
[0043] 图3为不同细胞株中的siRNA干扰效果的结果图。
[0044] 图4为siRNA干扰骨髓瘤细胞SUM0-1表达后诱导骨髓瘤细胞的凋亡结果图。其 中图4(A)为骨髓瘤细胞株的凋亡率检测结果；图4(B)为图4A结果的统计值，其中纵坐标 代表细胞的凋亡率；图4 (C)为MTS方法检测细胞增殖程度结果。
[0045] 图5为干扰SUM0-1的表达可降低β -catenin的稳定性，促进β -catenin降解增 加的结果图。其中图5(A)为多发性骨髓瘤细胞SUM0-1干扰前后，β-catenin mRNA表达 水平；图5 (B)为将骨髓瘤细胞设置为SUM0-1干扰组和对照组，100 μ g/ml CHX (放线菌酮） 处理抑制蛋白质合成，检测β-catenin表达水平的变化；图5(C)为对图5(B)中免疫印记 结果进行半定量分析的结果。
[0046] 图6为SUMO化修饰抑制剂对骨髓瘤细胞的作用结果图。其中图6(A)为 H2O2(IOOyM)处理骨髓瘤细胞后对SUMO化修饰和β-catenin表达水平的影响；图6 (B)为 anacardic acid(lOOyM)处理骨髓瘤细胞后对SUMO化修饰和β-catenin表达水平的影 响；图6(C)为过表达β-catenin后采用SUMO化修饰抑制剂处理骨髓瘤细胞，对其生长抑 制作用的检测结果。
[0047] 图7为siRNA对NCI-H929细胞株的增殖速度影响结果图。
[0048] 图8为siRNA对RPMI-8226细胞株的增殖速度影响结果图。
【具体实施方式】
[0049] 现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0050] 本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或 按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0051] 实施例中所述的"室温"是指进行试验的操作间的温度，一般为15-25°c。
[0052] 实施例1 :针对SUM0-1基因设计并合成siRNA
[0053] 设计合成SUM0-1小干扰RNA (siRNA)，其中所述siRNA针对的SUM0-1基因中的靶 标序列如表1所示：
[0054] 表1SUM0-1基因的siRNA作用靶标序列（CDNA)
[0055]
【主权项】
1. 一种抗多发性骨髓瘤的小干扰核糖核酸的靶标多核苷酸，其特征在于，所述靶标多 核苷酸的序列如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3中任一所示。
2. -种抗多发性骨髓瘤的小干扰核糖核酸，其特征在于，所述的小干扰核糖核酸包括 正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段如序列表中SEQ ID NO :4所示，所述反义 RNA片段如序列表中SEQ ID NO :5所示。
3. -种抗多发性骨髓瘤的小干扰核糖核酸，其特征在于，所述的小干扰核糖核酸包括 正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段如序列表中SEQ ID NO :6所示，所述反义 RNA片段如序列表中SEQ ID NO :7所示。
4. 一种抗多发性骨髓瘤的小干扰核糖核酸，其特征在于，所述的小干扰核糖核酸包括 正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段如序列表中SEQ ID NO :8所示，所述反义 RNA片段如序列表中SEQ ID NO :9所示。
5. -种药物组合物，其特征在于，其包含如权利要求2至4任一所述的小干扰核糖核酸 以及药学上可接受的载体。
6. 根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的载体为药学 上可接受的赋形剂，悬浮剂，填充剂和/或稀释剂。
7. 根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述的稀释剂为水。
8. 根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为水溶液 的浓度ΙΟΟηΜ。
9. 如权利要求1所述的靶标多核苷酸在制备抗多发性骨髓瘤药物中的应用。
10. 如权利要求2至4任一所述的小干扰核糖核酸在制备抗多发性骨髓瘤药物中的应 用。
【专利摘要】本发明涉及生物技术和医学领域，本发明公开了一种抗多发性骨髓瘤的小干扰核糖核酸及其应用。其中所述靶标多核苷酸的核苷酸序列如序列表中SEQ？ID？NO：1，SEQ？ID？NO：2和SEQ？ID？NO：3中任意一条所示。SUMO化修饰过度与多发性骨髓瘤预后不良相关，通过深入研究SUMO化修饰Wnt/β-catenin对多发性骨髓瘤细胞增殖凋亡的影响及分子机制，有助于找到骨髓瘤进展的根源，进一步阐明多发性骨髓瘤的预后及调节机制；进而针对多发性骨髓瘤复发的关键，开发新的治疗靶标，本发明提供的靶标DNA对实现更安全有效的抗骨髓瘤治疗，最终实现多发性骨髓瘤的治愈，具有十分重要的现实意义。
【IPC分类】C12N15-12, A61P35-00, A61K31-713, C12N15-113
【公开号】CN104561017
【申请号】CN201410843930
【发明人】周莉莉, 黄禾菁, 侯建
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月25日