本发明一种木质纤维素水解液发酵生产高浓度柠檬酸的【具体实施方式】。
[0031]实施例1
[0032]烘干的玉米秸杆与5%的稀硫酸溶液以2: I的质量比混合均匀，然后于190°C、
1.2MPa的条件下预处理3分钟；预处理后物料调节pH至5.0,加入生物脱毒所用菌种Amorphotheca resinae ZNl (其保藏编号CGMCC7452)，25°C固态脱毒10天；将脱毒后的物料加入发酵罐中，调整固含量为25%，纤维素酶用量为15FPU/克干固体，在50°C，pH4.8的条件下糖化48h ;然后离心得到的上清液即为秸杆酶解液。向酶解液中加入2.5g/L氯化铵，磷酸二氢钾2.5g/L，七水合硫酸镁0.25g/L，五水合硫酸铜0.25mg/L,七水合硫酸锌1.1mg/L，七水合硫酸亚铁6.5mg/L,氯化锰3.6mg/L，并以10 %的接种量接入培养好的黑曲霉Aspergillus niger M288 (购自上海市工业微生物研究所菌种保藏中心)，于33°C、200rpm的条件下发酵168小时。水解液中的初糖浓度为89.89g/L，最终柠檬酸浓度为58.04g/L，柠檬酸得率为64.56g/g葡萄糖。
[0033]实施例2
[0034]烘干的玉米秸杆与5%的稀硫酸溶液以2: I的质量比混合均匀，然后于190°C、1.2MPa的条件下预处理3分钟；预处理后物料调节pH至5.0,加入生物脱毒所用菌种Amorphotheca resinae ZNl (其保藏编号CGMCC7452)，25°C固态脱毒10天；将脱毒后的物料加入发酵罐中，调整固含量为25%，纤维素酶用量为15FPU/克干固体，在50°C，pH4.8的条件下糖化48h ;然后离心得到的上清液即为秸杆酶解液。向酶解液中加入1.0g/L氯化铵，磷酸二氢钾2.5g/L，七水合硫酸镁0.25g/L，五水合硫酸铜0.25mg/L,七水合硫酸锌1.lmg/L,七水合硫酸亚铁6.5mg/L,氯化锰3.6mg/L，并以10%的接种量接入培养好的黑曲霉Aspergillus niger M288 (购自上海市工业微生物研究所菌种保藏中心)，用5M氢氧化钠调整初始PH值至6.0,于33°C、200rpm的条件下发酵216小时。水解液中的初糖浓度为107.55g/L，最终柠檬酸浓度为92.37g/L，柠檬酸得率为85.88g/g葡萄糖。
[0035]本发明所涉及的纤维质原料不限于玉米秸杆，还可以为麦秸、稻草、木屑、能源植物或者林业废弃物、废纸，纸板，建筑和拆迁木材废料和庭院废物中的一种；木质纤维素处理物选自采用稀酸、蒸汽膨爆、液氨膨爆、生物法预处理后的麦秸、稻草、木屑、能源植物、林业废弃物、废纸，纸板，建筑和拆迁木材废料和庭院废物中的一种。
[0036]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。
【主权项】
1.一种利用木质纤维素原料生产柠檬酸的方法，其特征在于，其方法为:以木质纤维素为原料低成本高效生产柠檬酸；使用黑曲霉Aspergillus niger M288作为发酵菌种，黑曲霉Aspergillus niger M288购自上海市工业微生物研究所菌种保藏中心；需要高浓度糖作为发酵的碳源；以农业残留玉米秸杆为原料，经预处理、脱毒后作为培养基；液体培养获得作为种子的细胞，接种于木质纤维素酶解液或同步糖化与发酵体系中，黑曲霉Aspergillus niger M288把纤维素降解得到的葡萄糖转化为朽1檬酸。
2.如权利要求1所述的一种利用木质纤维素原料生产柠檬酸的方法，其特征在于，其具体步骤为: (1)极低水用量的木质纤维素原料高温稀酸预处理: 取干基玉米稻杆，按2: I的固液比(w/w)加入质量浓度为5% (w/w)的稀硫酸,搅拌均匀后，将玉米秸杆装填入预处理反应器中进行预处理，温度为190°C、1.2MPa，维持3分钟；预处理结束后，取出物料并冷却至室温，盛入塑料袋中备用； (2)预处理后木质纤维素原料的脱毒处理 脱毒处理方法包括但不限于生物脱毒、水洗、过碱化处理(Overliming)、离子吸附、减压蒸馏、活性炭脱色中的一种，优选生物脱毒； (3)利用液体培养基培养黑曲霉Aspergillusniger M288 黑曲霉Asperillus niger M288种子在20_50°C，50_800rpm的条件下培养。种子培养基的成分为葡萄糖50-100g/L，氯化铵1.0-4.0g/L，磷酸二氢钾1.0-4.0g/L，七水合硫酸镁0.1-0.5g/L，五水合硫酸铜0.1-0.5mg/L,七水合硫酸锌0.1-5.0mg/L,七水合硫酸亚铁1.0-10.0mg/L,氯化猛 1.0-5.0mg/L ； (4)朽1檬酸的生产 利用分别糖化与发酵柠檬酸的方式，糖化液的制备条件为:固体含量为10-40%，酶量为5-30FPU/g DM，温度为45-55°C, pH为4.5-5.5，糖化36-60小时，然后进行离心或压滤等方法获得水解液；利用糖化液进行柠檬酸生产的条件为:初始pH为2.0-6.0，菌种转接量体积百分比为5-20%，在25-40°C，50-800rpm发酵100-216小时，生产柠檬酸；柠檬酸生产中的营养物为:氯化铵0.5-4.0g/L,磷酸二氢钾1.0-4.0g/L,七水合硫酸镁0-0.5g/L，五水合硫酸铜0-0.5mg/L,七水合硫酸锌0-2.5mg/L,七水合硫酸亚铁0-10.0mg/L,氯化猛0-5.0mg/L ； 或者利用木质纤维素同步糖化发酵柠檬酸，其条件为:初始PH为2.0-6.0,菌种转接量体积百分比为5-20%，固体含量为10-40%，酶量为5-30FPU/gDM，通气量为0.1-1Ovvm,在30-50°C，50-800rpm发酵100-216小时，生产柠檬酸；同步糖化与发酵中所需的营养物为:氯化铵0.5-4.0g/L,磷酸二氢钾1.0-4.0g/L,七水合硫酸镁0-0.5g/L，五水合硫酸铜0-0.5mg/L,七水合硫酸锌0-2.5mg/L,七水合硫酸亚铁0-10.0mg/L,氯化锰0-5.0mg/L ； (5)朽1檬酸产品的分离提取 包括固液分离、沉淀提纯、硫酸溶解、离子交换、浓缩结晶步骤，即可得到结晶状的柠檬酸。
3.如权利要求2所述的一种利用木质纤维素原料生产柠檬酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(I)中，预处理方法包括但不限于稀酸预处理，蒸汽爆破，氨纤维爆破、液氨膨爆、亚硫酸盐预处理、碱法预处理、机械磨碎预处理、生物预处理等，优选稀酸预处理方法。
4.如权利要求2所述的一种利用木质纤维素原料生产柠檬酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(I)中，所述的木质纤维素原料包括玉米秸杆、麦秸、稻草、棉杆、玉米芯及其残渣、木屑、能源植物或者林业废弃物、废纸，纸板，建筑和拆迁木材废料和庭院废物。
5.如权利要求2所述的一种利用木质纤维素原料生产朽1檬酸的方法,其特征在于，在所述的步骤(2)中，所述的固态生物脱毒的具体过程为:将静置培养3天的脱毒菌种Amorphotheca resinae ZNl (保藏编号CGMCC7452)斜面接入盛有200g稀酸预处理后且pH调整至6.0的玉米秸杆的生物脱毒反应器中，维持25°C、60%的湿度进行脱毒共培养3天；将上述脱毒共培养的200g秸杆接入盛有2000g稀酸预处理后且pH调整至4.8-5.5的玉米秸杆的生物脱毒反应器中，维持25°C、60%的湿度进行脱毒共培养10-12天；脱毒后将物料保存于_20°C冰箱中待用。
6.如权利要求2所述的一种利用木质纤维素原料生产朽1檬酸的方法,其特征在于，在所述的步骤(3)中，所述朽1檬酸的生产菌株为黑曲霉Aspergillus niger M288,黑曲霉Aspergillus niger M288购自上海市工业微生物研究所菌种保藏中心；但所涉及的菌种不限于所提供的菌种，还包括能够发酵生产柠檬酸的其他菌种，如黑曲霉Asperillus NigerM203、黑曲霉Aspergillus niger M228等，以及通过诱变、基因工程等操作改造的上述菌株或其他菌株。
7.如权利要求2所述的一种利用木质纤维素原料生产柠檬酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(4)中，木质纤维素酶解液制备或同步糖化与发酵生产柠檬酸时使用的纤维素酶中包含纤维素内切酶、纤维素外切酶、3-葡萄糖苷酶等主要酶组分，也包括复配有半纤维素酶、果胶酶、漆酶等附加酶组分的纤维素酶。
8.如权利要求2所述的一种利用木质纤维素原料生产柠檬酸的方法，其特征在于，在所述的步骤(4)中，所获得柠檬酸包括柠檬酸及其盐的形式，如柠檬酸钠、柠檬酸钾等。
【专利摘要】本发明涉及一种利用木质纤维素原料生产柠檬酸的方法，一种方式是液体培养黑曲霉Aspergillus niger M288，然后接种于木质纤维素原料的酶解液中，黑曲霉把酶解液中的葡萄糖转化为柠檬酸；另一种方式是先液体培养黑曲霉Aspergillus niger M288，再接种于含有一定固体含量的木质纤维素的发酵罐中，同时加入纤维素酶，纤维素酶把纤维素酶解为葡萄糖的同时，由黑曲霉将生成的糖同步发酵为柠檬酸。本发明以木质纤维素为原料生产柠檬酸，过程简单，成本低廉，特别是以木质纤维素为原料，具有广阔的应用和发展前景。
【IPC分类】C12P7-48, C12R1-685
【公开号】CN104805136
【申请号】CN201410035236
【发明人】鲍杰, 孟佼, 张建
【申请人】华东理工大学
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2014年1月24日