工程菌及其在制备(3r, 5s)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物制药领域，尤其设及一种工程菌及其在制备 (3R，5S)-6-氯-3, 5-二哲基己酸叔了醋中的应用。
【背景技术】
[0002] 他汀类药物是一类哲甲基戊二酷辅酶A(HMG-CoA)还原酶的竞争性抑制剂药 物，是目前临床上应用广泛的降血脂药物。HMG-CoA还原酶催化HMG-CoA还原成3-甲 基-3, 5-二哲基戊酸的反应是胆固醇的生物合成途径，他汀类药物通过抑制HMG-CoA还原 酶的合成，可抑制体内胆固醇的合成，降低低密度脂蛋白胆固醇（LDkC)水平，对W胆固醇 升高为主的高血脂症和冠屯、病有较好的疗效。在结构上，他汀类药物通常由憎水性的刚性 平面结构母核和具有双手性中屯、的（3R，5S/R)-双哲基己酸醋组成。
[0003] 其中，阿托伐他汀（Atorvastatin)是全新第S代、全合成、高纯化、高选择性的 HMG-CoA还原酶抑制剂，多年来占据降血脂药物的主要市场份额。（3R，5S)-6-氯-3, 5-二 哲基己酸叔了醋是合成阿托伐他汀的关键中间体，在其制备方法中，利用还原酶从 (S)-6-氯-5-哲基-3-幾基己酸叔了醋一步还原的方法，W其高效率、高选择性的特点成为 化学和制药工业界重点研究的对象。
[0004] 目前，报道的制备（3R，5S)-6-氯-3, 5-二哲基己酸叔了醋的方法分为两种，一种 为化学还原法，在现有技术中，按化学还原剂的不同主要有两种方法，其一为在棚烧及棚氨 化钢作用下，采用-7〇°C低温还原，相关公开专利为；中国专利CN101624390、CN102180862、 CN101613341、印度专利2009MU03028,该法反应条件苛刻且需大量易燃有毒的棚烧，在工艺 安全方面不易控制；另一则是采用金属复合催化剂高压加氨的方法进行还原，相关公开专 利为中国专利CN103483295A、日本专利2003128629,其催化剂制备工艺复杂，且反应需要 保证无水无氧，不利于工业化应用。
[0005] 相比较而言，生物法的应用条件更加温和，操作也相对简便。例如美国专利 US20130040364 A1公开了一种利用来自于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)的幾基 还原酶及其突变株不对称还原生产（3R，5S)-6-氯-3, 5-二哲基己酸叔了醋的方法，同时美 国专利US6472544B1也公开了一种利用来自木兰假丝酵母（Candida magnoliae IF00705) 的幾基还原酶来进行不对称还原的方法，该两种方法均采用添加辅助的葡萄糖脱氨酶和葡 萄糖的方法来实现辅酶的原位循环。该方法虽然较化学法具有较多的优点，但其辅酶循环 过程中会产生与产物等摩尔数的葡萄糖醒酸，反应过程中需要加入等摩尔数的碱W维持反 应体系的抑，反应体系中产生的酸和碱在一定程度上会对酶活产生一定的影响，从而延长 反应的时间。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种工程菌及其在制备（3R，5S)-6-氯-3, 5-二哲基己酸叔了醋 中的应用，该工程菌能够不对称还原（S)-6-氯-5-哲基-3-幾基己酸叔了醋合成（3R， 5S)-6-氯-3, 5-二哲基己酸叔了醋，产物的转化率和纯度均较高。
[0007] 本发明提供了一种工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述目的 基因为如碱基序列SEQ ID NO. 3所示的幾基还原酶基因。
[000引所述的幾基还原酶基因（简称DKr)为全合成基因，基因来源于Acinetobacter calcoaceti州S SC 13876的二幾基还原酶基因Dkr。
[0009] 所述工程菌含有带所述幾基还原酶基因的表达载体祀T30-30a(+);宿主细胞 为大肠杆菌，优选地，为大肠杆菌化2UDE3)菌株。所述幾基还原酶基因在大肠杆菌 BL2UDE3)中表达，使工程菌过量表达幾基还原酶。
[0010] 本发明提供了一种所述的工程菌在W做-6-氯-5-哲基-3-幾基己酸叔了醋为 底物制备（3R，5S)-6-氯-3, 5-二哲基己酸叔了醋中的应用。
[0011] 具体地，本发明提供了一种生产（3R，5S)-6-氯-3, 5-二哲基己酸叔了醋的方法， 包括：
[0012] (1)制备包含碱基序列如SEQ ID No. 3所示的幾基还原酶基因的工程菌；
[0013] (2)制备所述工程菌的静息细胞悬液；
[0014] (3)将静息细胞悬液和辅因子加入到底物（S)-6-氯-5-哲基-3-幾基己酸叔了 醋、氨供体和缓冲液的混合液中，反应制得（3R，5S)-6-氯-3, 5-二哲基己酸叔了醋。
[0015] 本发明的反应式为；
[0016]
【主权项】
1. 一种工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，其特征在于，所述目的基因 为碱基序列如SEQ ID NO. 3所示的羰基还原酶基因。
2. 如权利要求1所述的工程菌在以（S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物制 备（3R，5S) -6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯中的应用。
3. -种生产（3R，5S) -6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯的方法，其特征在于，包括： (1) 制备包含碱基序列如SEQ ID No. 3所示的羰基还原酶基因的工程菌； (2) 制备所述工程菌的静息细胞悬液； (3) 将静息细胞悬液和辅因子加入到底物（S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、氢 供体和缓冲液的混合液中，反应制得（3R，5S)-6-氯-3, 5-二羟基己酸叔丁酯。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的氢供体为异丙醇。
5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述反应的温度为25~37°C，反应液的pH 值为6.0~7. 5。
6. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液或三乙醇胺 盐缓冲液。
7. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的辅因子为NADP +/NADPH。
8. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的浓度为IOOmM~200mM。
【专利摘要】本发明公开了一种工程菌及其在制备(3R，5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用，该工程菌包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述目的基因为如SEQ ID NO.3所示的羰基还原酶基因。本发明将SEQ ID NO.3所示的羰基还原酶基因导入宿主细胞构建的工程菌可表达羰基还原酶Dkr，通过该酶的催化作用可实现将(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原成(3R，5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯，该反应条件温和，操作简便，采用异丙醇辅酶再生的方式，使反应过程中无需进行pH的实时调节，不仅避免了化学法存在的反应条件苛刻、催化剂制备复杂等问题，还对生物法进行了一定的改进，具有重要的应用前景。
【IPC分类】C12P7-62, C12R1-19, C12N15-53, C12N1-21
【公开号】CN104630125
【申请号】CN201510014460
【发明人】杨立荣, 何秀娟, 陈少云, 吴坚平, 徐刚
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年1月12日