一种猪脑蛋白酶解制备脑多肽和脑小分子肽的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体设及一种猪脑蛋白酶解制备脑多肤和脑小分 子肤的方法。
【背景技术】
[0002] 哺乳动物脑蛋白的水解物，能治疗一些脑功能疾病，已被临床所证明。上世纪屯十 年代末期，奥地利一家名叫伊比威巧bewe)的药厂研制出脑活素，临床用于治疗神经系统 疾病，特别是阿尔茨海默病的治疗（AD、俗称老年痴呆症），能明显延缓老年痴呆病变的进 展，改善痴呆症状，对脑中风、脑震荡、脑损伤、脑动脉硬化、新生儿脑缺血缺氧性脑病等的 治疗也有较好的疗效。运种脑活素，是用猪脑蛋白经水解并进一步提纯制得的一种生物制 剂，含有75 %的游离氨基酸和25 %的小分子肤。研究表明脑活素的药理作用与其所含的 小分子肤类的多种活性存在量的关系。因此，近年来国内不少机构进行了大量研究，得到了 众多的脑蛋白水解物产品进入临床。
[0003] 据分析，鲜猪脑中含水率在78-82 %，蛋白质9-11 %，憐脂7-9 %，胆固醇3-3. 5 %。
[0004] 目前，由猪脑制备脑多肤和脑小分子肤的方法，从公开的文献资料中主要是W下 几种：
[00化](一）一种猪脑蛋白水解物中小分子肤的制备：将新鲜猪脑去膜、去血管、洗净后 切碎，投入索氏提取器内、用丙酬回流12小时后，取出压碎惊干，再用丙酬回流12个小时。 所得固形物再用乙酸按上述方法回流提取共24小时，惊干后即得猪脑脱脂蛋白粉。将脱 脂蛋白粉加入5倍的纯净水混合并加入猪脑蛋白粉重量2%的酸性蛋白酶、混匀后用冰醋 酸调PH值在2. 0-4. 0之间，然后过滤、滤液50°C减压蒸干后分别用石油酸和无水乙醇揽拌 24小时、抽滤，滤饼真空干燥即得猪脑蛋白水解物，水解物溶解，用Se地adexG15凝胶柱吸 附，W0. 9 %化cl为洗脱液进行分离纯化，分段收集各流份并脱盐，冷冻干燥后既可得到不 同分子量范围的小分子肤组份。
[0006](二）一种猪脑水解蛋白和单唾液酸四已糖神经节巧脂联产工艺（选择猪脑水解 蛋白部分），包括W下步骤：
[0007] 步骤1)将食品级新鲜猪脑粉碎后加入1-4倍体积的极性有机溶剂，匀浆2-4小时 后过滤、分别收集滤饼和滤液。
[0008] 步骤2)向步骤1所得的滤饼中加入1-3倍体积的丙酬，匀浆1-2小时脱去憐脂、 过滤、减压浓缩、20-30°C干燥，获得脱脂猪脑粉，向脱脂猪脑粉中加入盐缓冲液调节PH值 为5-7,按照l-3g/L的比例分别加入2种或3种水解酶，在25-42Γ条件下水解2-10小时， 水解结束后，70-100°C灭活5-10分钟，室溫放置降溫之后将水解物液经一定分子量的超滤 膜过滤，所得滤液再经截留分子量为100-500的纳滤膜浓缩和真空冷冻干燥获得注射级猪 脑水解蛋白。
[0009] (Ξ) -种脑蛋白水解液的提取方法，包括W下各步骤：
[0010] 步骤1)取新鲜猪脑或冷冻猪脑，摘除小脑干，并去除大脑组织表面的筋膜。用纯 化水或注射用水清洗干净，加入1-2倍纯化水或注射用水，用胶体磨匀浆2-3次。
[0011] 步骤2)取步骤（1)的匀浆液、加热至35-45Γ、调PH值至7. 5-8. 5,加浆重0. 5-2. 5 %的膜蛋白酶，揽拌反应2-8小时，调节PH值至2. 0-2. 5,加热至90°CW上保溫10-30分钟， 冷却至溫室度、离屯、。 阳01引步骤如取步骤似离屯、上清液，按体积比1-3 :1-3加入40-50W/V%径胺溶液，调 节PH值为1. 5-2. 5,在80-100°C密闭条件下反应10-30小时，冷却至40°CW下，调PH值至 6. 9-7. 5,离屯、过滤。
[0013] 步骤4)取步骤（3)的离屯、上清液、超滤，收集滤液即为蛋白水解物溶液。
[0014](四）一种从动物脑中提取脑活素的方法，包括W下步骤： 阳01引步骤1)将猪脑加蒸馈水、用化(oH) 2调PH值7-9。
[0016]步骤2)加猪或牛膜酶、甲苯、蒸馈水在37-50条件下，揽拌10-20小时，用憐酸调PH值为5. 7-5. 8. 阳017] 步骤3)煮沸、过滤、滤液用化1调PH值为6-7、减压浓缩，低溫冷却再浓缩，用化0H 调PH为7-9减压浓缩干燥。
[0018] 步骤4)将浓缩至干的物料加水溶解，过滤、滤液用化1调PH值为4-5,用活性炭脱 色、过滤、滤液浓缩后用截留分子量为10000的透析袋进行对水透析24小时，过滤，透析液 加NaHS03,过滤，分装灭菌而成。
[0019](五）一种制取猪脑多肤的方法，包括W下步骤：
[0020] 将新鲜猪脑匀浆，Ξ次冻融，在-20°C冷冻12-24小时后，再恢复室溫至溶解，如上 述重复操作Ξ次，使细胞破碎，加入膜蛋白酶进行酶解，酶解液经微滤和能拦截10000化的 超滤膜过滤，透过液即为脑多肤。
[0021] 上述5种制取猪脑多肤的方法中，方法（一）、（二）、（Ξ)具有大量使用有机溶 剂，生产成本高，生产安全和劳动安全要求高的缺点；且生产周期长，仅分离出脑蛋白的时 间分别是48小时、30小时和40小时。方法（四）和方法（五）唯不使用有机溶剂，但生产 周期长，从投料到出产品需要3-4天。
[0022] 公开于该【背景技术】部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应 当被视为承认或W任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
【发明内容】
[0023] 为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种从猪脑中制取脑蛋白肤的方法。
[0024] 为解决上述技术问题，本发明采用W下技术方案：
[0025] 一种猪脑蛋白酶解制备脑多肤和脑小分子肤的方法，包括如下步骤：
[0026] (1)取出鲜猪脑或解冻的冰冻猪脑，用纯净水洗净表面的污物、血水及杂质，摘取 筋膜、血管；
[0027] 似将清洗干净的猪脑，按原料与纯净水比例为1:0.8-1.0混合后，用胶体磨研 磨匀浆，初磨时调到最粗的细度，待组织基本破碎完后再调至较细的细度，研磨匀浆循环 8-lOmin/批，然后添加为匀浆2倍的纯净水继续匀浆2-3min，把每批次匀浆好的脑浆液混 合均匀，用化0H溶液调PH值至9.0;
[0028] (3)将调节好的脑浆匀浆液，置于带揽拌装置的微波罐中，控制溫度55°C，微波 20-25min，保溫 15min;
[0029] (4)将经过微波处理的匀浆液排出，在40-50°C用蝶式高速离屯、机两次分离蛋白 和脂质，第一次离屯、控制排出的轻液在35-45%之间，排出的轻液后，再微波15min后，进行 第二次离屯、，第二次离屯、所得的轻液即为憐脂溶液，将两次离屯、的所得的浓液混匀；
[0030] (5)将步骤4所得的混匀浓液，用稀盐酸调PH值至4. 3-4. 5,操作使混匀浓液获得 最佳沉析点，使蛋白质成雲状大片沉出，很快分层，然后用200目滤布离屯、机脱液，收集滤 渣，滤渣即为脑分离蛋白；
[0031](6)将收集的滤渣，添加为湿滤渣量2-2. 5倍的纯净水，使溶液的浓度在5-8%，用 化0H溶液调PH值为9.0,投入胶体磨将粘结的脑分离蛋白打散均匀，随后添加按分离蛋白 质量4. 5%的膜酶巧OOOu/g)继续匀浆循环，数分钟后检测浆液的PH值，当PH值下降至8. 0 W下时，补碱调PH值至8. 2-8. 5,再循环数分钟再检测浆液PH值，当PH值再下降至7. 5左 右时，再补碱调至8.6,再循环3分钟，将浆液排出； 阳0巧 （7)将步骤（6)得到的浆液送入微波前检测PH值，当PH值小于7. 5时，补碱调PH值至7. 8,进行微波辅助酶解，微波15-20min，控制溫度小于55°C，当酶解液PH值下降 至7. 2时结束酶解，启动微波罐最大微波功率，将酶解液升溫至85°C时，保溫5-lOmin，灭酶 活；
[003引 做将已灭酶活的酶解液排出，酶解液溫度下降小于50°C时，在揽拌条件下，添加 入用15%醋酸溶解1. 5%壳聚糖溶液，调节PH值至4. 8-5. 0,沉析未酶解的脑蛋白、憐脂及 其它大分子杂质；沉析物用200目滤布离屯、过滤，去除沉淀；
[0034] (9)步骤（8)所得的离屯、液，用0.45um中空纤维膜进行微滤，滤液用能拦截分子量 10000化的超滤