/L氨氧化轴溶液的比例为1:1。
[0116] 3)按照沉淀的微载体与氨氧化轴溶液的体积比1:1，加入0. 5mol/L的氨氧化轴溶 液，摇动5分钟至均匀的息浊液，然后静止20分钟后，用导液管虹吸排走上清，并取样在显 微镜下观察(见图6)。
[0117] 4)按照沉淀的微载体与洗涂液I的体积比1:2,加入洗涂液I (lOmmol/L，抑值 7. 6磯酸盐缓冲液，含有0. 05%聚山梨醋80)。摇动4分钟至均匀的息浊液，然后静止20分 钟后，用导液管虹吸排走上清。再重复此洗涂操作两次，并取样在显微镜下观察(见图7)。
[0118] 5)按照微载体与消化液体积比为1: 2,加入质量百分比含量为0. 2%膜蛋白酶、 0. 02%邸TA二轴、0. 85%NaCl、0. 05%聚山梨醋80的消化液。摇动5分种，使微载体与消化液 混合成均匀的息浊液，然后，室温下静止，自然沉降30分种，用导液管虹吸排走上清，并取 样在显微镜下观察(见图8)。
[0119] 6)按照微载体与巧樣酸溶液体积比1:1，加入0. 08mol/L巧樣酸溶液，摇动5分 种，使微载体在溶液中呈均匀息浊液，然后，微载体息浊液自然沉降30分种，使微载体沉淀 下来，用导液管虹吸排走上清，并取样在显微镜下观察(见图9)。
[0120] 7)按照微载体息液和洗涂液II体积比1:2，加入洗涂液II (20mmol/L，抑值7. 5磯 酸盐缓冲液)，摇动5分种，使微载体在溶液中呈均匀息浊液，微载体息浊液自然沉降30分 种，使微载体沉淀下来，用导液管虹吸排走上清，重复此项操作3次，最后一次上清排走一 半。
[012。 8)取上述处理后的微载体息浊液样品，进行显微镜观察(见图10)和抑测定。观察 到的结果为，5个视野，微载体颗粒表面均无细胞残骸，微载体息液的抑值测定结果为7. 2。
[0122] 9)将装有处理过的微载体瓶，盖好透气瓶盖，放入到高压柜中，进行12rC灭菌30 分钟，之后，室温冷却后，放入2-8 °C冰箱中放置备用。 。12引 连施例7
[0124] 采用实施例6的方法，对于化生物反应器中使用过2次细胞培养的微载体进行处 理，该处理过的微载体再用于细胞培养时，为第3次使用的微载体。 阳1巧]连施例8
[0126] 采用实施例6的方法，对于化生物反应器中使用过4次细胞培养的微载体进行了 处理，该处理过的微载体再用于细胞培养时，为第5次使用的微载体。
[0127] 为了验证实验实施例中再生微载体处理的效果，进行了微载体显微镜照片对比， 细胞接种后贴壁速度和贴壁效果对比，细胞在微载体上培养时间长短对比，利用再生微载 体培养的细胞增殖己脑病毒及生产己脑抗原的对比，W及利用优选处理方法处理的微载体 1-5次重复使用的细胞培养效果对比等等。
[012引验证例1 :不同处理方法的再生微载体的显微镜观察结果比较
[0129] 1)将未使用过新的微载体，用20mmol/L的磯酸盐缓冲液浸泡2小时后，取微载体 息液作为参照；
[0130] 2)取实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6的微载体样品，进 行显微镜下观察；
[0131] 3)每个样品观察5个视野，视野中不少于10个微载体，观察放大倍数为100倍；
[0132] 4)观察5个视野每个微载体上有无细胞残骸的比较结果：
[0133]
【主权项】
1. 一种用于再生处理微载体的方法，所述方法包括以下步骤： 1) 微载体收集：用硅化好的玻璃瓶收集含细胞和/或培养用过的微载体的培养液，自 然沉降15-30分钟，弃掉上清液，保留微载体在玻璃瓶中； 2) 微载体碱处理：向经沉降得到的微载体中加入氢氧化钠溶液，所述氢氧化钠溶液的 浓度为〇. 1-1. 〇mol/L，微载体与加入的氢氧化钠溶液的体积比为1:1-1:2,摇动3-5分钟 后，自然沉降15-30分钟，弃掉上清液； 3) 微载体的第一次洗涤：向经沉降得到的微载体中加入洗涤液I，所述洗涤液I为含 有0. 01%-0. 05%聚山梨酯80的10-30mmol/L、pH值7. 4-7. 8磷酸盐缓冲液，微载体与加入 的洗涤液I的体积比为1:2-1:3,摇动3-5分钟后，自然沉降15-30分钟，弃掉上清液，并重 复此项操作2次； 4) 微载体消化液处理：向经沉降得到的微载体中加入消化液，所述消化液以质量百分 比含量计包含〇. 2%-0. 4%胰蛋白酶、0. 02%二乙胺四乙酸二钠、0. 85%氯化钠、0. 01%-0. 05% 聚山梨酯80,微载体与加入的消化液的体积比为1:1-1:2,摇动3-5分钟后，自然沉降20-40 分钟，弃掉上清液； 5) 微载体酸处理：向经沉降得到的微载体中加入柠檬酸溶液，所述柠檬酸溶液的浓度 为0. 05-0. lmol/L，微载体与柠檬酸溶液的体积比为1:1，摇动3-5分钟后，自然沉降15-30 分钟，弃掉上清液； 6) 微载体第二次洗涤：向经沉降得到的微载体中加入洗涤液II，所述洗涤液II为 10-30mmol/L、pH值7. 4-7. 8磷酸盐缓冲液，微载体与洗涤液II的体积比为1:2-1:3,摇动 3-5分钟后，自然沉降20-40分钟,弃掉上清液,重复此项操作2-3次。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括： 7) 取处理好的微载体样品在显微镜下观察及pH值测定； 8) 处理好的微载体灭菌处理：将微载体进行121 °C高压灭菌15-45分钟，室温自然冷却 后，置于2-8°C的情况下保存备用。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述氢氧化钠溶液的浓度为0. 5mol/ L〇
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述洗涤液I为含有0. 05% 聚山梨酯80的10mm〇l/L、pH值7. 6磷酸盐缓冲液。
5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述消化液中各成分的质量 百分比为胰蛋白酶0. 2%、乙二胺四乙酸二钠0. 02%、氯化钠0. 85%、聚山梨酯800. 05%。
6. 根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述柠檬酸溶液的浓度为 0.08mol/L〇
7. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述洗涤液II为20mmol/L， pH值7. 5磷酸盐缓冲液。
8. 根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤7)包括：在显微 镜下观察5-10个视野，所看到的微载体表面均无细胞残骸。
9. 根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤7)得到的微载体 悬液，其pH值为7. 0-7. 8。
【专利摘要】本发明涉及一种细胞及病毒培养用微载体的再生处理方法。该方法是通过特殊处理液和合适的处理手段对已使用过的微载体即已培养过贴壁细胞的微载体进行有效的处理，使其达到与新微载体一样的培养效果。并且通过本方法处理，可使微载体反复使用4至5次，即便是第5次使用处理过的微载体，其细胞及病毒培养效果仍达到新微载体的90%以上的培养效果。所以本方法的建立不仅使微载体的利用率提高了近4倍，也使规模利用微载体培养细胞和病毒的成本得到了大幅度的降低。本发明所述的微载体再生处理方法可广泛用于处理在细胞培养中使用的其它微载体。
【IPC分类】C12N5-02, C12N5-07, C12N7-00, C12N5-071
【公开号】CN104630128
【申请号】CN201310571449
【发明人】李云富, 李刚, 吴林彝, 黄奕斌, 郭晓娜, 罗翀, 肖俊光
【申请人】丽珠集团疫苗工程股份有限公司
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2013年11月13日