一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种提取纯化虫草素的方法，属于药用真菌有效成分提取分离领域。
【背景技术】
[0002]蛹虫草又名北冬虫夏草，蛹草菌，蛹草等，中医认为，虫草是唯一一种能平衡、调节阴阳的中药，其入肺肾二经，既能补肺阴又能补肾阳，主治肾虚，阳瘘遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等。虫草素是蛹虫草的主要活性成分之一，现代药理学研宄表明，虫草素具有抑制微生物生长、抗肿瘤、调节免疫力、抑菌、抗炎、抗衰老、改善新陈代谢、清除自由基等多种药理作用，有良好的临床应用前景。目前，国外有报道虫草素能够人工合成，但目前处于探索阶段，合成的过程复杂且产量极低。由于天然虫草资源稀缺，价格昂贵，虫草素含量甚微，所以天然虫草很难成为提取虫草素的主要原料。
[0003]现有从人工养殖蛹虫草子实体中获得虫草素的方法，但子实体的获得困难、耗时、成本高，并且除虫草素外的其他成分含量也很高，如虫草酸、虫草多糖和超氧化歧化酶等，如果仅提取虫草素，其他高含量的成分会导致提取过程复杂且困难，因而从经济的角度考虑，从子实体中仅提取虫草素价格昂贵，成本较高。蛹虫草菌皮是蛹虫草子实体的副产品，生产中常常当做废品处理，但蛹虫草菌皮也含有虫草素成分，并且其他成分的含量较低，其作为副产品来源丰富，价格低廉，利用其提取虫草素可以变废为宝，不仅大大的降低成本，同时也避免了资源的浪费。
[0004]从蛹虫草菌皮中纯化虫草素的方法，现有的方法是利用大孔强酸离子交换树脂来对虫草素进行纯化，但大孔强酸离子交换树脂使用时需要用酸碱反复浸洗数次，步骤繁琐，复杂、溶剂用量大，残留多，且大量提取时成本也比较高。另有方法利用硅胶柱层析从蛹虫草子实体中分离纯化虫草素，但其溶剂一般为三相或四相，如乙酸乙酯、乙醇和水的组合或水、乙酸乙酯、异丙醇和氯仿的组合，由于溶剂种类多，进而导致实验过程复杂、难以控制，并且三相或四相溶剂因无法根据密度调节其体积比例，进而溶剂不能回收再利用，造成溶剂的大量浪费，大大增加了实验的成本。
【发明内容】
[0005]本发明是针对现有技术的不足，提供一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法，该方法原料来源丰富，廉价易得，并具有工艺简单、易操作，有机溶剂可循环利用且用量少、成本低、产品纯度高的优点。
[0006]本发明采用的技术方案为:
[0007]一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法，
[0008]步骤如下:
[0009](I)取蛹虫草菌皮为原料，用粉碎机粉碎，过筛，置于真空干燥箱中干燥，备用；
[0010](2)在干燥好的蛹虫草菌皮粉末中加入甲醇和水的混合溶液，浸泡；
[0011](3)将浸泡后的混悬液置于回流装置中，加热回流，过滤，得到提取液；
[0012](4)提取液用石油醚萃取，弃去石油醚层；
[0013](5)下层剩余液通过减压浓缩进行回收，得到蛹虫草菌皮提取液的浸膏；
[0014](6)用甲醇将浸膏溶解后，经硅胶层析柱洗脱，流动相为氯仿和甲醇，回收洗脱液，TLC跟踪检测；
[0015](7)得到的有虫草素的洗脱液减压浓缩后，溶解，结晶，得虫草素。
[0016]所述的一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法，其特征在于，所述步骤(I)中蛹虫草菌皮粉末过20-80目筛，置于真空干燥箱中的温度为30-60°C，干燥时间为2-6h。
[0017]所述的一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法，其特征在于，步骤(2)中在干燥好的蛹虫草菌皮粉末中加入8-14倍量的甲醇和水的混合溶液，浸泡8-20h。
[0018]所述的一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法，其特征在于，所述步骤(3)将浸泡后的混悬液置于回流装置中，加热回流3次，每次回流时间l_3h。
[0019]所述的一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法，其特征在于，所述步骤(4)中提取液用1-3倍量的石油醚萃取1-3次。
[0020]所述的一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法，其特征在于，所述步骤(6)中硅胶柱洗脱时的流动相为氯仿和甲醇，且比例为8:1-14:1。
[0021]所述的一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法，所述步骤(7)中得到的有虫草素的洗脱液减压浓缩后，用适量甲醇或乙醇加热使其溶解，于4°C低温下结晶，得虫草素。
[0022]本发明具有以下有益效果:
[0023](I)原料蛹虫草菌皮来源丰富，价格低廉，可代替蛹虫草子实体，克服蛹虫草子实体获取困难，成本较高，所以不利于大量的生产的缺陷。
[0024](2)采用甲醇和水热回流提取，设备简单，操作容易，节省时间，成本低廉。
[0025](3)分离选择硅胶层析柱富集虫草素，操作简单，分离效果好，得到虫草素纯度高。
[0026](4)洗脱溶剂为氯仿和甲醇，溶剂可以回收循环使用，避免了多种溶剂配比复杂而不能回收使用的情况，节省大量的溶剂。
【附图说明】
[0027]图1所示的是虫草素标准品的紫外扫描图。
[0028]图2所示的是虫草素标准品的高效液相色谱图。
[0029]图3所示的是虫草素标准品色谱峰的纯度结果。
[0030]图4所示的是本发明实施例1得到的虫草素的高效液相色谱图。
[0031]图5所示的是本发明实施例1得到的虫草素色谱峰的纯度结果。
[0032]图6所示的是本发明实施例1得到的虫草素红外谱图。
[0033]图7所示的是对比例I的TLC图谱。
【具体实施方式】
[0034]一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法，步骤如下:
[0035](I)取蛹虫草菌皮为原料，用粉碎机粉碎，蛹虫草菌皮粉末过20-80目筛，置于真空干燥箱中的温度为30-60°C，干燥时间为2-6h，备用；
[0036](2)在干燥好的蛹虫草菌皮粉末中加入8-14倍量的甲醇和水的混合溶液，浸泡8-20h ；
[0037](3)将浸泡后的混悬液置于回流装置中，加热回流3次，每次回流时间l_3h，过滤，得到提取液；
[0038](4)提取液用1_3倍量的石油醚萃取1-3次，弃去石油醚层；
[0039](5)下层剩余液通过减压浓缩进行回收，得到蛹虫草菌皮提取液的浸膏；
[0040](6)用甲醇将浸膏溶解后，经硅胶层析柱洗脱，流动相为氯仿和甲醇，且比例为8:1-14:1,回收洗脱液，TLC跟踪检测；
[0041](7)得到的有虫草素的洗脱液减压浓缩后，用适量甲醇或乙醇加热使其溶解，于4°C低温下结晶，得虫草素。
[0042]实施例1 一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法
[0043](一)、步骤如下:
[0044](I)以蛹虫草菌皮为原料，用粉碎机粉碎，过60目筛，置于40°C的真空干燥箱中干燥4h，取1kg，备用；
[0045](2)在干燥好的蛹虫草菌皮粉末中加入10倍量的70%甲醇溶液，浸泡12h ；
[0046](3)将浸泡后的混悬液置于回流装置中，加热回流3次，第一次回流3h，用纱布过滤后，将剩余残渣再加入提取溶剂，继续加热回流2次，每次lh，合并滤液，得到提取液；
[0047](4)提取液用2倍量的石油醚萃取2次，弃去石油醚层；
[0048](5)下层剩余液通过减压浓缩进行回收，得到蛹虫草菌皮提取液的浸膏；
[0049](6)用甲醇将浸膏溶解后，经硅胶层析柱洗脱，流动相为氯仿和甲醇，体积比为10:1，回收洗脱液，TLC跟踪检测，直到洗脱液中无虫草素为止；
[0050](7)得到的有虫草素的洗脱液减压浓缩后，用适量甲醇加热使其溶解，4°C低温结晶，得虫草素。
[0051 ] (二)、高效液相法检测虫草素纯度
[0052](I)试剂和材料
[0053]甲醇(色谱纯)，纯净水，虫草素标准品。
[0054](2)色谱条件:Diamonsil 反相 C18柱(250 X 4.6_，5 μ m) ;Agilentl200 高效液相；流动相:甲醇:水=15:85 (v/v);流速为lml/min ;检测波长260nm ;进样量10 μ L。
[0055](3)最大吸收波长的测定
[0056]称取60°C干燥至恒重的虫草素标准品适量，用甲醇溶解，稀释，配制成50.0 μ g.ml/1的溶液，按紫外分光光度法(《中国药典》2010年版一部)在200_400nm波长范围内进行扫描。
[0057]将虫草素标准品溶于水、甲醇和pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中，并进行紫外扫描。虫草素标准品紫外扫描结果见扫描图1，由紫外扫描结果可知虫草素在259nm波长处有最大吸收。
[0058](4)虫草素标准品和实施例1中得到的虫草素样品的测定
[0059]经测量实施例1的方法得到虫草素857mg。
[0060]取少量虫草素标准品及实施例1的方法得到虫草素样品加入适量的甲醇超声使其溶解，使用孔径为0.22 μ m的微孔滤头进行过滤，待测。虫草素标准品高效液相色谱图如图2，色谱峰的纯度结果如图3，由图3可知虫草素标准品的纯度为97.44%。
[0061]按实施例1方法得到的虫草素样品，高效液相色谱图如图4，色谱峰的纯度结果如图5，由图5可知，按实施例1的方法得到虫草素纯度为97.42%。说明采用实施例1的方法得到了高纯度的虫草素。
[0062](5)自制样品的红外图谱
[0063]取本实施案例得到的虫草素样品，测定红外图谱，结果见图6。红外图谱数据(cm-1):3326.0,3141.8,2923.8,1672.2,1608.5,1575.7,1479.3,1340.4,1299.9,1209.2、1174.6,958.5,831.3,727.1，与虫草素标准谱图数据基本一致。进一步证明本发明实施例1的方法得到了虫草素。
[0064]实施例2 —种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的