体前体物海藻酸钠-EpCAM。
[0018](2)用薄膜分散法制备免疫海藻酸钠磁性脂质体。将卵磷脂10.0mg、胆固醇6.0mg和油溶性磁性纳米颗粒3.0mg混合溶于10.0mL油相氯仿中，孵育30分钟，放入茄形瓶中，旋转蒸发成脂质膜；
(3)将形成的脂质膜与含有2.0mg海藻酸钠和2.0mg海藻酸钠-EpCAM的水溶液混合水化，并超声，即可得免疫抗-EpCAM单克隆抗体海藻酸钠免疫磁珠。
[0019]实施例2 —种海藻酸钠免疫磁珠及其制备方法
所述海藻酸钠免疫磁珠为核壳型结构，内核为磁性材料Fe3O4,中间层为脂质体和海藻酸钠的混合材料，最外层为包被在中间层上的抗体。
[0020]海藻酸钠免疫磁珠各层的组成比例如下:
海藻酸钠:质量含量为15.0% ；
脂质体:质量含量为35.0% ；
磁性材料:质量含量为35.0% ；
抗体:质量含量为15.0% ；
所述磁珠的粒径为500nm。
[0021]所述海藻酸钠免疫磁珠的成分包括海藻酸钠、卵磷脂、胆固醇和磁性纳米颗粒；其中，海藻酸钠的质量含量为15.0%，卵磷脂的质量含量为15.0%，胆固醇的质量含量为15.0%，磁性纳米颗粒为15.0%。
[0022]本发明海藻酸钠免疫磁珠的制备方法，包括以下步骤:
(I)使用海藻酸钠与抗体反应制备抗体前体物海藻酸钠-抗体。
[0023](2)用薄膜分散法制备海藻酸钠磁性脂质体:具体为将卵磷脂、胆固醇和油溶性磁性纳米颗粒混合溶于油相氯仿中，孵育40分钟，放入茄形瓶中，旋转蒸发成脂质膜；
(3)将形成的脂质膜与含有海藻酸钠和抗体前体物海藻酸钠-抗体的水溶液混合水化，并超声，即可得海藻酸钠免疫磁珠。
[0024]上述步骤(I)中将含有海藻酸钠的水溶液与单克隆抗体混合，加入缩合剂反应30小时，透析除去未反应的缩合剂；所述海藻酸钠与缩合剂的质量比为1:5 ;所述的海藻酸钠与抗体混合的质量比为10:1 ;所述缩合剂为N，N’ -羰基二咪唑。
[0025]试验例I本发明抗-EpCAM海藻酸钠免疫磁珠的应用
取浓度为2.0mg/mL的抗-EpCAM海藻酸钠免疫磁珠40微升，与3例乳腺癌患者穿刺液300微升混合，加入1.0mLPBS (0.lmol/L)混合振荡孵育30分钟；孵育后磁分离，并水洗3次，收集穿刺液中的乳腺癌细胞；最后，经过4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI )、ant1-细胞角蛋白(CK19) -FITC、ant1-白细胞共同抗原(⑶45) -PE染色将捕获的细胞进行免疫荧光染色，并计数分析，分析结果显示3例乳腺癌患者300微升穿刺液中分别含乳腺癌细胞15个，20个，5个。
[0026]阳性判断值或者参考区间:细胞核DAPI染色(蓝色荧光)阳性、ant1-CK19_FITC染色(绿色荧光)阳性、ant1-⑶45-PE (红色荧光)阴性。细胞大小>5μπι。
【主权项】
1.一种海藻酸钠免疫磁珠，其特征在于，所述海藻酸钠免疫磁珠为核壳型结构，内核为磁性材料Fe3O4，中间层为脂质体和海藻酸钠的混合材料，最外层为包被在中间层上的抗体。2.根据权利要求1所述的海藻酸钠免疫磁珠，其特征在于，所述海藻酸钠免疫磁珠各层的组成比例如下: 海藻酸钠:质量含量为0.0%-50.0% ； 脂质体:质量含量为0.0%-50.0% ； 磁性材料:质量含量为0.0%-50.0% ； 抗体:质量含量为0.0%-30.0%。3.根据权利要求1所述的海藻酸钠免疫磁珠，其特征在于，所述海藻酸钠免疫磁珠的粒径为 10nm-10000nm。4.根据权利要求1所述的海藻酸钠免疫磁珠，其特征在于，所述海藻酸钠免疫磁珠中的抗体为单克隆抗体。5.根据权利要求1所述的海藻酸钠免疫磁珠，其特征在于，所述海藻酸钠免疫磁珠的成分包括海藻酸钠、卵磷脂、胆固醇和磁性纳米颗粒；其中，海藻酸钠的质量含量为10.0%-60.0%，卵磷脂的质量含量为10.0%-30.0%，胆固醇的质量含量为5.0%-30.0%，磁性纳米颗粒为5.0%-30.0%。6.制备如权利要求1-5任一项所述的海藻酸钠免疫磁珠的方法，步骤如下: (1)使用海藻酸钠与抗体反应制备抗体前体物海藻酸钠-抗体； (2)用薄膜分散法制备海藻酸钠磁性脂质体:具体为将卵磷脂、胆固醇和油溶性磁性纳米颗粒混合溶于油相氯仿中，孵育20-60分钟，放入茄形瓶中，旋转蒸发成脂质膜； (3)将形成的脂质膜与含有海藻酸钠和抗体前体物海藻酸钠-抗体的水溶液混合水化，并超声，即可得海藻酸钠免疫磁珠。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中将含有海藻酸钠的水溶液与单克隆抗体混合，加入缩合剂反应0.5至48小时，透析除去未反应的缩合剂；所述海藻酸钠与缩合剂的质量比为1-5:1-20 ;所述的海藻酸钠与抗体混合的质量比为100:l-20o8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中缩合剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐、N，N’-羰基二咪唑、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶、N-羟基琥珀酰亚胺中的一种或两种。9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中将含有海藻酸钠的水溶液与单克隆抗体混合，加入缩合剂反应24小时，透析除去未反应的缩合剂；所述海藻酸钠与缩合剂的质量比为I '2 ;所述的海藻酸钠与抗体混合的质量比为5:1。10.如权利要求1-5任一项所述的海藻酸钠免疫磁珠在细胞分离、固定化酶、靶向药物和免疫检测等生物学领域的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种海藻酸钠免疫磁珠及其制备方法和应用，免疫磁珠为核壳型结构，内核为磁性材料Fe3O4，中间层为脂质体和海藻酸钠的混合材料，最外层为包被在中间层上的抗体。免疫磁珠各层的组成比例为：海藻酸钠：质量含量为0.0%-50.0%；脂质体：质量含量为0.0%-50.0%；磁性材料：质量含量为0.0%-50.0%；抗体：质量含量为0.0%-30.0%。本发明海藻酸钠免疫磁珠具有很好的生物相容性，通过与生物活性物质中的配基偶联，能够识别并结合相应的抗原、抗体或核酸等，在外加磁场中分离富集迅速，可用于生物材料检测和分离纯化，在细胞分离、固定化酶、靶向药物和免疫检测等生物学领域有着广泛的应用前景。
【IPC分类】C12N5/09, C07K17/10, C07K17/14, A61K47/36, G01N33/577, C12N11/02, A61K47/04
【公开号】CN104945510
【申请号】CN201510322129
【发明人】穆海东, 汪宁梅, 梁晓飞
【申请人】上海裕隆医学检验所股份有限公司
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年6月12日