L-氨基酸的制造方法_5

的酶例如可以探索各种生物来获得。另外，也可以通过在原有的酶中导入突变来获得 高活性的酶。比活性的增强可以单独使用，也可以与如上所述的使基因的表达增强的方法 任意地组合使用。
[0247] 磷酸盐转运蛋白的活性例如也可以通过使编码具有"特定的突变"的磷酸盐转运 蛋白的磷酸盐转运蛋白基因保持在宿主中来增大。在本发明中，也将具有该"特定的突变" 的磷酸盐转运蛋白称为突变型磷酸盐转运蛋白，将编码其的基因称为突变型磷酸盐转运蛋 白基因。另外，在本发明中，也将不具有该"特定的突变"的磷酸盐转运蛋白称为野生型磷 酸盐转运蛋白，将编码其的基因称为野生型磷酸盐转运蛋白基因。具有该"特定的突变"的 突变型磷酸盐转运蛋白与野生型磷酸盐转运蛋白相比，可以具有较高的比活性。
[0248] 作为野生型磷酸盐转运蛋白，可以举出不具有"特定的突变"的PitA蛋白质（野 生型PitA蛋白质）。作为突变型磷酸盐转运蛋白，可以举出具有"特定的突变"的PitA蛋 白质（突变型PitA蛋白质）。也将编码野生型PitA蛋白质的基因称为野生型pitA基因， 将编码突变型PitA蛋白质的基因称为突变型pitA基因。作为野生型PitA蛋白质，可以举 出上述例示的各种PitA蛋白质及其保守变体即不具有"特定的突变"的蛋白质。即，突变 型磷酸盐转运蛋白除具有"特定的突变"以外，例如可以与选自上述例示的各种PitA蛋白 质及其保守变体中的任一蛋白质相同。
[0249] 具体而言，例如突变型磷酸盐转运蛋白可以为除具有"特定的突变"以外，具有序 列号2、4、6或26所示的氨基酸序列的蛋白质。另外，具体而言，例如突变型磷酸盐转运蛋 白可以为除具有"特定的突变"以外，具有在序列号2、4、6或26所示的氨基酸序列中含有 1个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列的蛋白质。另外，具体而言，例 如突变型磷酸盐转运蛋白可以为除具有"特定的突变"以外，具有相对于序列号2、4、6或26 所示的氨基酸序列具有80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、更优选97%以上、特别 优选99%以上的同源性的氨基酸序列的蛋白质。另外，在本说明书中，"同源性"意指"同一 性"。
[0250] 另外，换言之，突变型磷酸盐转运蛋白可以为在上述例示的各种PitA蛋白质中具 有"特定的突变"，且在该"特定的突变"以外的位置还含有保守突变的变体。
[0251] 具体而言，例如突变型磷酸盐转运蛋白可以为在序列号2、4、6或26所示的氨基酸 序列中具有"特定的突变"，且具有在该"特定的突变"以外的位置还含有1个或者多个氨基 酸的取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列的蛋白质。
[0252] 特别地，"一个或多个"的数字优选是1至20,更优选1至10,仍更优选1至5,特 别优选1至3。一个或多个氨基酸残基的前述取代、缺失、插入或添加是维持蛋白质的正常 功能的保守突变。保守突变的典型例子是保守取代。保守取代是如下的取代，其中若取代 位点是芳香族氨基酸，则取代在Phe、Trp、和Tyr间互相发生；若它是疏水性氨基酸，则取代 在Leu、lie、和Val间互相发生；若它是极性氨基酸，则取代在Gin和Asn间互相发生；若它 是碱性氨基酸，则取代在Ly S、Arg、和His间互相发生；若它是酸性氨基酸，则取代在Asp和 Glu间互相发生；并且如它是具有羟基基团的氨基酸，则取代在Ser和Thr间互相发生。视 为保守取代的取代的例子特别包括用Ser或Thr取代Ala，用Gln、His、或Lys取代Arg，用 Glu、Gin、Lys、His、或 Asp 取代 Asn，用 Asn、Glu、或 Gin 取代 Asp，用 Ser 或 Ala 取代 Cys， 用 Asn、Glu、Lys、His、Asp、或 Arg 取代 Gln，用 Gly、Asn、Gin、Lys、或 Asp 取代 Glu，用 Pro 取代 Gly，用△811、1^8、6111、厶找、或了5^取代把8，用1^11、]^1：、'\%1、或？116取代116，用116、 Met、Val、或 Phe 取代 Leu，用 Asn、Glu、Gin、His、或 Arg 取代 Lys，用 lie、Leu、Val、或 Phe 取代 Met，用 Trp、Tyr、Met、lie、或 Leu 取代 Phe，用 Thr 或 Ala 取代 Ser，用 Ser 或 Ala 取代 Thr，用 Phe 或 Tyr 取代 Trp，用 His、Phe、或 Trp 取代 Tyr，和用 Met、lie、或 Leu 取代 Val。 此外，如上文提及的氨基酸残基的此类取代、缺失、插入、添加、倒位等包括因个体差异、或 基因来源的生物的种类差异所致的天然存在的突变（突变体或变体）。
[0253] 作为"特定的突变"，例如可以举出相当于序列号6的246位的苯丙氨酸残基的氨 基酸残基被取代为苯丙氨酸以外的氨基酸残基的突变。取代后的氨基酸残基只要为苯丙 氨酸以外的氨基酸且为天然型氨基酸，则任一氨基酸均可，选自赖氨酸、谷氨酸、酪氨酸、缬 氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨 酸、甘氨酸、丙氨酸、组氨酸，但特别优选丝氨酸。
[0254] 所谓氨基酸序列中的"X位"是指从相同氨基酸序列的N末端数第X个位置，N末 端的氨基酸残基为1位的氨基酸残基。需要说明的是，氨基酸残基的位置显示相对位置，有 时其绝对位置因氨基酸的缺失、插入、添加等而颠倒。即，所谓"相当于序列号6的246位的 苯丙氨酸残基的氨基酸残基"是指在序列号6中比246位更靠N末端侧的1个氨基酸残基 缺失的情况下，从N末端数第245个氨基酸残基。另外，所谓"相当于序列号6的246位的 苯丙氨酸残基的氨基酸残基"是指在序列号6中比246位更靠N末端侧插入有1个氨基酸 残基的情况下，从N末端数第247个氨基酸残基。
[0255] 在任意的氨基酸序列中，任一氨基酸残基是否为"相当于序列号6的246位的苯 丙氨酸残基的氨基酸残基"可以用该任意的氨基酸序列和序列号6的氨基酸序列进行对 准来确定。对准例如可以利用公知的基因分析软件进行。作为具体的软件，可以举出日立 Solutions制的DNASIS及Genetyx制的GENETYX等（ElizabethC.Tyleretal.，Computers andBiomedicalResearch, 24(1), 72-96, 1991；BartonGJetal. ,Journalofmolecular biology, 198(2)，327-37. 1987)。
[0256] 需要说明的是，在本发明中，在野生型磷酸盐转运蛋白具有序列号6所示的氨基 酸序列以外的氨基酸序列的情况下，"相当于序列号6的246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残 基"有时可以不是苯丙氨酸残基。即，例如对"相当于序列号6的246位的苯丙氨酸残基的 氨基酸残基被丝氨酸残基取代的突变"而言，并不限于在野生型酸性磷酸盐转运蛋白中相 当于序列号6所示的氨基酸序列中的246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基为苯丙氨酸残基 的情况下将该苯丙氨酸残基取代为丝氨酸残基的突变，也包含在野生型酸性磷酸盐转运蛋 白中相当于序列号6所示的氨基酸序列中的246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基为苯丙氨 酸残基及丝氨酸残基以外的任一氨基酸残基的情况下将该氨基酸残基取代为丝氨酸残基 的突变。
[0257] 突变型磷酸盐转运蛋白基因可通过以所编码的磷酸盐转运蛋白具有"特定的突 变"的方式修饰野生型磷酸盐转运蛋白基因来获得。野生型磷酸盐转运蛋白基因可以为源 自导入突变型磷酸盐转运蛋白基因的宿主的基因，也可以为源自异种的基因。DNA的修饰 可以通过公知的方法进行。具体而言，例如，作为在DNA的目标部位导入目标突变的部位 特异突变法，可以举出：使用PCR的方法（Higuchi,R.，61，inPCRtechnology,Erlich,H. A.Eds.，Stocktonpress(1989) ;Carter，P.，Meth.inEnzymol. ,154,382(1987))及使用 菌体的方法（Kramer,W.andFrits,H.J.，Meth.inEnzymol.，154, 350 (1987) ;Kunkel，T. A.etal.，Meth.inEnzymol. ,154, 367 (1987))。另外，突变型磷酸盐转运蛋白基因也可通 过化学合成来获得。
[0258] 可以通过将突变型磷酸盐转运蛋白基因导入到棒状杆菌型细菌中来使突变型磷 酸盐转运蛋白基因保持在棒状杆菌型细菌中。将突变型磷酸盐转运蛋白基因导入到棒状杆 菌型细菌中的方法没有特别限制，可以使用现有已知的方法。例如可以与增加上述的基因 的拷贝数的方法同样地将突变型磷酸盐转运蛋白基因导入到棒状杆菌型细菌中。另外，也 可以通过自然突变及突变原处理以所编码的磷酸盐转运蛋白具有"特定的突变"的方式修 饰棒状杆菌型细菌具有的野生型磷酸盐转运蛋白基因。在本发明的细菌保持突变型磷酸盐 转运蛋白基因的情况下，本发明的细菌可以具有野生型磷酸盐转运蛋白基因，也可以不具 有。本发明的细菌也可以具有1种以上的拷贝的突变型磷酸盐转运蛋白基因。
[0259] 转化的方法没有特别限定，可以使用现有已知的方法。例如可以使用如关于大肠 杆菌K-12所报告那样的用氯化钙处理受体菌细胞而增加DNA的透过性的方法（Mandel，M. andHiga，A.，J.Mol.Biol. 1970, 53, 159-162)、及如关于枯草芽孢杆菌所报告那样的由增 殖阶段的细胞制备感应细胞而导入DNA的方法（〇1111〇311，(111.，￥;[18011，6.4.311(1￥0111^，卩. E..，1997.Gene1:153-167)。或者，也可应用如关于枯草芽孢杆菌、放线菌类及酵母 已知那样的使DNA受体菌的细胞成为容易摄入重组DNA的原生质体或原生质球的状 态将重组DNA导入到DNA受体菌中的方法（Chang,S.andChoen,S.N.，1979.Mol.Gen-Genet. 168:111-115 ;Bibb，M.J. ，Ward,J.M.andHopwood， 0?A. 1978.Nature274:398-400 ; Hinnen，A.，Hicks,J.B.andFink,G.R. 1978.Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1929-1933)。进 而，可以利用关于棒状杆菌型细菌所报告的电脉冲法（日本特开平2-207791)。
[0260] 蛋白质的活性增大可通过测定相同蛋白质的活性来确认。磷酸盐转运蛋白活性例 如可通过利用公知的方法测定无机磷酸的摄入来测定（R.M.Harrisetal.，JournalofBa cteriology，Sept. 2001，p5008_5014)〇
[0261] 蛋白质的活性增大也可通过确认编码相同蛋白质的基因的表达上升来确认。基因 的表达上升可通过确认相同基因的转录量上升或通过确认由相同基因表达的蛋白质的量 上升来确认。
[0262] 基因的转录量上升的确认可以通过将由相同基因所转录的mRNA的量与野生株或 亲株等非修饰株相比来进行。作为评价mRNA的量的方法，可以举出：印迹杂交、RT-PCR等 (Sambrook,J. ,etal. ,MolecularCloningALaboratoryManual/ThirdEdition,Cold springHarborLaboratoryPress,ColdspringHarbor(USA), 2001)DmRNA的量与非修饰 株相比例如可以上升至1. 5倍以上、2倍以上或3倍以上。
[0263] 蛋白质的量上升的确认可以使用抗体通过蛋白质印迹法来进行（Molecular cloning(ColdspringHarborLaboratoryPress,ColdspringHarbor(USA), 2001))〇 蛋 白质的量与非修饰株相比，例如可以上升至1. 5倍以上、2倍以上或3倍以上。
[0264] 增大上述的蛋白质的活性的方法除磷酸盐转运蛋白的活性增强以外，可用于任意 的蛋白质，例如L-氨基酸生物合成体系酶的活性增强及任意的基因，例如编码这些任意的 蛋白质的基因的表达增强。
[0265] 〈1_4>使蛋白质的活性降低的方法
[0266] 以下，对降低蛋白质的活性的方法进行说明。
[0267] 所谓"蛋白质的活性降低"是指相同蛋白质的每个细胞的活性与野生株或亲株等 非修饰株相比减少，包括活性完全消失的情况。所谓"蛋白质的活性降低"，具体而言是指与 非修饰株相比，相同蛋白质的每个细胞的分子数降低及/或相同蛋白质的每个分子功能降 低。即，称为"蛋白质的活性降低"时的"活性"不仅限于蛋白质的催化活性，也可以指编码 蛋白质的基因的转录量（mRNA量）或翻译量（蛋白质的量）。需要说明的是，"蛋白质的每 个细胞的分子数降低"中包含相同蛋白质完全不存在的情况。另外，"蛋白质的每个分子的 功能降低"中包含相同蛋白质的每个分子的功能完全消失的情况。蛋白质的活性只要与非 修饰株相比降低就没有特别限制，例如与非修饰株相比，可以降低至50%以下、20%以下、 10%以下、5%以下或0%。
[0268] 蛋白质的活性降低这样的修饰例如可通过使编码相同蛋白质的基因的表达降低 来实现。"基因的表达降低"中包含相同基因完全未表达的情况。另外，也将"基因的表达降 低"称为"基因的表达得到弱化"。基因的表达例如与非修饰株相比可以降低至50%以下、 20%以下、10%以下、5%以下或0%。
[0269] 基因的表达的降低例如可以为转录效率的降低导致的，也可以为翻译效率的降低 导致的，还可以为它们的组合导致的。基因的表达的降低例如可通过改变基因的启动子及 夏因-达尔加诺（SD)序列等表达调节序列来实现。在改变表达调节序列的情况下，表达调 节序列可优选改变1碱基以上，更优选2碱基以上，特别优选3碱基以上。另外，可以使表 达调节序列的一部分或全部缺失。另外，基因的表达的降低例如也可通过操作与表达调控 相关的因子来实现。作为与表达调控相关的因子，可以举出：与转录及翻译调控相关的低分 子（衍生物质、抑制物质等）、蛋白质（转录因子等）、核酸（siRNA等）等。
[0270] 另外，蛋白质的活性降低这样的修饰例如可通过破坏编码相同蛋白质的基因来实 现。基因的破坏例如可通过使染色体上的基因的编码区域的一部分或全部缺损来实现。进 而，包含染色体上的基因的前后的序列在内，也可以使基因整体缺失。只要可实现蛋白质的 活性的降低，则缺失的区域可以为N末端区域、内部区域、C末端区域等中的任一区域。通 常缺失的区域较长的一方能够可靠地使基因失活。另外，优选缺失的区域的前后的序列的 阅读框不一致。
[0271] 另外，基因的破坏例如可通过在染色体上的基因的编码区域中导入氨基酸取代 (错义突变）、导入终止密码子（无义突变）、或者导入添加或缺失1~2个碱基的移码突 变等来实现（JournalofBiologicalChemistry272:8611_8617(1997)Proceedingsof theNationalAcademyofSciences,USA95 5511-5515(1998),JournalofBiological Chemistry26 116,20833-20839(1991))〇
[0272] 另外，基因的破坏例如也可通过在染色体上的基因的编码区域中插入其它的序列 来实现。插入部位可以为基因的任一区域，但插入的序列较长的一方能够可靠地使基因失 活。另外，优选插入部位的前后的序列的阅读框不一致。作为其它的序列，只要使所编码的 蛋白质的活性降低或消失就没有特别限制，例如可以举出抗生素抗性基因等标记基因及对 异种蛋白质生产有用的基因。
[0273] 如上修饰染色体上的基因例如可通过如下操作实现：制作缺失基因的部分序列， 以不会产生正常起作用的蛋白质的方式进行修饰的缺失型基因，在含有该缺失型基因的重 组DNA中转化宿主，在缺失型基因和染色体上的野生型基因中产生同源重组，由此将染色 体上的野生型基因取代为缺失型基因。此时，若使重组DNA根据宿主的营养缺陷性等性状 而预先含有标记基因，则容易操作。即使生成由缺失型基因编码的蛋白质也具有与野生型 蛋白质不同的立体结构，功能降低或消失。利用了这样的同源重组的基因取代导致的基因 破坏已经确立，有被称为"Red驱动整合（Red-drivenintegration) "的方法（〇3七86111?)，1(. A,andWanner,B.L.Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 97:6640-6645 (2000))、组合了Red驱动 整合法和源自X菌体的切出系统（Cho,E.H.，Gumport,R.I.，Gardner,J.F.J.Bacteri ol. 184:5200-5203(2002))的方法（参照W02005/010175号）等使用直链状DNA的方法、及 使用含有温度敏感性复制起点的质粒的方法、使用可接合转移的质粒的方法、使用不具有 在宿主内发挥作用的复制起点的自杀载体的方法等（美国专利第6303383号、日本特开平 05-007491 号）。
[0274] 另外，蛋白质的活性降低这样的修饰例如可以通过突变处理来进行。作为突变处 理，可以举出：利用X射线或者紫外线的照射、或N-甲基-N' -硝基-N-亚硝基胍（MNNG)、 甲磺酸乙酯（EMS)、甲磺酸甲酯（MMS)等突变剂进行的通常的突变处理。
[0275] 蛋白质的活性降低可通过测定相同蛋白质的活性来确认。
[0276] 基因的表达降低可通过确认相同基因的转录量降低、或通过确认由相同基因表达 的蛋白质的量降低来确认。
[0277] 基因的转录量降低的确认可以通过将由相同基因所转录的mRNA的量与非修饰 株相比来进行。作为评价mRNA的量的方法，可以举出：印迹杂交、RT-PCR等（Molecular cloning(ColdspringHarborLaboratoryPress,ColdspringHarbor(USA)，2001))〇 mRNA的量与非修饰株相比，例如可以降低至50 %以下、20 %以下、10 %以下、5 %以下或 0%〇
[0278] 蛋白质的量降低的确认可以使用抗体通过蛋白质印迹法来进行（Molecular cloning(ColdspringHarborLaboratoryPress,ColdspringHarbor(USA)，2001))〇 蛋白质的量与非修饰株相比，例如可以降低至50%以下、20%以下、10%以下、5%以下或 0%〇
[0279] 基因被破坏可以根据用于破坏的方法确认相同基因的一部分或全部的碱基序列、 限制酶图谱或总长等来确认。
[0280] 降低上述的蛋白质的活性的方法可用于任意的蛋白质，例如催化从目标L-氨基 酸的生物合成途径中分支而生成目标L-氨基酸以外的化合物的反应的酶的活性降低、任 意的基因，例如编码这些任意的蛋白质的基因的表达降低。
[0281] 〈2>本发明的L-氨基酸的制造方法
[0282] 本发明的方法为包含在培养基中培养本发明的细菌及从该培养基中采集L-氨基 酸的L-氨基酸的制造方法。
[0283] 使用的培养基只要本发明的细菌能够增殖且可生产目标L-氨基酸就没有特别限 制。作为培养基，例如可以使用细菌等细菌的培养中所使用的通常的培养基。作为培养基， 例如可以使用根据需要含有选自碳源、氮源、磷酸源、硫源、其它的各种有机成分及无机成 分中的成分的培养基。培养基成分的种类及浓度可以根据使用的细菌的种类及制造的氨基 酸的种类等诸条件适宜设定。
[0284] 作为碳源，具体而言，例如可以举出：葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、木糖、果胶 糖、糖蜜、淀粉水解物、生物质的水解物等糖类；醋酸、富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸类； 甘油、粗甘油、乙醇等醇类；脂肪酸类。作为碳源，可以使用1种碳源，也可以组合使用2种 或其以上的碳源。
[0285] 作为氮源，具体而言，例如可以举出：硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等铵盐；胨、酵母提 取物、肉提取物、大豆蛋白质分解物等有机氮源；氨、脲。可以将pH调节中所使用的氨气或 氨水用作氮源。作为氮源，可以使用1种氮源，也可以组合使用2种或其以上的氮源。
[0286] 作为磷酸源，具体而言，例如可以举出：磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等磷酸盐；焦磷 酸等磷酸聚合物。作为磷酸源，可以使用1种磷酸源，也可以组合使用2种或其以上的磷酸 源。
[0287] 作为硫源，具体而言，例如可以举出：硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐等无机硫化合 物；半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽等含硫氨基酸。作为硫源，可以使用1种硫源，也可以组合 使用2种或其以上的硫源。
[0288] 作为其它的各种有机成分及无机成分，具体而言，例如可以举出：氯化钠、氯化钾 等无机盐类；铁、锰、镁、钙等微量金属类；维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、烟酸酰胺、 维生素B12等维生素类；氨基酸类；核酸类；含有这些的胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大 豆蛋白质分解物等有机成分。作为其它的各种