突变的Her序列编码的多肽，其中根据前述方法获得突变的Her。载体进一步包括编码五邻体基质蛋白的多肽和聚赖氨酸模体。五邻体基质蛋白可以是突变的蛋白质。实施例
[0041]实施例1
[0042]分离增强运输的突变体。
[0043]之前，开发了重组体腺病毒五邻体基质蛋白用于将各种治疗性分子体外和体内靶向和递送至肿瘤细胞(Agadjanian 等，2012 ；Agadjanian 等，2009 ；Agadjanian 等，2006 ；Medina-Kauwe 等，2001a ；Medina-Kauwe 等，2001b ；Rentsendor j 等，2008)。目前，五邻体基质重组体蛋白质(与包括HerPBK10‘PB’结构域的五邻体基质重组体蛋白质相同，用于将治疗剂革E向至 HER2+ 肿瘤细胞；(Agadjanian 等，2012 ；Agadjanian 等，2009 ；Agadjanian 等，2006 ；Medina Kauwe等，2001b ;Rentsendorj等，2008)通过细胞结合之后的多细胞进入途径而行进，一些但不是所有的途径支持膜渗透和进入胞质溶胶(Rentsendorj等，2006)。为了改善该功能并且增强治疗剂进入细胞靶的递送和渗透，使用定向进化方法，通过使用细胞核积聚作为读出信息，分离具有增强的细胞渗透活性的五邻体基质变体，因为核内体逃逸使得能够进入细胞核(Rentsendorj等，2006)。
[0044]程序:该两步法涉及:1.通过随机诱变产生突变体文库，和2.引入选择压力，以分离具有增强功能的变体，这取决于筛选方法。这里，分离存活进入胞质溶胶和/或细胞核的噬菌体将起到选择压力的作用，其预期产生具有增强的细胞渗透活性的变体(总结于图1)。因此，本发明人已经随机诱变了五邻体基质基因并且产生克隆至Ikn噬菌体载体的突变体文库。基于之前确立的定向进化研宄(Cherry等，1999 ；Shafikhani等，1997 ；ffan等，1998 ；You和Arnold，1996)，发明人瞄准每个基因1_4个氨基酸改变(或2_7核苷酸改变)的突变频率。基于使用特定易错聚合酶链式反应(PCR)方法(GeneMorphII RandomMutagenesis Kit(随机诱变试剂盒)；Stratagene, La Jolla, CA，USA)的产物产量，本发明人实现了每个五邻体基质基因约8核苷/kb或13.6核苷的估计突变频率(图2)。本发明人将该产物插入T7-选择噬菌体载体和包装的重组体噬菌体，以生产扩增的文库滴度为5xl010pfu/mLo
[0045]在HeLa细胞(其表达用于结合和摄入PB蛋白的整联蛋白受体)上淘选文库。在细胞上在4°C孵育噬菌体lh，以促进受体结合但非摄入，然后冲洗细胞并且在37°C孵育2h，以促进内化。摄入之后，收获的细胞进行分级分离，以分离细胞溶质和细胞核级分。然后，从每个级分扩增的噬菌体进行重复的生物淘选，并且从细胞收获物提取相应的连续级分(即扩增从第I轮分离的细胞核噬菌体并且再添加回细胞，随后重复分离细胞核级分，以再获得细胞核噬菌体)。在两轮或三轮的生物淘选之后，滴定从每次重复的级分分离的噬菌体，以测定与展示野生型五邻体基质的噬菌体相比，来自诱变文库的细胞核/细胞溶质噬菌体的相对富集。
[0046]结果:非诱变的亲本噬菌体T7-PB，产生的细胞核/细胞溶质噬菌体滴度比小于1，显示出在2h内到达细胞核的噬菌体的比例小于保留在细胞质中噬菌体的比例(图3)。相反，2轮的生物淘选和分离细胞核噬菌体之后(3-3a)，与细胞质保留相比，观察到朝向更高的细胞核积聚变化，与T7-PB相比具有显著的增加(P = 0.05)(图3)。即使从第3轮的细胞溶质级分淘选分离的噬菌体(1-1-1)显示与T7-PB相比，虽然不是非常显著(P = 0.07)，但是相对增加的细胞核分配(图3)。
[0047]在三轮的生物淘选和分离细胞溶质和细胞核突变体之后，本发明人对从每个富集群体随机挑取的克隆进行测序并且发现从细胞溶质和细胞核级分分离的大部分的克隆编码羧基-[C-]端截短蛋白质(图4)。位于野生型五邻体基质(wt PB)线性序列中部的287LDV和340RGD整联蛋白结合模体未保留在大部分的截短克隆中。截短突变体之一包含LDV,但没有RGD模体，而剩余的截短缺少LDV和RGD模体。通过生物淘选分离的全长克隆保留了 LDV和RGD模体，但是也包含了引入潜在的改变功能的氨基酸变化的几个点突变(图4)。这些之中有细胞溶质级分克隆IllC中的Leu60Trp替换；和细胞核级分克隆333F中Lys375Glu、Val449Met和Pro469Ser氨基酸改变。为了检测每个分离的变体对赋予增强的细胞溶质和/或细胞核渗透的能力，通过免疫荧光和共焦显微术，将每一个的细胞内运输与亲本蛋白质比较，并且通过亚细胞分级分离来确认。具体而言，因为全长突变体(111C和333F)和突变体331J保留整联蛋白结合模体，测试这些变体以与wt PB比较，因为预测它们经整联蛋白结合和摄入进入细胞。同时，因为保留的截短变体缺少任何受体-结合模体，这些将插入HerPBKlO以替换PB结构域，并且进行测试并与经人表皮生长因子受体(HER)结合和摄入进入细胞的亲本HerPBKlO比较。
[0048]实施例2
[0049]信号传导减弱的受体-结合和内吞作用突变体的分离。
[0050]基本原理:肿瘤-靶向的细胞渗透蛋白质HerPBKlO，通过包括调蛋白的受体结合结构域(这里命名为HerPBKlO的‘Her’结构域)被特异性引导至人表皮生长因子受体(HER) (Medina-Kauwe等，2001b)。但是，调蛋白受体的连接可诱导信号传导，该信号传导可导致肿瘤细胞增殖、分化，并且在一些情况下导致细胞凋亡，这取决于几个因素，包括受体异源二聚物比例、配体亚型、细胞类型，和某些细胞内分子的存在(Aguilar等，1999 ；Lewis等，1996 ;WeinStein等，1998)。由于可能诱导不良作用(比如肿瘤进展)，因此检测有丝分裂抑制剂引入的选择压力是否可选择缺少增殖信号传导的受体结合和内吞作用突变体。本发明人提出如下进行测试，其产生展示Her变体的噬菌体文库，并且通过从静息细胞分离内化的噬菌体并且筛选文库从而使缺少增殖信号传导的Her种类内化，并且在非增殖性人乳腺癌细胞上再淘选。
[0051]稈序:通过易错PCR和交错延伸，产牛包含遍及编码序列分布的不同突变的Her序列的文库，在初始启动模板序列之后必须重复变性和简单退火/延伸的循环(Zhao等，1998) ο所得文库插入适当的载体臂，用于转染至T7选择(T7Select)噬菌体(其开发为展示全蛋白质)，并且按照制造商的说明产生重组体■菌体(Novagen，Gibbstown, NJ, USA) ο基于进化的AAV衣壳的生物淘选，将初始滴度为10~12的噬菌体添加至在培养基中培养的MDA-MB-435细胞，该培养基包含有丝分裂抑制剂比如紫杉醇，并且在约30_45min之后(结合和内化需要的时间；Medina-KauWe等，2000)，通过胰蛋白酶/EDTA (去除非内化的噬菌体)收获细胞，并且进行膜提取，以分离粗病毒的小泡(vesicle)级分(Qproteome PlasmaMembrane Protein Kit (质膜蛋白质试剂盒)，Qiagen Inc.，Valencia, CA, USA)，其然后可通过CsCl显带分离。进行三至四轮的选择(即添加分离的病毒至新鲜的细胞和重复膜提取)并且以下述方式表征分离的病毒。第一，将接收浓缩病毒的新鲜细胞固定并且处理用于使用抗噬菌体抗体的免疫荧光(Sigma-Aldrich，St.Louis, MO，USA)，以确认分离的噬菌体仍内化。通过代谢试验，与模拟品和未处理细胞比较，评估平行处理的分开的细胞的增殖速率。第二，将来自分离噬菌体的Her序列切下并且插入细菌表达载体，用于重组体蛋白质的产生(Medina-Kauwe等，2001a)，然后与亲本Her以及模拟品和未处理的细胞比较，如之前描述的那样测试在MDA-MB-435人乳腺癌细胞中突变体Her的内化和增殖活性。对突变体克隆测序，以识别突变的区域，并且再插入HerPBKlO表达盒，替换亲本‘Her’。
[0052]上述各种方法和技术提供了许多实施本申请的方式。当然，应当理解，根据本文所述的任何【具体实施方式】没有必要实现所描述的所有目标或优势。因此，例如，本领域技术人员将认识到，实施本方法的方式可以是实现或优化如本文教导的一个优点或一组优点而不必实现本文教导或提出的其他目标或优点。本文提到了各种可选方式。应当理解，一些优选的实施方式具体包括一个、另一个或几个特征，而其他的实施方式具