la oxytoca ATCC49131，2 株 G+ 菌 Streptococcus gallolyticus ATCC49147 和 Enterococcus faecalis ATCC29212,1 株真菌 Candida albicans ATCC14053 为受试菌株，分别采用ATCC使用说明进行细胞培养，制备105Cells/100 μ I的受试菌悬液， 与不同浓度的环肽在37°C孵育2. 5h，然后稀释铺在相应的琼脂平板上，培养24h，菌落记 数，与对照相比，致死浓度为对应>99. 9%，同时以防御素 HNP-I为阳性对照，最小抑菌浓度 见表3。说明SEQ ID NO: 1具有抗G+、G_和真菌的生物活性。
[0113] 表 3 环肤的最小抑菌浓度（Minimal inhibitory concentration, MIC) ( μ M)
[0114]
[0115] 实施例5
[0116] 抗甲型流感病毒HlNl活性
[0117] 实验材料：
[0118] 1.受试药物：SEQ ID NO :1和达菲（阳性药对照)。
[0119] 2.细胞：MDCK细胞系。
[0120] 3.病毒：甲型 H1N1-CA7 尿囊液（A/California/7/09)。
[0121] 4.培养液：DMEM培养基、10%胎牛血清、2%双抗（Hyclone)。
[0122] 5.维持液：DMEM 培养基、2% 双抗（Hyclone)
[0123] 6.试剂：中性红（Sigma)。
[0124] 病毒滴定：
[0125] 甲型HlNl病毒10倍稀释至KT8接种于MDCK细胞96孔培养板，每孔200 μ L，每 浓度4个复孔，35°C、5%C02培养3天，观察细胞病变，用1%中性红染色，540nm测定OD值， 计算病毒半数感染量（TCID5tl)。
[0126] 抗病毒实验：
[0127] 受试药物用无血清DMEM培养基配制，从最大安全浓度起始，2倍稀释，加入长成单 层的MDCK细胞96孔培养板中，每浓度4个孔，其中1孔为药物对照孔，其余3孔每孔加入 loo μ Liootcid5ci病毒，药物对照孔加入loo μ L维持液。35°c、5%co2培养3天，观察细胞病 变。用1%中性红染色，540nm测定OD值。
[0128] 药物效果计算：
[0129] (1)病毒半数感染量（TCID5tl)的计算：
[0130]
[0131] A:大于50%细胞感染百分率，B :小于50%细胞感染百分率，C :log (稀释倍数)， D: log (小于50%细胞感染率所对应的病毒稀释度）
[0132] (2)病毒抑制百分率：
[0133]
[0134] (3)药物抑制病毒半数有效浓度（IC5tl)
[0135]
[0136] A:大于50%病毒抑制率，B:小于50%细胞病毒抑制率，C: log (稀释倍数)，D: log (小于50%病毒抑制率所对应的药物稀释度）
[0137] 药效评价指标：
[0138] 药效评价以药物抑制病毒的半数有效浓度（IC5tl)和病毒抑制率作为药物评价指 标；最大安全浓度的确定是以对细胞没有损伤的最高药物浓度为药物的起始安全浓度。
[0139] 实验结果：
[0140] LHlNl病毒滴定结果：
[0141] 按Reed-Meuench法计算甲型HlNl病毒的浓度为：1. 58X 106TCID5Q/ml，选择 IOOTCID5ci作为该药效研究的病毒感染剂量。
[0142] 2.药物对甲型HlNl病毒的抑制作用：
[0143] 表4药物抑制病毒的半数有效浓度（IC5tl)
[0144]
[0145] 结果：
[0146] 起始浓度为药物的最大无毒浓度，药物的病毒抑制率见图13,说明SEQ ID NO: 1对 甲型HlNl病毒有抑制作用。
[0147] 实施例6
[0148] 溶血毒性：取新鲜的人血红细胞1，OOOrpm离心去上清，用50mM磷酸钠缓冲液 (PBS) (ρΗ7· 4)漂洗3次，环肽SEQ ID NO: 1溶解在水中，然后用PBS缓冲液稀释，取20 μ 1 环肽样品加入到80μ 1重悬的红细胞（1%V/V)中，在37°C孵育lh，再1，OOOrpm离心6min， 取60 μ 1反应样品到U-型底的96孔板，在415nm测定吸收值，以l%Triton X-100的完全 溶血为阳性对照，以PBS缓冲液为阴性对照，以合成的蜂毒肽（melittin)为参照，计算环肽 的50%溶血活性（HD5tl)。环肽SEQ ID NO: 1的HD5tl为12. 8 μ M，而参照样品蜂毒肽的HD5tl为 1. 55μΜ (图 14)。
【主权项】
1. 一种环肽具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸残基序列 Cyclo (CGESCVFIPCITTVLGCSCSIKVCYKNGSIP)，其中第 1 位和第 17 位的 Cys、第 5 位和第 19位的Cys、第10位和第24位的Cys分别形成三对二硫键，并且其中一个或多个非Cys的 氨基酸残基可替换为相同性质的氨基酸残基。2. 权利要求1所述的环肽，其中1-10个非Cys的氨基酸残基可替换为相同性质的氨基 酸残基，选自以下的一种或多种： 第2位的Gly替换为Ala、lie; 第3位的Glu替换为Asp; 第4位的Ser替换为ThiN Gly和Arg， 第 6 位 Val 替换为 Phe、Thr、Ala、His、Leu、lie、Arg、Tyr， 第 7 位 Phe 替换为 Trp、Gly、Tyr、Leu、Thr、Lys、lie、Val、Arg、Glu、His、Met， 第 8 位 lie 替换为 Gly、Leu、Phe、Ala、Asn、Lys、Met、Pro、His、Val， 第 9 位 Pro 替换为 Thr、Lys、Ser、Asn、Gly、Trp、Arg、Glu、Phe、Val， 第 11 位 lie 替换为 Asn、Tyr、Leu、Thr、Phe、Val、Arg、Trp、His， 第 12 位 Thr 替换为 Ser、Val、Leu、Ala、Asn、Asp、Leu、Tyr， 第 13 位 Thr 替换为 Ser、Ala、Gly、Glu、His、Lys、Tyr、Val， 第 14 位 Val 替换为 Ala、Leu、lie、Pro、Thr、Glu、Lys， 第 15 位 Leu 替换为 Pro、lie、Val、Ala、Lys、Met、Phe、Asn、Gly、Gin、Glu、Gly、Ser、 Thr， 第 16 位 Gly 替换为 Asn、Tyr、Arg、Gin、Ser、Thr， 第 18 位 Ser 替换为 Thr、Gly、Ala、Lys、lie、Phe、Pro、Tyr、Val， 第 20 位 Ser 替换为 Thr、Lys、Asp、Arg、Asn、Glu、Gin、Val， 第 21 位 lie 替换为 Ser、Asn、Trp、Asp、Pro、Thr、Tyr、Lys、Arg、Ala、Glu、His、Gly、 Leu、Val， 第 22 位 Lys 替换为 Pro、Arg、Asn、Gly、Gin、Ser、Met、Phe、Glu、His、Leu， 第 23 位 Val 替换为 Leu、lie、Ser、Phe、Arg、Glu、Met， 第 25 位 Tyr 替换为 Thr、Lys、Met、Ser、Ala、Phe、Val、Arg、Gin、Leu， 第 26 位 Lys 替换为 Arg、Leu、His、Gly、Tyr、Phe、Trp， 第27位Asn替换为Asp， 第 28 位 Gly 替换为 Ser、Lys、Ala、Thr、Asp， 第 29 位 Ser 替换为 Thr、Val、Gly、Ala、Leu、Asn、Asp、Phe， 第 30 位 lie 替换为 Leu、Val、Ala、Phe、Thr、His、Pro、Arg、Asn、Asp、Gln， 第 31 位 Pro 替换为 Phe、Leu、Gly、Ser、Ala、Arg、Val、Asp、Asn、Gin。3. 权利要求2所述的环肽，其中第2位的Gly优选替换为Ala。4. 权利要求2所述的环肽，其中第4位的Ser优选替换为Thr。5. 权利要求2所述的环肽，其中第7位Phe优选替换为Trp或His，再优选替换为Trp。6. 权利要求2所述的环肽，其中第11位Ile优选替换为Leu、或Phe、或Val，再优选替 换为Val。7. 权利要求2所述的环肽，其中第13位Thr优选替换为Ser、或Ala、或Tyr、或Val，再 优选替换为Ala。8. 权利要求2所述的环肽，其中第14位优选Val替换为Ala、或Leu、或lie，再优选替 换为Leu。9. 权利要求2所述的环肽，其中第15位Leu替换为Pro、或lie、或Val，再优选替换为 Val。10. 权利要求2所述的环肽，其中第21位Ile替换为Asp、或Tyr，再优选替换为Asp。11. 一种药物组合物，包含前述权利要求中任一项所述的一种环肽或其药学上可接受 的盐以及一种药学上可接受的载体或赋形剂。12. 根据前述权利要求中任一项所述的环肽或药物组合物，具有抗病毒、细菌和真菌的 活性。13. 根据前述权利要求12,所述的病毒为甲型HlNl流感病毒。14. 根据前述权利要求12,所述的细菌为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。15. 根据前述权利要求12,所述的真菌选自白色念珠菌。16. 根据前述权利要求中任一项所述的环肽或药物组合物，可用于预防或治疗人或家 畜感染甲型流感病毒、细菌和真菌的疾病。17. 根据前述权利要求中任一项所述的环肽或药物组合物，可用于食品或化妆品的防 腐剂或添加剂。
【专利摘要】本发明涉及一种具有抗病毒、细菌和真菌活性的环肽，其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸残基序列Cyclo(CGESCVFIPCITTVLGCSCSIKVCYKNGSIP)，其中第1位和第17位的Cys、第5位和第19位的Cys、第10位和第24位的Cys分别形成三对二硫键，具有抗热变性和蛋白酶酶解的稳定性，其溶血毒性低，含有该环肽或其盐的药物组合物可用于预防或治疗人或者家畜感染甲型流感病毒、细菌和真菌等疾病的用途。
【IPC分类】A61K38/16, A61K8/64, A61P31/12, C07K14/415, A61P31/16, A61P31/04, A23L3/3544, A61P31/10
【公开号】CN104974234
【申请号】CN201410133526
【发明人】王伟, 刘忞之, 杨燕, 张书香, 唐亮, 王惠敏, 陈成娟, 程克棣, 孔建强
【申请人】中国医学科学院药物研究所
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2014年4月3日