有机成分及无机成分，可以使用1种成分，也 可以组合使用2种或其以上的成分。
[0289] 另外，在生长中使用需要氨基酸等的营养缺陷性突变株的情况下，优选在培养基 中添补所需要的营养素。例如L-赖氨酸生产菌大多可增强L-赖氨酸生物合成途径，弱化 L-赖氨酸分解能力。因此，在培养这样的L-赖氨酸生产菌的情况下，例如优选在培养基中 添补选自L-苏氨酸、L-高丝氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸中的1个或其以上的氨基酸。
[0290] 另外，例如在利用棒状杆菌型细菌制造L-谷氨酸的情况下，优选限制培养基中的 生物素量、或在培养基中添加表面活性剂或青霉素。
[0291] 培养条件只要本发明的细菌能够增殖且可生产目标L-氨基酸就没有特别限制。 培养例如可以在细菌等细菌的培养中所使用的通常的条件下进行。培养条件可以根据使用 的细菌的种类及制造的氨基酸的种类等诸条件适宜设定。
[0292] 培养可以使用液体培养基需氧地进行。培养具体而言可以通过通气培养或震荡培 养进行。培养温度例如可以为20~40°C，优选为25°C~37°C。培养基的pH例如可以调 节为5~8。pH调节中可以使用无机或者有机的酸性或者碱性物质、或氨气等。培养期间 例如可以为15小时~90小时。培养可以通过分批培养（batchculture)、加料分批培养 (Fed-batchculture)、连续培养（continuousculture)或它们的组合来实施。另外，培养 可以分为种子培养和主培养来进行。此时，种子培养和主培养的培养条件可以相同，也可以 不同。例如可以均采用分批培养进行种子培养和主培养。另外，例如可以采用分批培养进 行种子培养，采用加料分批培养或连续培养进行主培养。通过在这样的条件下培养本发明 的细菌使L-氨基酸在培养基中蓄积。
[0293] 另外，在制造L-谷氨酸的情况下，也可以使用调节为L-谷氨酸析出的条件的液体 培养基一边在培养基中析出L-谷氨酸一边进行培养。作为L-谷氨酸析出的条件，例如可 以举出：pH5. 0~4. 0、优选pH4. 5~4. 0、进一步优选pH4. 3~4. 0、特别优选pH4. 0的条件 (欧洲专利申请公开第1078989号说明书）。
[0294] 另外，在制造L-赖氨酸等碱性氨基酸的情况下，可以利用将重碳酸离子及/或 碳酸离子用作碱性氨基酸的主要的抗衡离子来发酵生产碱性氨基酸的方法（日本特开 2002-65287、US2002-0025564A、EP1813677A)。根据这些方法，可以在削减现有用作碱性氨 基酸的抗衡离子的硫酸离子及/或氯离子的使用量的同时制造碱性氨基酸。
[0295] 来自发酵液的L-氨基酸的回收通常可通过组合离子交换树脂法（Nagai，H.et al.，SeparationScienceandTechnology, 39(16)，3691-3710)、沉淀法、膜分离法（日本 特开平 9-164323 号、日本特开平 9-173792 号）、晶析法（W02008/078448、W02008/078646)、 其它的公知的方法来实施。需要说明的是，L-氨基酸在菌体内蓄积的情况下，例如可以利 用超声波等破碎菌体，通过离子交换树脂法等从通过离心分离除去菌体而得到的上清液 中回收L-氨基酸。所回收的L-氨基酸可以为游离体、其盐、或它们的混合物。作为盐， 例如可以举出：硫酸盐、盐酸盐、碳酸盐、铵盐、钠盐、钾盐。例如，在L-谷氨酸的情况中， 可以如下获得L-谷氨酸单钠（MSG)，即通过添加酸结晶发酵液中的L-谷氨酸单铵，然后 通过将等摩尔的氢氧化钠添加至晶体。另外，可以通过在结晶之前和/或之后使用活性 炭实施脱色（参见 Tetsuya KAWAKITA, "Industrial Crystallization for Monosodium L-Glutamate. "，Bulletin of the Society of Sea Water Science, Japan, Vol. 56:5)〇
[0296] 另外，在L-氨基酸在培养基中析出的情况下，可以通过离心分离或过滤等来回 收。另外，培养基中所析出的L-氨基酸可以在晶析溶解在培养基中的L-氨基酸后，同时分 离。
[0297] 另外，所回收的L-氨基酸除L-氨基酸以外，可以含有细菌菌体、培养基成分、水分 及细菌的代谢副产物。所回收的L-氨基酸的纯度例如可以为50%以上，优选为85%以上， 特别优选为 95 % 以上（JP1214636B,USP5, 431，933,USP4, 956, 471，USP4, 777, 051，USP4, 94 6, 654,USP5, 840, 358,USP6, 238, 714,US2005/0025878))。
[0298] 当L-氨基酸是L-谷氨酸时，例如可以使用L-谷氨酸单钠晶体作为鲜味调味品 (umamiseasoning)。可以与核酸诸如5' -GMP二钠盐和5' -頂P二钠盐（它们也具有鲜 味）组合使用L-谷氨酸单钠晶体作为调味品。
[0299] 需要说明的是，本发明的方法的一样态为一种L-氨基酸的制造方法，其包括在培 养基中培养具有L-氨基酸生产能力的棒状杆菌型细菌及从该培养基中采集L-氨基酸，其 特征在于，所述细菌保持有编码磷酸盐转运蛋白的突变型pitA基因，所述磷酸盐转运蛋白 具有相当于序列号6的246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基被取代为苯丙氨酸以外的氨基 酸残基的突变。
[0300] 关于本发明的方法的该样态，可准用涉及上述的本发明的细菌及本发明的方法的 记载。例如在该方式中，优选相当于序列号6的246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基被取 代为丝氨酸残基。另外，在该样态中，优选棒状杆菌型细菌为谷氨酸棒状杆菌。另外，在该 方式中，所制造的L-氨基酸可以为任一氨基酸，但优选L-谷氨酸。
[0301] 实施例
[0302] 本发明可通过以下的实施例进一步具体地进行说明，但这些实施例为如何含义也 不可理解为限定本发明的意图。
[0303] 实施例1 :使用了 pitA强化株的Glu生产培养
[0304] 在本实施例中，使用pitA基因的表达得到增强的谷氨酸棒状杆菌的Glu生产株进 行Glu生产，对pitA基因的表达增强对Glu生产造成的影响进行评价。
[0305] 使用菌株如下所述。
[0306] 谷氛酸棒状杆菌 2256AldhAAsucAyggB*/pVK9
[0307] 谷氛酸棒状杆菌 2256AldhAAsucA yggB*/pVK9_Plac-pitA
[0308] (1)菌株构建方法
[0309] 将谷氨酸棒状杆菌2256菌株（ATCC13869)用作亲株，通过以下的方法构建 2256AldhAAsucAyggB#菌株作为模型Glu生产株。将使用的引物示于表1。
[0310] 表 1
[0311]
[0312] 首先，以2256菌株的染色体DNA为模板，分别使用引物1、2 -对、及引物3、4 一对 扩增ldhA基因缺损用的DNA片段。接着，以等量混合所扩增的2片段而成的基因为模板， 使用引物5、6进行PCR，得到2片段结合而成的DNA片段。用Sail处理得到的DNA片段并 导入到pBS4S(W02005/113745)的Sail部位中，由此构建ldhA缺损用质粒。将该ldhA缺 损用质粒插入到2256菌株的染色体中后，使其脱落，由此使ldhA基因缺损。
[0313] 接着，以2256菌株的染色体DNA为模板，分别使用引物7、8 -对、及引物9、10 -对 扩增sucA基因缺损用的DNA片段。接着，以等量混合所扩增的2片段而成的基因为模板， 使用引物11、12进行PCR，得到2片段结合而成的DNA片段。用BamHI处理得到的DNA片段 并导入到pBS3(W02006/070944)的BamHI部位中，由此构建sucA缺损用质粒。将该sucA 缺损用质粒插入到2256AldhA菌株的染色体中后，使其脱落，由此使sucA基因缺损。在生 物素充分条件下培养得到的sucA缺损株中的多个变体，挑选具有Glu生产能力的菌株，结 果，获得IS突变（V419::IS)进入到yggB基因的Glu生产株。将IS突变（V419::IS)进入 的yggB基因的碱基序列及相同基因编码的YggB蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号23 及24。将得到的Glu生产株作为2256AldhAAsucAyggB#菌株。
[0314] 通过以下的方法构建pitA表达质粒（pVK9-Plac-pitA)。首先，以2256菌株的染色 体DNA为模板，使用引物13、14扩增pitA基因片段。接着，使用in-fusion(TaKaRaINC.) 将扩增了的片段与用bamHI和pstl处理了的pVK9质粒（US2006-0141588)连结，构建pitA 表达质粒。将构建的pitA表达质粒作为pVK9-Plac-pitA。
[0315] 分别将构建的pVK9-Plac-pitA和作为载体对照的pVK9导入到Glu生产菌 2256AldhAAsucA yggB*菌株中，构建 2256AldhAAsucA yggB */pVK9_Plac-pitA 菌株及 2256AldhAAsucA yggB*/pVK9 菌株。
[0316] (2) Glu生产培养
[0317] 使用 2256AldhAAsucA yggB*/pVK9_Plac-pitA 菌株及 2256AldhAAsucA yggB7pVK9菌株，进行Glu生产培养。将使用的培养基的组成示于表2。
[0318] 表 2
[0319]
[0320] 制作用K0H调整为pH8. 0的上述组成的培养基，利用高压釜（115°C、15min)灭菌， 供于培养。
[0321] 〈培养方法〉
[0322] 在坂口烧瓶中装入20mL培养基，以成为50g/L的方式添加CaC03，在31. 5°C的箱 式振荡器中振荡，进行培养（预培养及主培养）。最初，作为预培养，使用培养基1将上述的 菌株分别培养24小时。接着，将得到的预培养液2mL接种于培养基2中，在接种2小时后 添加吐温40(最终浓度4g/L)进行主培养。在接种17小时后进行取样。使用AS-310(旭 化成）对残留糖及谷氨酸进行定量。
[0323] 〈结果和考察〉
[0324] 将结果示于表3。表3中，"RS"表示残留糖量，"Glu"表示谷氨酸量。由本实施例 明确，在谷氨酸棒状杆菌中使pitA基因的表达上升，由此使谷氨酸棒状杆菌的生长和Glu 生产率提高。因此，考察到增大pitA基因编码的磷酸盐转运蛋白的活性对谷氨酸等氨基酸 生产有效。
[0325] 表 3
[0326]
[0327] 实施例2 :使用了pitA突变株的Glu生产培养
[0328] 在本实施例中，使用在pitA基因中导入了突变的谷氨酸棒状杆菌的Glu生产株进 行Glu生产，对pitA基因的突变对Glu生产造成的影响进行评价。
[0329] 使用菌株如下所述。
[0330] 谷氛酸棒状杆菌 2256AldhAAsucAyggB*
[0331] 谷氨酸棒状杆菌 2256AldhAAsucA yggB*pitAmut
[0332] (1)菌株构建方法
[0333] 将实施例1中构建的模型Glu生产株即谷氨酸棒状杆菌2256 A ldhA A sucAyggB* 作为亲株，构建在口^六基因中导入有突变的2256八1(11^八8以^ 7888>^^41111^菌株。将使 用的引物示于表4。
[0334] 表 4
[0336] 通过以下的方法构建itA突变导入用质粒pBS4S-pitAmut。以PitA蛋白质的246 位的苯丙氨酸残基被取代为丝氨酸残基的突变（Phe246Serttc-tcc)进入到pitA基因 的编码区域内的Glu生产菌B3菌株的染色体DNA为模板，使用引物15、16进行PCR，扩增 具有上述突变的PitA基因片段。接着，使用in-fusion(TaKaRaINC.)将扩增了的片段和 用BamHI和PstI处理了的BS4S质粒连结，构建pitA突变导入用质粒。将构建的pitA突 变导入用质粒作为pBS4S_pitAmut。
[0337] 将构建的pBS4S_pitAmut插入到Glu生产菌2256 AldhAAsucAyggEf菌株的染色 体中后，使其脱落，由此构建在1)^4基因中导入有突变的2256八1(11^八 811(^7888>^^41111^ 菌株。
[0338] 需要说明的是，上述pitA突变株2256 AldhAAsucAyggB*pitAmut菌株使用以 Glu酸生产菌B3菌株的染色体DNA为模板所构建的突变导入用质粒进行构建，但也可使用 通过Takarabio制:PrimeSTAR?MutagenesisBasalKit制作的突变导入用质粒构建。 例如以谷氨酸棒状杆菌2256菌株（ATCC13869)等野生株的染色体DNA为模板，使用引物 15、16进行PCR，扩增不具有突变的pitA基因片段。接着，可使用in-fusion(TaKaRaINC.) 将扩增了的片段和进行了BamHI和PstI处理的pBS4S质粒连结，构建含有野生型pitA基 因的序列的质粒。进而，以该质粒为模板，按照PrimeSTA,R_MutagenesisBasalKit的 使用说明书使用PitA基因的737位的T被改变为C这样的适当的引物进行PCR，构建pitA 突变导入用质粒pBS4S-pitAmut。可使用其构建相同的pitA突变株。
[0339] (2) Glu生产培养
[0340] 使用 2256 AldhAAsucAyggB*菌株及 2256 AldhAAsucAyggB*pitAmut菌株进行 Glu生产培养。将使用的培养基的组成示于表5。
[0341] 表 5
[0342]
[0343] 制作用K0H调整为pH8. 0的上述组成的培养基，利用高压釜（115°C、15min)灭菌， 供于培养。
[0344] 〈培养方法〉
[0345] 在坂口烧瓶中装入培养基20mL，以成为50g/L的方式添加CaC03，在31. 5°C的箱式 振荡器中振荡，进行培养（预培养及主培养）。最初，作为预培养，使用培养基3将上述的菌 株分别培养24小时。接着，将得到的预培养液2mL接种于培养基3中，在接种2小时后添 加吐温40 (最终浓度4g/L)，进行主培养。在接种21. 5小时后进行取样。使用AS-310 (旭 化成）对残留糖及谷氨酸进行定量。
[0346] 〈结果和考察〉
[0347] 将结果示于表6。表6中，"RS"表示残留糖量，"Glu"表示谷氨酸量。由本实施例 明确，通过在谷氨酸棒状杆菌中向pitA基因中导入突变（Phe246Ser)，谷氨酸棒状杆菌的 生长和Glu生产率提高。因此，考察到该pitA突变（Phe246Ser)对谷氨酸等氨基酸生产有 效。
[0348] 表 6
[0349]
[0350] 工业适用性
[0351] 根据本发明，可以改善棒状杆菌细菌的L-氨基酸生产能力，并且可以有效生产 L-氨基酸。
[0352] [序列表的说明]
[0353] 序列号1 :大肠杆菌MG1655的pitA基因的碱基序列
[0354] 序列号2 :大肠杆菌MG1655的PitA蛋白质的氨基酸序列
[0355] 序列号3 :菠萝泛菌LMG20103的pitA基因的碱基序列
[0356] 序列号4 :菠萝泛菌LMG20103的PitA蛋白质的氨基酸序列
[0357] 序列号5 :谷氨酸棒状杆菌2256(ATCC13869)的pitA基因的碱基序列
[0358] 序列号6 :谷氨酸棒状杆菌2256(ATCC13869)的PitA蛋白质的氨基酸序列
[0359] 序列号7~20:引物
[0360] 序列号21 :谷氨酸棒状杆菌2256(ATCC13869)的yggB基因的碱基序列
[0361] 序列号22 :谷氨酸棒状杆菌2256(ATCC13869)的YggB蛋白质的氨基酸序列
[0362] 序列号23:谷氨酸棒状杆菌2256(ATCC13869)的yggB基因（V419::IS)的碱基 序列
[0363] 序列号24 :谷氨酸棒状杆菌2256(ATCC13869)的YggB蛋白质（V419: :IS)的氨 基酸序列
[0364] 序列号25 :谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的pitA基因的碱基序列
[0365] 序列号26 :谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的PitA蛋白质的氨基酸序列
[0366] 序列号27、28:引物
【主权项】
1. 一种制造L-氨基酸的方法，包括： 在培养基中培养具有L-氨基酸产生能力的棒状杆菌型细菌；和 从该培养基收集L-氨基酸，其中， 所述细菌已经经过修饰而增加了磷酸盐转运蛋白的活性。2. 如权利要求1所述的方法，其中，磷酸盐转运蛋白的活性是通过增加编码磷酸盐转 运蛋白的基因的表达而增加的。3. 如权利要求2所述的方法，其中，所述基因为pitA基因。4. 如权利要求3所述的方法，其中，所述pitA基因是下面（a)或（b)中限定的DNA: (a) 具有SEQ ID NO:5或25所示的核苷酸序列的DNA ; (b) 可在严格条件下与由SEQ ID N0:5或25所示的核苷酸序列的互补序列或与可自所 述互补序列制备的探针杂交的DNA，且其中所述可杂交的DNA编码具有磷酸盐转运蛋白活 性的蛋白质。5. 如权利要求3或4所述的方法，其中，所述pitA基因为编码下述（A)或（B)中限定 的蛋白质的DNA : (A) 包含SEQ ID NO:6或26所示的氨基酸序列的蛋白质； (B) 包含在SEQ ID N0:6或26所示的氨基酸序列中包含1个或数个氨基酸残基的取代、 缺失、插入、或添加而得到的氨基酸序列的蛋白质，且其中所述蛋白质具有磷酸盐转运蛋白 活性。6. 如权利要求2-5中任一项所述的方法，其中，所述基因的表达是通过提高该基因的 拷贝数和/或修饰该基因的表达调控序列而增加的。7. 如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，磷酸盐转运蛋白的活性是通过使所述 细菌携带突变型PitA基因而增加的，所述突变型pitA基因编码具有对应于SEQ ID N0:6中 246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基被取代为苯丙氨酸残基以外的氨基酸残基的突变的磷 酸盐转运蛋白。8. 如权利要求7所述的方法，其中，对应于SEQ ID NO: 6中246位的苯丙氨酸残基的氨 基酸残基被取代为丝氨酸残基。9. 一种制造L-氨基酸的方法，其包括： 在培养基中培养具有L-氨基酸产生能力的棒状杆菌型细菌，和 从该培养基中收集L-氨基酸，其中， 所述细菌携带突变型PitA基因，所述突变型pitA基因编码具有对应于SEQ ID N0:6中 246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基被取代为苯丙氨酸残基以外的氨基酸残基的突变的磷 酸盐转运蛋白。10. 如权利要求9所述的方法，其中，对应于SEQ ID NO:6中246位的苯丙氨酸残基的 氨基酸残基被取代为丝氨酸残基。11. 如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述细菌是棒状杆菌属 (Corynebacterium)细菌。12. 如权利要求11所述的方法，其中，所述棒状杆菌型细菌为谷氨酸棒状杆菌。13. 如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，所述L-氨基酸为L-谷氨酸。14. 如权利要求13所述的方法，其中所述L-谷氨酸是L-谷氨酸单铵或L-谷氨酸单 钠。15. -种编码磷酸盐转运蛋白的DNA，所述磷酸盐转运蛋白具有对应于SEQ ID NO: 6中 246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基被取代为丝氨酸残基的突变。16. -种携带突变型pitA基因的棒状杆菌型细菌，所述突变型pitA基因编码具有对应 于SEQ ID N0:6中246位的苯丙氨酸残基的氨基酸残基被取代为丝氨酸残基的突变的磷酸 盐转运蛋白。
【专利摘要】本发明提供一种L-氨基酸的制造方法。通过在培养基中培养已经以磷酸盐转运蛋白的活性增大的方式进行修饰的具有L-氨基酸生产能力的棒状杆菌型细菌并从该培养基采集L-氨基酸来制造L-氨基酸。
【IPC分类】C12P13/04, C12R1/15, C12N15/09, C12N1/21, C12P13/14
【公开号】CN105008532
【申请号】CN201480005332
【发明人】平野圣子, 林和之
【申请人】味之素株式会社
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2014年5月13日
【公告号】EP2868745A1, EP2868745A4, US20150307907, WO2014185430A1