一种三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-redv共聚物及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及了一种三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物及制备方法， 属于医药基因治疗领域。
【背景技术】
[0002] 目前，siRNA和miRNA作为基因表达的重要调控者，具有特异性高、作用 迅速和高效等优点，在治疗癌症、骨和血管疾病中发挥重要积极作用，受到广大研 究人员的关注(MuthiahM,ParkI,ChoC.Nanoparticle-mediateddeliveryof therapeuticgenes:focusonmiRNAtherapeutics.ExpertOpin.DrugDeliv 2013, 10(9)，1259-1273)。
[0003] SiRNA和miRNA本身易于受到核酸酶的降解，因此研究具有较高转染效率的载体， 携带基因到达病灶部位并发挥基因的作用，成为一个重要的研究课题。三甲基化壳聚糖 (TMC)是壳聚糖的一种衍生物具有良好的生物相容性、可降解性、良好的水溶性以及复合基 因的能力，并广泛的应用于药物载体和医用辅助材料。聚乙二醇（PEG)具有良好的亲水性， 在TMC上引入PEG链段，有利于提高TMC在水中的溶解性和载体的稳定性，降低TMC的细胞 毒性。
[0004] 使用含有双端基官能团的聚乙二醇，可将三甲基化壳聚糖与具有脑靶向功能的多 肽RVG(序列为YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)连接，形成三甲基壳聚糖-接枝-聚乙 二醇-RVG，并应用于基因治疗领域，有助于实现核酸类药物通过血脑屏障和脑主动靶向定 位，并提高了核酸的稳定性和转染效率（姜同英，王思玲，高亦鲲.一种三甲基壳聚糖-接 枝-聚乙二醇/核酸脑靶向胶束及其制备方法.CN103182087B，2015)。其中，借助了功能肽 RVG上的巯基与PEG-端的马来酰亚胺基团、乙烯砜基团或硫醇基团反应。
[0005] 精氨酸_谷氨酸-天冬氨酸-缴氨酸（Arg-Glu-Asp-Val,REDV)存在于纤维连接 蛋白的III-CS区域。有研究表明，含有REDV序列合成肽的基板能够特异性地粘附血管内 皮细胞，而不粘附平滑肌细胞和成纤维细胞（HubbellJA，MassiaSP，DesaiNP，Drumheller PD.Endothelialcell-selectivematerialsfortissueengineeringinthevascular graftviaanewreceptor.NatureBiotechnology, 1991，9 (6):568-572)〇
[0006] 本发明进一步扩展了三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇_小肽的合成方法和应 用范围。使用含有双端基官能团的邻二硫吡啶-聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯，通过其中 的二硫键将具有特异性粘附血管内皮细胞的功能小肽REDV与PEG连接而形成三甲基化壳 聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物，可以缩短合成时间。该三甲基化壳聚糖-接枝-聚 乙二醇-REDV共聚物制备方法的优点是室温反应，反应过程简单。制备的带有正电荷的共 聚物与带有负电荷核酸等通过静电作用复合得到纳米粒子。该纳米粒子在水溶液中分散性 好，粒径较均一，电位为正值，具有稳定性好、靶向内皮细胞和转染效率高的优点，用于医药 基因治疗领域。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于制备一种三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物。
[0008] 本发明的技术方案如下：
[0009] 上述三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物的结构式为：
[0010]
[0011] 上述的三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物，其特征在于所述壳聚 糖的重均分子量为50KDa，壳聚糖脱乙酰度大于95%;三甲基化壳聚糖的甲基化度为30~ 50%〇
[0012] 上述三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物，其特征在于所述聚乙二醇 的分子量为3~5KDa，聚乙二醇的双端的活性基团分别为琥珀酰亚胺基团和吡啶基二硫基 团；聚乙二醇的接枝率为5~50%，。
[0013] 上述三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物，其特征在于所述REDV小肽 为精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-半胱氨酸（REDV-Cys)及其他可以靶向内皮细胞 的多肽。
[0014] 上述三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物的制备方法，包括以下步骤：
[0015] (1)制备三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-邻二硫吡啶共聚物；
[0016] (2)制备三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物。
[0017] 所述的步骤（1)制备三甲基化壳聚糖_接枝-聚乙二醇-邻二硫吡啶共聚物：原 料邻二硫吡啶-聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯和TMC的质量比为1~5:1，TMC的浓度为 10mg/mL，去离子水作为溶剂，室温下反应3~10h。产物使用去离子水透析，最后冻干得 到三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-邻二硫吡啶共聚物。
[0018] 所述的步骤（2)制备三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物：三甲基化 壳聚糖-接枝-聚乙二醇-邻二硫吡啶共聚物和REDV小肽的质量比为10~20: 1，REDV小 肽的浓度为0.25~0.5mg/mL,去离子水为溶剂，室温反应2~6h。未参加反应的小肽通 过离心超滤并透析除去，制得三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物。
[0019] 上述三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物可与带负电荷的核酸自组装 为纳米粒子，其特征在于包括步骤：将制备的三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV溶 解于焦碳酸二乙酯（DEPC)处理过的水中与核酸溶液进行混合，室温静置30min。
[0020] 上述纳米粒子，其特征在于制备的纳米粒子的动态光散射测试的粒径在50~ 500nm之间，G电位在2~30mV之间，靶向血管内皮细胞，用于医药基因治疗领域。
[0021] 本发明公布了一种三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物的制备方 法。首先三甲基化壳聚糖与邻二硫吡啶-聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯进行反应，得 到三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-邻二硫吡啶共聚物。然后加入特异性小肽精氨 酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-半胱氨酸（REDV-Cys)，通过共聚物中邻二硫吡啶 基团和小肽中巯基进行偶联反应，制得三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚 物。该制备方法的优点是室温反应，反应过程简单。本发明的共聚物带有正电荷可与带有 负电荷核酸通过静电作用复合得到纳米粒子。与基因复合后的纳米粒子在水溶液中分散性 好，粒径较均一，电位为正值，具有稳定、靶向内皮细胞和转染效率高的优点，用于医药 基因治疗领域。
【附图说明】
[0022] 图1 :实施例1制备的三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-REDV共聚物与miRNA复 合的纳米粒子的透射电子显微镜照片。
【具体实施方式】
[0023] 下面通过实施案例对本发明的技术方案作进一步的描述，以下实施案例是对本发 明的进一步说明，并不限制本发明的适用范围。
[0024] 实施例1 :
[0025] 在装有磁力搅拌的三口瓶中，将lg壳聚糖（M.=5、丨04 )和2. 4g碘化钠加入到 5. 6mL质量分数为15%的NaOH和40mLN-甲基-2-吡咯烷酮的混合溶液中，并加入6mL 碘甲烷，在60°C下回流反应45min。再加入5. 6mL的15%NaOH溶液和3mL的碘甲烷，搅 拌反应45min。之后加入40mL乙醇来终止反应，将产物过滤并使用乙醚洗涤。最后，将产 物溶解在40mL质量分数为10%NaCl溶液中，搅拌3h。产物使用去离子水透析72h，冻干 得到三甲基化壳聚糖。
[0026] 在20mg三甲基化壳聚糖和60mg邻二硫吡啶-聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯中， 加入2mL去离子水作为溶剂，在室温下反应6h。反应产物使用去离子水透析，最后冻干得 到三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-邻二硫吡啶共聚物。
[0027] 在10mg三甲基化壳聚糖-接枝-聚乙二醇-邻二硫吡啶共聚物和0. 8mgREDV-Cys 小肽中，加入2mL的去离子水并反应2h。