l Compartment Kit (细胞区室试验试剂盒)(Qiagen)进行亚细胞分级分离；
[0017]图6表示根据本文的实施方式的PB突变体IllC和333F，其与野生型PB相比显示出增强的向细胞核的进入。图6(A)表示细胞内运输和免疫细胞化学特征。按照GeneTherapy (基因疗法)(2006) 13，821 - 836中详细确立的方案执行程序。以1:500的稀释度使用抗五邻体基质抗体(Ad5抗体)。以1:400的稀释度使用Alexa-Fluor 488山羊抗兔(二抗)。以1:100的稀释度使用鬼笔环肽，并且使用300nM的DAPI。绿色，野生型(WT)或突变体(111C、333F)PB ;红色，肌动蛋白；蓝色，细胞核。图6 (B)表示蛋白质运输的量化。选择左图表示的来自每次处理的十六个细胞用于量化。计数是基于Adobe Photoshop中每张图的柱状图。条表示绿色通道中80-255个窗口的绿色像素计数；
[0018]图7表示根据本文的实施方式的PB突变体更新的比对。新的肽长度基于由突变体克隆的核酸序列翻译的氨基酸序列。序列提供于本文图8-17中；
[0019]图8表示根据本文的实施方式的来自级分111克隆A(IllA)的突变PB的核酸和狀序列；
[0020]图9表示根据本文的实施方式的来自级分111克隆C(IllC)的突变PB的核酸和预测的氨基酸序列；
[0021]图10表示根据本文的实施方式的来自级分111克隆G(IllG)的突变PB的核酸和狀序列；
[0022]图11表示根据本文的实施方式的来自级分331克隆E(331E)的突变PB的核酸和狀序列；
[0023]图12表示根据本文的实施方式的来自级分331克隆I (3311)的突变PB的核酸和狀序列；
[0024]图13表示根据本文的实施方式的来自级分331克隆J(331J)的突变PB的核酸和狀序列；
[0025]图14表示根据本文的实施方式的来自级分333克隆A (333A)的突变PB的核酸和狀序列；
[0026]图15表示根据本文的实施方式的来自级分333克隆D (333D)的突变PB的核酸和狀序列；
[0027]图16表示根据本文的实施方式的来自级分333克隆E (333E)的突变PB的核酸和狀序列；
[0028]图17表示根据本文的实施方式的来自级分333克隆F、G和H(333F、333G、333H)的突变PB的核酸和肽序列。
[0029]发明详述
[0030]本文所使用的缩写“PB”意思是五邻体基质。
[0031]已经开发了各种试剂用于将治疗性基因和药物递送至患病的细胞，包括脂质体、合成聚合物、肽、蛋白质、病毒和病毒纳米颗粒(Medina-Kauwe，2006 ;Medina Kauwe等，2005) ο通常，由这些试剂形成的颗粒需要修饰以利于基因或药物载荷的递送。这种修饰包括附加靶向配体或抗体、膜渗透剂，和/或细胞内靶向(比如细胞核靶向)剂。这些修饰通常通过合理的设计引入，因此通过这种修饰产生的每个新的变体都需要实践检验。这将是耗费时间的和劳动密集的，并且存在产生未达最佳活性的风险。
[0032]过去和现在尝试改善细胞膜渗透性和/或细胞内运输的，是使用合理的设计将细胞渗透性或细胞内靶向肽缀合至药物载体。这种方法需要每个分子的实践检验。已经测试了用于增强的基因和药物递送的许多类型的细胞渗透肽，包括AntP、TAT、GALA、蜜蜂蜂毒肽和类似的肽(Medina-Kauwe，2006 ；Medina-Kauwe等，2005)。同样地，已经通过附加不同的聚碱性结构域比如SV40NLS、HMG-1、鱼精蛋白以及类似的肽或蛋白质，向基因递送试剂添加了细胞核革巴向活性(Medina Kauwe, 2006 ;Medina_Kauwe等，2005)。尽管这些肽中的每一种都具备渗透细胞膜或靶向至细胞内区室(包括细胞核)的能力，但是当与另一分子共价结合或表达为与另一分子融合的融合蛋白时，它们的活性改变。而且，对这些肽的每一个不同变体进行实践检验是耗费时间和劳动密集的。所以，尽管合理设计和实践检验是已有解决该问题的方案，但是该方法有其局限性。
[0033]本文所述的本发明通过使用选择压力来分离已经获得增强的细胞渗透、细胞内运输、和/或亚细胞靶向的蛋白质突变体，避免了细胞渗透/细胞内运输蛋白质/肽的合理设计和实践检验需要的时间和工作量。因为通过人工进化/选择压力获得的增强的特征，源自该方法的蛋白质突变体具有相对于亲本蛋白质或目前使用的现有基因/药物递送蛋白质的独特优势。最后，通过下述方法分离的特定蛋白质因为它们增强的膜裂解和运输特征，因而优于现有的细胞穿透肽。所以，该特定蛋白质可用于加强基因和药物递送，因此增强纳米医学中使用的颗粒的治疗效力。
[0034]本发明提供了一种生产靶向至细胞器的药物递送分子的方法。该方法包括下述步骤:(a)获得编码五邻体基质基因的多核苷酸，并产生多核苷酸的突变体；(b)将突变的多核苷酸克隆至噬菌体载体，并产生包括噬菌体载体的噬菌体文库；(C)用噬菌体文库转化细胞；(d)分级分离前述转化的细胞，并从转化的细胞收获细胞器；(e)扩增来自前述收获的细胞器的噬菌体；(f)用扩增后的来自前述收获的细胞器的噬菌体转化细胞；(g)重复步骤(d)、(e)、⑴和(g) ;(h)滴定来自每轮的前述收获的细胞器的噬菌体；(i)选择具有最高滴度的噬菌体，并从噬菌体获得突变的多核苷酸的序列；以及(j)产生由前述序列编码的多肽，其中该多肽是靶向至细胞器的药物递送分子。
[0035]在一些实施方式中，细胞器选自由线粒体、高尔基体、内质网、细胞核、核糖体、质膜和胞质溶胶所组成的组。细胞可以是哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞。可使用任何随机诱变方法或靶向诱变方法产生突变体。可用于产生突变体的方法的例子包括但不限于下述任何一种或多种:基于PCR的方法、化学诱变、紫外线诱导的诱变或其组合。五邻体基质基因中的突变可以为插入、缺失、替换的任何一种或多种或其组合。
[0036]在本发明的实施方式中，药物递送分子包括靶向结构域、核内体裂解配体结构域和带正电荷的结构域。
[0037]本发明还提供了用于将治疗剂递送至细胞器的载体，其包括由突变的五邻体基质基因编码的多肽。五邻体基质基因中的突变可通过下述分离:a)获得编码五邻体基质基因的多核苷酸，并产生多核苷酸的突变体；(b)将突变的多核苷酸克隆至噬菌体载体，并产生包括噬菌体载体的噬菌体文库；(C)用噬菌体文库转化细胞；(d)分级分离前述转化的细胞，并从转化的细胞收获细胞器；(e)扩增来自前述收获的细胞器的噬菌体；(f)用扩增后的来自前述收获的细胞器的噬菌体转化细胞；(g)重复步骤(d)、(e)、⑴和(g) ;(h)滴定来自每轮的前述收获的细胞器的噬菌体；(i)选择具有最高滴度的噬菌体，并从获得噬菌体获得前述突变的多核苷酸的序列；以及(j)产生由前述序列编码的多肽，其中该多肽是靶向至细胞器的药物递送分子。该载体进一步包括聚赖氨酸模体和靶向结构域，例如调蛋白的靶向结构域。
[0038]本发明进一步提供一种治疗剂，其包括上述载体、以及治疗性药物。该治疗性药物可以是例如治疗、抑制、预防、缓解疾病的影响、减少疾病的严重程度、减少发展的可能性、减缓疾病的进展和/或治愈疾病的药物。由治疗剂革G向的疾病包括但不限于癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细胞瘤、胚细胞瘤、各种免疫细胞上表达的抗原、和与各种血液学疾病相关的细胞上表达的抗原、自身免疫性疾病、和/或炎性疾病。治疗剂可以是化学治疗剂。
[0039]本发明还提供一种产生不具有增殖活性的载体的方法。该方法包括(a)获得编码调蛋白(Her)受体结合结构域的多核苷酸，并产生多核苷酸的突变体；(b)将突变的Her多核苷酸克隆至噬菌体载体，并产生包括噬菌体载体的噬菌体文库；(c)在存在有丝分裂抑制剂(例如紫杉醇)的情况下，用噬菌体文库转化MDA-MB-435细胞；(d)分级分离前述转化的细胞，并提取MDA-MB-435细胞的膜级分；(e)从膜级分收获膜噬菌体；(f)在存在有丝分裂抑制剂的情况下，将膜噬菌体转化为MDA-MB-435细胞；(g)重复步骤(d)、(e)和(f)；
(h)监测每轮的MDA-MB-435细胞增殖，并选择具有最低MDA-MB-435细胞增殖的膜噬菌体；
(i)获得前述选择的膜噬菌体中Her多核苷酸突变体的序列；以及(j)产生由Her序列和五邻体基质基因编码的多肽，其中多肽是不具有增殖活性的载体。Her基因的突变可以是插入、缺失、替换的任何一种或多种或其组合。
[0040]本发明进一步提供一种用于将治疗剂递送至细胞核的载体，其包括由