morgan CK1000D高通量组织研磨仪进行粉碎。样品中加入65°C预热的CTAB提取缓冲液600ul， 涡旋混匀裂解样品。由于麦芽中富含蛋白质、多糖、多酚等物质，分离难度大，因此添加 4ul0 -巯基乙醇和1%PVP(聚乙烯吡咯烷酮），防止多酚氧化褐变和DNA降解，有效去除多 酚和多糖。65°C水浴15min，期间轻轻摇动混匀。加600ul氯仿/异戊醇（24:1)，涡旋剧烈 混匀20s，使成乳状液。室温下，lOOOOrpm离心10分钟，吸取300ul的上清液到新离心管中， 加10ul的RNaseA放置20min。小心抽取上清液加入预冷的等体积的异丙醇，直至白色线 状DNA形成块状沉淀。-20°C条件下放置20分钟以上，lOOOOrpm离心3分钟收集沉淀。加 650ul的70%乙醇冲洗液，轻摇几分钟，lOOOOrpm离心2min，弃滤液。打开盖，平放洁净场 所挥发乙醇。加适量TE缓冲液溶解DNA，2-8°C保存DNA。
[0044] (2)PCR扩增：
[0045] 用3条引物进行PCR扩增，第1条引物是SSR正向引物的5'端和M13引物相连合 成带有M13尾巴的引物，即TP-M13引物；第2条引物为正常的SSR反向引物；第3条引物是 5'端标记有Alexa Fluor 680荧光的Ml3通用引物。
[0046] PCR体系反应体积为 20yL，含MgCl2 2. 5mmol/L，dNTP0? 20mmol/L，带有M13 尾巴 序列的特异正向引物〇? 04ymol/L、反向引物0? 16ymol/L，M13荧光引物0? 12ymol/L，Taq DNA聚合酶0. 5单位，2XPCR缓冲液（不含Mg2+)，样品DNA10-50ng。反应程序为：94°C预变 性 3min;94°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸lmin，共 30 个循环；72°C延伸 10min，4°C保 存。
[0047] (3)毛细管电泳荧光检测：
[0048] a、制备SLS/DSS混合液：取0?5y1的DSS-400分子量内标，加入39. 5y1的SLS 甲酰胺上样缓冲液，在涡旋震荡器上混合均匀，加入样品板中；
[0049] b、样品孔中加入1y1稀释后的PCR产物，加一滴石蜡油覆盖样品；
[0050] c、在缓冲液板与样本板对应孔内加入3/4体积的分离缓冲液；
[0051] d、将上样板和缓冲板放入BECKMANGeXP遗传分析系统仪（BECKMAN公司，美国） 中，进样电压2.OkV，时间30sec;90°C变性120sec;分离电压6.OkV，时间50min。在毛细管 凝胶电泳过程中，PCR产物与DSS-400分子量内标的荧光信号均由基因分析仪自动保存。
[0052] (4)数据分析：
[0053] 用GeneMapper_V3. 0软件对BECKMAN GeXP遗传分析系统仪收集到的数据进行分 析，通过人工分析与软件统计得出不同麦芽的SSR标记片段。利用软件将SSR标记片段与 DSS-400分子量内标比较，得到SSR标记片段长度大小。
[0054] (5)图谱构建：根据步骤（4)数据分析的结果，构建21种麦芽样品的SSR指纹图 谱（表2)。
[0055] 分析毛细管电泳结果，根据麦芽样品扩增片段大小确定该位点的等位变异大小。 纯合位点的等位变异记录为X，杂合位点的等位变异记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两 个不同的等位变异片段大小，小片段在前，大片段在后。无效等位变异记录为〇/〇。由表2 可知，4对SSR引物完全可以将21种麦芽分开，如麦芽品种Copeland和Metcalfe高度相 似，二者在引物scssrl0148、HVWAXYG和EBmac755的扩增上大小完全一致，无法区分，但在 HVM68的扩增产物上大小分别为242/283和242/277,因此可以分开。而麦芽品种Copeland 和Baudin差异很大，4对引物中的任何一对都可以直接把这个两个品种分开，鉴定起来非 常容易。因此，对于高度相似的品种可能需要3-4对引物的组合才能分开，而对于差异性很 大的品种只需要1-2对引物就可以分开。因此，本发明基于TP-M13-SSR技术结合毛细管电 泳技术，成功构建了麦芽品种的SSR标准指纹图谱，利用该指纹图谱可以进行商业麦芽的 品种鉴定。该法结果准确可靠，为从源头上保障啤酒企业产品质量提供了技术支持。
[0056] 表2. 21种麦芽样品的SSR标准指纹图谱
[0057]
[0058] 实施例2:Copland麦芽品种鉴定
[0059] 抽检本公司的采购麦芽样品，进行麦芽品种鉴定，确定该样品是否为采购合同规 定的Copeland，随机取样8粒麦芽进行品种鉴定。
[0060] SSR引物组，包括4对核心SSR引物，分别为Scssrl0148、HVM68、HVWAXYG和 EBmac755 ;其中正向引物的5'端和M13引物相连合成带有M13尾巴的引物，即TP-M13引 物。所述4对核心SSR引物序列如下：
[0061]
[0062] 利用上述SSR引物组进行麦芽品种鉴定的方法，包括以下步骤：
[0063] (1)对样品进行麦芽DNA制备，TP-M13-SSR标记PCR扩增，毛细管电泳检测，数据 分析，具体实施步骤如实施例1的步骤（1)-(4)。
[0064] (2)结果分析：由图1-4可知，待鉴定的8粒麦芽在4对引物上扩增片段的大小 分别一致。其中，引物scssrl0148扩增片段大小均为241bp，HVM68扩增片段大小均为 242/283,HVWAXYG扩增片段大小均为214bp，EBmac755扩增片段大小均为164bp，四对引物 扩增片段大小与Copland的SSR指纹数据完全一致，由此可确定待鉴定的8粒麦芽全部为 Copeland。
[0065] 实施例3 :Gairdner麦芽品种鉴定
[0066] 与实施例2不同的是，
[0067] 样品本公司抽检的采购麦芽样品，进行麦芽品种鉴定，确定该样品是否为采购合 同规定的Gairdner，随机取样8粒麦芽进行品种鉴定。
[0068] (1)对样品进行麦芽DNA制备，TP-M13-SSR标记PCR扩增，毛细管电泳检测，数据 分析，具体实施步骤如实施例1的步骤（1)-(4)。
[0069] (2)结果分析：由图5-8可知，待鉴定的8粒麦芽在4对引物上扩增片段的大小 分别一致。其中，引物scssrl0148扩增片段大小均为241bp，HVM68扩增片段大小均为 202/277,HVWAXYG扩增片段大小均为201bp，EBmac755扩增片段大小均为176bp，四对引物 扩增片段大小与Gairdner的SSR指纹数据完全一致，由此可确定8粒待鉴定麦芽品种全部 为Gairdner。
【主权项】
1. SSR引物组，其特征在于：包括4对核心SSR引物，分别为Scssrl0148、HVM68、 HVWAXYG和EBmac755 ;其中正向引物的5'端和M13引物相连合成带有M13尾巴的引物，即 TP-M13引物；所述4对核心SSR引物序列如下：2. 利用权利要求1所述的SSR引物组构建麦芽品种指纹图谱的方法，其特征在于：包 括以下步骤：（1)提取供试样品的DNA ; (2)用3条引物PCR扩增：第1条引物为TP-M13引 物；第2条引物为正常的SSR反向引物；第3条引物是5'端标记荧光的M13通用引物；所 述M13通用引物的引物序列为TGTAAAACGACGGCCAGT ;(3)毛细管电泳荧光检测；(4)数据分 析和图谱构建。3. 根据权利要求2所述的利用SSR引物组构建麦芽品种指纹图谱的方法，其特征在于： 所述麦芽包括以下21种麦芽：4. 根据权利要求3所述的利用SSR引物组构建麦芽品种指纹图谱的方法，其特征在于： 所述步骤⑵中PCR扩增的反应程序为：94°C预变性3min ;94°C变性30s，55°C退火30s， 72°C延伸lmin，共30个循环；72°C延伸10min，4°C保存。5. 根据权利要求3所述的利用SSR引物组构建麦芽品种指纹图谱的方法，其特征在于： 所述PCR扩增体系反应体积为20 μ L，含MgCl2 2. 5mmol/L，dNTP 0. 20mmol/L，带有M13尾 巴序列的特异正向引物0.04以!11〇1/1，反向引物0.16 4111〇1/1，113荧光引物0.12 4111〇1/1， Taq DNA聚合酶0· 5单位，2 XPCR缓冲液（不含Mg2+)，样品DNA10-50ng。6. 根据权利要求3所述的利用SSR引物组构建麦芽品种指纹图谱的方法，其特征在于： 所述步骤（3)包括以下几个步骤： a、制备SLS/DSS混合液：取0. 5 μ 1的DSS-400分子量内标，加入39. 5 μ 1的SLS甲酰 胺上样缓冲液，在涡旋震荡器上混合均匀，加入样品板中； b、 样品孔中加入1 μ 1稀释后的PCR产物，加一滴石蜡油覆盖样品； c、 在缓冲液板与样本板对应孔内加入3/4体积的分离缓冲液； d、 将上样板和缓冲板放入BECKMAN GeXP遗传分析系统仪（BECKMAN公司，美国）中，进 样电压2. OkV，时间30sec ;90°C变性120sec ;分离电压6. OkV，时间50min。7. 根据权利要求3所述的利用SSR引物组构建麦芽品种指纹图谱的方法，其特征在于： 所述步骤（4)数据分析和图谱构建为：对BECKMAN GeXP遗传分析系统仪收集到的数据进行 分析，得出不同品种麦芽的SSR标记片段；将SSR标记片段与DSS-400分子量内标比较，得 到SSR标记片段长度大小，从而构建麦芽品种指纹图谱。8. 根据权利要求2或3所述的利用SSR引物组构建麦芽品种指纹图谱的方法，其特征 在于：所述第3条引物是5'端标记有Alexa Fluor 680焚光的M13通用引物。9. 一种利用权利要求3所述的方法进行麦芽品种鉴定的方法，其特征在于：将待测样 品每粒麦芽DNA的4对SSR引物扩增的电泳图谱分别与麦芽标准指纹图谱相比较，如果待 测麦芽的电泳图谱与已知麦芽品种的标准指纹图谱数据一致，可判定二者为相同品种；如 果待测麦芽的电泳图谱与已知麦芽品种的标准指纹图谱的数据有差异，则判定二者为与不 同的麦芽品种。
【专利摘要】本发明提供了SSR引物组，包括4对核心SSR引物，分别为Scssr10148、HVM68、HVWAXYG和EBmac755；其中正向引物的5ˊ端和M13引物相连合成带有M13尾巴的引物，即TP-M13引物。本发明还提供了一种利用上述SSR引物组构建麦芽品种指纹图谱的方法，包括以下步骤：提取供试样品的DNA、用3条进行引物PCR扩增、毛细管电泳荧光检测、数据分析及图谱构建。利用上述麦芽标准指纹图谱可以进行麦芽品种的鉴定。本发明建立了毛细管电泳技术与SSR荧光标记相结合的高通道麦芽纯度鉴定方法，结果准确可靠，检测效率提高，杜绝麦芽掺假和售假行为出现，从源头上保障啤酒生产企业的产品质量。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105063028
【申请号】CN201510467448
【发明人】余俊红, 尹花, 张志军, 岳杰, 林艳, 房莉, 周月南, 祁明霞, 张翠
【申请人】青岛啤酒股份有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月31日