径获得；所用方法均为本领域技术人员公知的常规方法。
[0064] 实施例1
[0065] 天然环肽的分离纯化和结构鉴定
[0066] 样品的提取和环肽的分离采集新鲜的紫花地丁，用榨汁机打碎，然后用95%乙醇 浸提3次，每次24h，合并提取液，减压浓缩回收乙醇；提取物用水重悬，依次用石油醚、乙酸 乙酯、正丁醇萃取；含有环肽的正丁醇部分减压浓缩后再用水重悬，样品经S印hadex LH-20 柱层析采用10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%甲醇水梯度洗脱。利用质谱跟踪确定含有环肽 的洗脱部分为30%的馏分。再次减压浓缩后，利用Agilentl200系统和GRACE VYDAC蛋白 多肽半制备C18柱（250X 10mm，5 μ m，300 A )对样品进行分离纯化，其色谱条件：流动相 A :0. 5%的三氟乙酸（TFA)-水溶液；流动相B :90%的乙腈-水溶液；紫外检测：220nm ;进样 量：100 μ 1/次；流速：2ml · min-1 ;梯度洗脱。收集洗脱峰，再用MALDI T0F/MS进行分析确 认环肽分子。
[0067] 半制备色谱柱液相色谱（RP-HPLC)洗脱条件
[0068]
[0069] 收集获得的含有环肽分子的洗脱峰，再减压浓缩并冷干后，再取少量样品利用 Agilentl200 系统和 GRACE VYDAC 蛋白多肽分析型 C18 柱（250X4. 6mm，5μπι，300 A)进行 梯度洗脱；紫外检测：220nm ;进样量：100 μ 1/次；流速：1ml · rnirf1 ;进行样品的纯度分析； 利用MALDI T0F/T0F MS进行检测分析，分离获得目的环肽冷藏保存。经过质谱分析获得了 m/z3200. 7161 Da的环肽分子（图2和3)。
[0070] 分析型色谱柱液相色谱（RP-HPLC)洗脱条件
[0071]
[0072] 环肽分子的还原与烷基化保护对环肽分子进行结构解析，首先进行还原与烷基 化保护反应。取50 μ g的环肽样品溶于100 μ IlOOmmol · Γ1碳酸氢铵缓冲液（pH8. 0)中， 加入等体积含有摩尔比30倍过量DTT (约0. 46mg)的碳酸氢铵缓冲液后于37°C反应2h ;再 加入等体积含有还原巯基摩尔比2. 5倍过量碘乙酰胺（约I. 38mg)的碳酸氢铵缓冲液，室 温下避光反应12h。还原和烷基化后的样品直接注入RP-HPLC C18分析柱，进行梯度洗脱 (见上述分析柱洗脱色谱条件)，收集样品峰，取0. 5 μ 1样品点样于MALDI样品板上，再与等 体积的α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA)混匀，进行MALDI T0F/T0F MS质谱分析。
[0073] 赖氨酸内肽酶（Endo Lys-C)、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的酶解将还原和烷基化 的环肽样品通过RP-HPLC系统C18分析柱，进行梯度洗脱纯化，冷干。将环肽分子溶解在 100μ IlOOmmol .T1Tris-HCl (ρΗ7· 5)中，加入蛋白酶 Lys-C 或胰蛋白酶，37°C 下酶解 12h ; 或者将环肽分子溶解在1〇〇μ IlOOmM Tris-HCl，IOmM CaCl2，pH7. 8用胰凝乳蛋白酶，37°C 下酶解12h。将酶解后的样品直接注入RP-HPLC C18分析柱，进行梯度洗脱纯化，纯化的样 品利用MALDI T0F/T0F MS进行质谱分析。
[0074] MALDI TOF MS/MS分析为了鉴定酶解的肽段氨基酸残基序列，利用 ABI4700MALDIT0F/T0F?系统采用正离子模式进行，利用50%乙腈/0. 1%TFA配置 8mg ^r1CHCA作为MALDI介质，质谱仪的扫描范围m/z500-4000,用于测定每个样品中肽段 的质荷比。首先采用反射手动模式测定分子离子质荷比，其激光强度设置在肽段分子离子 化的阈值强度，一级质谱激光总照射（laser shots)为800次；为了对肽段进行MS测序，激 光强度升高约10%，加速电压设置为lkV，激光总照射为2000次，每个肽段的撞击诱导解离 (CID)的质谱结果都按单电荷的反射模式记录，撞击室内气压分别设置为(无、中、高)3中工 作状态，若撞击室内没有气压时系统运行采用源后衰变（PSD)模式；其中母离子与二级质 谱的mass error范围分别为m/z±0. 05和m/z±0. 02。肽段氨基酸残基序列的解析利用 ABI公司DataExplore v3. 5系统采用质谱图上y离子或b离子人工解析，根据相邻离子的 分子量差求出氨基酸残基的分子量得到多肽的氨基酸残基序列。
[0075] 其中m/z3200Da的环肽分子经还原和烷基化后，经Endo Lys-C酶解后产生2个肽 段m/z569. 2589Da和m/z3019. 0217Da肽段，然后依据碎片离子峰分别解析出的氨基酸残 基序列分别为VCYR、NGSIPCGESCVFIPCITTVLG的肽段（图3和4)。利用Trypsin酶切产生 了 m/zl338. 8212Da和m/z2247. 8716Da的肽段，然后依据碎片离子峰分别解析出的部分氨 基酸残基序列分别为ITTVLGCS、ESCVFIPC (图5和6)。利用Chymorypsin酶切产生了 m/ zl454. 9119Da和m/zl233. 8733Da的肽段，然后依据碎片离子峰分别解析出的部分氨基酸 残基序列分别为KNGSIPCGESCVF、CSCSIKVCY (图7和8)。根据三组不同的酶解获得肽段进 行重叠拼接最终确定 SEQ ID NO: ICyclo (CGESCVFIPCITTVLGCSCSIKVCYKNGSIP)。
[0076] 实施例2
[0077] SEQ ID NO: 1耐热稳定性试验
[0078] (1).多肽SEQ ID NO: 1溶液：45 μ Ll μ g/ μ L的多肽加180 μ L过膜的无菌水，混 匀；
[0079] (2). Omin耐热反应试验样品：取出50 μ L步骤（1)中的混合液；
[0080] (3).不同耐热反应时间的试验样品：将步骤⑴中的混合液分装成50yL的三份 样品，放置于KKTC沸水浴中，分别约10min，20min，30min取出一份样品，立即放入冰上冷 却IOmin,而后离心；
[0081] (4).将样品⑵和（3)进利用色谱柱（YMC-Pack, 0DS-A，250X4. 6mm)进行 HPLC 分析（图9)，液相色谱洗脱条件如下：
[0082]
[0083] 注：A 相：0· 5%TFA B 相：90%AcN，0. 5%TFA ;检测波长：220nm
[0084] (5).结果：以Omin SEQ ID NO: 1多肽的峰面积为100%，计算X min相对于Omin 残留的峰面积，结果表明EQ ID NO: 1在100°C沸水浴中加热30min，多肽相对稳定，残留量 在80%以上（图10和下表）。说明环肽分子具有很高的耐热变性稳定性。
[0085]
[0086] 实施例3
[0087] SEQ ID NO: 1耐酶解稳定性试验
[0088] 1.溶液的配制
[0089] (1).多肽SEQ ID NO: 1 :1 μ g/μ L，用过膜的无菌水配制；
[0090] (2) ·膜蛋白酶（Trypsin)试验用 Buffer: IOOmM Tris-HCl, pH8. 0; Trypsin 酶： 0. 5 μ g/ μ L ；
[0091] (3) ·膜凝乳蛋白酶（Chymotrypsin)试验用 Buffer: IOOmM Tris-HCl, IOmM CaCl2, pH7. 8 ；Chymotrypsin SI ：0. 5 μ g/ μ L ；
[0092] (4).酶解终止液：10%TFA，用相应的反应buffer配制。
[0093] 2. SEQ ID NO: 1 耐 Trypsin 酶解试验
[0094] (1) ·多肽 SEQ ID NO: 1 溶液：25 μ Ll μ g/ μ L 的多肽加 95 μ L buffer，混匀；
[0095] (2) · Trypsin 酶解反应工作液：0· 35 μ L0. 5 μ g/ μ L 的多肽加 3· 15 μ L buffer，混 匀；
[0096] (3).将溶液⑴和⑵放置于37°C培养箱中5min ;
[0097] (4).Omin酶解试验样品：取出25yL步骤（1)中的混合液，并加入3. 75yL的 buffer ；
[0098] (5).不同酶解时间的试验样品：取84μ L步骤（1)中的混合液加入到步骤⑵中， 迅速混匀，分装成25 μ L的三份样品，放置于37°C培养箱中，分别约30min，60min，120min取 出一份样品，立即加入3. 75 μ L10%TFA迅速混匀，终止反应；
[0099] (6).将样品⑷和（5)进HPLC分析，如图11A.
[0100] 3. SEQ ID NO: 1 耐 Chymotrypsin 酶解试验
[0101] (1).多肽 SEQ ID NO: 1 溶液：25μ Llyg/μ L 的多肽加 97. 5μ L buffer，混匀；
[0102] (2). Chymotrypsin 酶解反应工作液：0· 175 μ L0. 5 μ g/μ L 的多肽加 L 575 μ L buffer,混匀；
[0103] (3).将溶液⑴和⑵放置于37°C培养箱中5min ;
[0104] (4).0min酶解试验样品：取出25yL步骤（1)中的混合液，并加入3.75yL的 buffer ；
[0105] (5).不同酶解反应时间的试验样品：取85. 75μ L步骤（1)中的混合液加入到 步骤（2)中，迅速混匀，分装成25 μ L的三份样品，放置于37°C培养箱中，分别约30min， 60min，120min取出一份样品，立即加入3. 75 μ L10%TFA迅速混匀，终止反应；
[0106] (6).将样品⑷和（5)进HPLC分析，如图IlB
[0107] 4. SEQ ID NO: 1耐酶解试验结果
[0108] 以Omin SEQ ID NO: 1多肽的峰面积为100%，计算X min相对于Omin残留的峰面 积，结果表明EQ ID NO: 1在Ih内对Trypsin酶和Chymotrypsin酶相对稳定，残留量在80% 以上，在2h内残留量在70%以上（图12和下表）。说明环肽分子具有很高的耐酶解稳定 性。
[0109]
[0110] 实施例4
[0111] 抗微生物活性分析
[0112] 米用 3 株 G-菌 Escherichia coli ATCC25922、Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 和 Klebsiel