一种银杏叶提取物中白果内酯单体的分离纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种从银杏叶提取物中分离银杏内酯的方法，具体涉及从银杏叶提取物中分离白果内酯的方法。
【背景技术】
[0002]银杏Ginkgo L.为我国的原产植物，国内外大量使用银杏叶提取物类药物预防和治疗脑血管、心血管系统机能衰退等病症。银杏叶的功效成分，主要包括黄酮醇苷、白果内酯及银杏内酯A、B、Co其中白果内酯具有神经性疾病治疗功效，同时对神经元及神经组织有营养作用，对谷氨酸诱导的兴奋毒性神经损害具有保护作用。用于治疗经神病、老年痴呆症和脊髓病、抗衰老等。但白果内酯与银杏叶提取物中的黄酮类物质、胶体物质溶解性差别很小，通常混为一体，呈黏膏状，分离纯化非常困难。以往针对白果内酯分离、纯化的报道较少。
[0003]近几年，国内对于白果内酯的分离多以银杏叶提取物为原料，采用高效液相色谱柱小批量制备。在专利CN100497344C《一种高纯度银杏内酯的制备方法》采用三个溶剂体系，分别经过两次高速逆流色谱HSCCC分离后，可得到较高浓度的银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J和白果内酯。
[0004]CN100413869C《白果内酯配位色谱分离纯化方法》采用在白果内酯初提液中添加配位剂。所述的配位剂为能形成配离子的无机物或包合物等，如硝酸银、硼酸、鹏钠、氯化锌、氯化铁、氯化锰等。
[0005]CN1634925A《一种银杏内酯单体的分离纯化工艺》采用柱色谱-重结晶-超临界CO2精制纯化组合工艺，制取高纯银杏内酯类单体。柱色谱采用正相或反相固定填料，使用水、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、氯仿、石油醚等溶剂梯度洗脱。色谱柱填料包含正相硅胶、氧化铝、金属螯合树脂，配位色谱填料。
[0006]上述方法虽然得到了较高纯度的白果内酯产品，但是要么工艺路线长而且色谱填料循环使用频次低，产量小，费用高；要么加入了有毒试剂，对产品造成一定污染，不利于工业化生产。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种银杏叶提取物中白果内酯单体的分离纯化方法，方法操作方便，成本低廉，纯度可达到95 %以上，产品回收率高，解决白果内酯分离纯化难的问题，为规模化生产提供一种简单有效的方法。
[0008]为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施:
[0009](I)原料预处理:取200克银杏叶提取物，加1600ml水和400ml乙酸乙酯，搅拌溶解。每次用100ml乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液。萃取液浓缩回收乙酸乙醋，加水再浓缩，沉降一夜，析出大部分银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C。含白果内酯母液调乙醇至5%?10%，室温沉淀2?4小时，抽滤，滤液用乙酸乙酯石油醚混合溶液萃取3次，每次400?600mL，取轻相浓缩至干，然后用300?400mL15%?30 %乙醇60°C加热溶解，放置一夜，过滤。
[0010](2)聚酰胺树脂初步分离纯化:将滤液上聚酰胺树脂柱，树脂体积100?200mL，200?400mL10?30%乙醇解析，将上柱流出液和解析液合并，减压浓缩到原体积1/5，调节乙醇浓度至30%?50%。
[0011 ] (3) PRP512C色谱分离纯化过程:在低压层析柱内湿法装填PRP512C型树脂1000?2000ml作为固定相，上一步骤的白果内酯溶液转移到色谱分离柱中。10%?30%的乙醇作流动相，1.5倍柱流速，10%?30%的乙醇用量6000?12000mL。得到白果内酯洗脱液。
[0012](4)白果内酯的纯化:为了得到高质量分数的白果内酯单体，将上述所得白果内酯洗脱液浓缩到100?200mL，调节乙醇浓度20%?30%，室温放置析晶，得到纯度为80%的白果内酯单体。将得到的单体再次用低浓度乙醇溶解重结晶后得到棱柱状白果内酯结晶。
[0013]本发明的有益效果是:
[0014](I)本法简便有效，工艺流程适合银杏叶提取物中对白果内酯的分离纯化，具有较好的选择性；
[0015](2)色谱树脂填料操作简单易于再生，与重结晶工艺结合适合工业化生产；
[0016](3)原材料采用的是市场上的普通银杏叶提取物，具有较高的综合利用价值，为大规模制备银杏内酯A、B、C和白果内酯的生产工艺奠定了良好的基础；
[0017](4)本法可得到纯度95%以上的白果内酯单体，达到了药用纯度的要求；
[0018](5)本发明采用聚酰胺能脱除黄酮类化合物等极性较强的杂质，利于后续分离，采用反相色谱填料PRP512C，对白果内酯有高效的分离选择性，能有效分离白果内酯与其它内醋；
[0019](6)本发明采用的聚酰胺和PRP512C色谱填料均可反复再生使用，操作方便，适合工业化生产。
【具体实施方式】
:
[0020]本发明所述的银杏叶提取物是使用常规方法，将银杏叶经乙醇提取、浓缩、大孔树脂吸附、二次浓缩、干燥得到，所述银杏叶提取物每百克含约3克左右白果内酯。
[0021]实施例1:取200克银杏叶提取物(含有白果内酯6克左右)，加1600ml水和400ml乙酸乙酯，搅拌溶解。每次用100ml乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液。萃取液浓缩回收乙酸乙酯，加水再浓缩，沉降一夜，析出大部分银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C。含白果内酯母液调醇至5%?10%，室温沉淀2?4小时，抽滤，滤液用乙酸乙酯石油醚混合溶液萃取3次，每次400?600mL，取轻相浓缩至干，然后用300?400mL15%?30%乙醇60°C加热溶解，放置一夜，过滤。将滤液上聚酰胺树脂柱，树脂体积100?200mL，200?400mL10?30%乙醇解析，将上柱流出液和解析液合并，减压浓缩到原体积1/5，调节乙醇浓度至30%?50%。在低压层析柱内湿法装填PRP512C型树脂1000?2000ml作为固定相，白果内酯溶液转移到色谱分离柱中。10%?30%的乙醇作流动相，1.5倍柱流速，10%?30%的乙醇用量6000?12000mL。得到白果内酯洗脱液。为了得到高质量分数的白果内酯单体，将上述所得白果内酯洗脱液浓缩到100?200mL，调节乙醇浓度20%?30%，室温放置析晶，得到白果内酯单体。将得到的单体再次用低浓度乙醇溶解重结晶后得到棱柱状白果内酯晶体，按中国药典方法检测白果内酯含量95.8%。
[0022]实施例2:取4千克银杏叶提取物(含有白果内酯120克左右)，加32L水和8L乙酸乙酯，搅拌溶解。每次用20L乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液。萃取液浓缩回收乙酸乙醋，加水再浓缩，沉降一夜，析出大部分银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C。含白果内酯母液调乙醇至5%?10%，室温沉淀2?4小时，抽滤，滤液用乙酸乙酯石油醚混合溶液萃取3次，每次8?12LL，取轻相浓缩至干，然后用6?8L15 %?30 %乙醇60°C加热溶解，放置一夜，过滤。将滤液上聚酰胺树脂柱，树脂体积2?4L，4?8L10?30%乙醇解析，将上柱流出液和解析液合并，减压浓缩到原体积1/5，调节乙醇浓度至30%?50%。在低压层析柱内湿法装填PRP512C型树脂20?40L作为固定相，白果内酯溶液转移到色谱分离柱中。10%?30%的乙醇作流动相，1.5倍柱流速，10%?30%的乙醇用量120?240L。得到白果内酯洗脱液。为了得到高质量分数的白果内酯单体，将上述所得白果内酯洗脱液浓缩到I?2L，调节乙醇浓度20%?30%，室温放置析晶，得到白果内酯单体。将得到的单体再次用低浓度乙醇溶解重结晶后得到棱柱状白果内酯晶体，按中国药典方法检测白果内酯含量95.4%。
【主权项】
1.原料预处理:取200克银杏叶提取物，加1600ml水和400ml乙酸乙酯，搅拌溶解。每次用100ml乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液。萃取液浓缩回收乙酸乙酯，加水再浓缩，沉降一夜，析出大部分银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C。含白果内酯母液调乙醇至5%?10%，室温沉淀2?4小时，抽滤，滤液用乙酸乙酯和石油醚混合溶液萃取3次，每次400?600mL，取萃取液浓缩至干，然后用300?400mL15%?30%乙醇60°C加热溶解，放置一夜，过滤。
2.聚酰胺树脂初步分离纯化:将滤液上聚酰胺树脂柱，树脂体积100?200mL，200?400mL10?30%乙醇解析，将上柱流出液和解析液合并。合并液减压浓缩到原体积1/5，调节乙醇浓度至30%?50%。
3.PRP512C色谱分离纯化:在低压层析柱内湿法装填PRP512C型树脂1000?2000mL作为固定相，上一步骤的白果内酯溶液转移到色谱分离柱中。10%?30%的乙醇作流动相，1.5倍柱流速，10%?30%的乙醇用量6000?12000mL。得到白果内酯洗脱液。(4)白果内酯的纯化:为了得到高质量分数的白果内酯单体，将上述所得白果内酯洗脱液浓缩到100?200mL，调节乙醇浓度20%?30%，室温放置析晶，得到白果内酯单体。将得到的单体再次用低浓度乙醇溶解重结晶后得到棱柱状白果内酯晶体，经过HPLC检测纯度95%以上，白果内酯收率80%以上。
【专利摘要】一种银杏叶提取物中白果内酯单体的分离纯化方法，以银杏叶提取物为原料，通过萃取和预处理，聚酰胺树脂分离，然后用PRP512C色谱填料进行纯化，最后经过重结晶，得到纯度达到95％以上的白果内酯单体，白果内酯收率达到80％以上。建立了一种简单易行的分离和纯化白果内酯单体的方法。
【IPC分类】C07D493-20
【公开号】CN104693214
【申请号】CN201410840080
【发明人】蒋永红, 李新晴, 李五洲, 曹礼群, 张艳, 曹如
【申请人】徐州技源药业有限公司
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2014年12月22日