一种同时制备d-和l-型叔亮氨酸的方法【
技术领域：
】[0001]本发明属于生物催化领域，特别涉及一种同时制备D-和L-型叔亮氨酸的方法。【
背景技术：
】[0002]L-叔亮氨酸和D-叔亮氨酸是非常重要的非天然氨基酸，是多种药物的中间体。因其侧链是一个叔丁基，有很大的空间位阻，在和其它分子耦联后有利于维持空间构象，同时形成的酰胺键不容易被体内的酶识别降解。目前合成L-叔亮氨酸和D-叔亮氨酸，除化学拆分法，生物催化的工业化方法主要是以叔丁基酮酸为底物，用脱氢酶进行生物还原氨法进行，如《一种制备L-叔亮氨酸的方法》201110202325和《D-叔亮氨酸的一种生物催化制备方法》CN104513839A。有文献报道用固定化亲霉素酰化酶，拆分酰化的混旋叔亮氨酸，但通过发明人的实验表明，固定化亲霉素酰化酶，耐受的底物浓度较低，超过200mM几乎无活性，使用二次后，活性极显著下降。专利《连续化酶法生产L-叔亮氨酸》201010622182，是采用苯乙酰基修饰混旋叔亮氨酸，用固定化的Amano酰化酶在室温进行拆分，酶依赖进口，苯乙酰基修饰的叔亮氨酸在室温条件下溶解度较低，工艺对生产不利。【
发明内容】[0003]本发明的目的是提供一种制备混旋D-，L-叔亮氨酸的方法。另外本发明提供一种同时制备D-型叔亮氨酸和L-型叔亮氨酸的方法，上述制备方法其综合成本显著低于生物还原转化方法。[0004]本发明包括以下内容:一种制备混旋D-，L-型叔亮氨酸的方法，包括以下步骤:步骤(1):将正丁醇与1，1-二氯乙烯反应，得到3，3-二甲基丁酸产物；步骤(2):在3，3-二甲基丁酸产物中加入催化剂，同时通入空气和氯气，进行氯代，得到2-氯-3，3-二甲基丁酸；步骤(3):将得到的2-氯-3，3-二甲基丁酸进行氨解反应，最终得到混旋D-,L-叔壳氨酸。[0005]—种同时制备D-叔亮氨酸和L-叔亮氨酸的方法，其特征在于:包括以下步骤:步骤(1):将正丁醇与1，1-二氯乙烯反应，得到3，3-二甲基丁酸产物；步骤(2):在3，3-二甲基丁酸产物中加入催化剂，同时通入空气和氯气，进行氯代，得到2-氯-3，3-二甲基丁酸；步骤(3):将得到的2-氯-3，3-二甲基丁酸进行氨解反应，得到混旋D-，L-叔亮氨酸；步骤(4):用乙酰氯或氯乙酰氯修饰步骤(3)中所述的混旋D-，L-叔亮氨酸，对得到的乙酰化D，L-叔亮氨酸或氯乙酰化的D，L-叔亮氨酸利用L-氨基酰化酶进行拆分；步骤(5):将拆分回收得到的乙酰化的D-叔亮氨酸或氯乙酰化的D-叔亮氨酸去酰化，结晶得到D-叔亮氨酸；将拆分回收得到的乙酰化的D-叔亮氨酸或氯乙酰化的D-叔亮氨酸进行消旋，再用L-氨基酰化酶进行拆分，得到L-叔亮氨酸。本发明由于采用了低成本的正丁醇与1，1-二氯乙烯作为起始原料，得到的D-和L-叔亮氨酸成本远低于生物还原转化方法。[0006]进一步地，L-氨基酰化酶为L-热稳定氨基酰化酶。关于L-热稳定氨基酰化酶的制备方法可参见AthermostableL-aminoacylasefromThermococcuslitoralis:cloning,overexpress1n,characterizat1n,andapplicat1nsinb1transformat1ns.Extremophiles.2002Apr;6(2):111-122。[0007]本发明为克服苯基衍生物酰化叔亮氨酸溶解度低的不足，采用乙酰氯或其衍生物修饰叔亮氨酸，避免苯基导入对酰化叔亮氨酸溶解的不利。同时采用L-热稳定氨基酰化酶在较高温度下进行拆分，进一步提高酰化叔亮氨酸的溶解度，可实现高效率的生物催化。[0008]由于用氯乙酰氯修饰D-，L-叔亮氨酸，并在较高的温度下，如70-80°C，用L-热稳定氨基酰化酶进行拆分，有效的增加了底物的浓度，实现了高效率拆分。[0009]作为优选，当正丁醇与1，1-二氯乙烯反应，反应体系的温度在0_2°C，反应时间为3小时。[0010]作为优选，步骤(2)在3，3-二甲基丁酸产物中加入催化剂，所述催化剂为红磷。[0011]本发明还提供一种制备L-叔亮氨酸的方法，包括以下步骤:步骤(1):将正丁醇与1，1-二氯乙烯反应，得到3，3-二甲基丁酸产物；步骤(2):在3，3-二甲基丁酸产物中加入催化剂，同时通入空气和氯气，进行氯代，得到2-氯-3，3-二甲基丁酸；步骤(3):将得到的2-氯-3，3-二甲基丁酸进行氨解反应，得到混旋D-，L-叔亮氨酸；步骤(4):用乙酰氯或氯乙酰氯修饰步骤(3)中所述的混旋D-，L-叔亮氨酸，对得到的乙酰化D，L-叔亮氨酸或氯乙酰化的D，L-叔亮氨酸利用L-氨基酰化酶，进行拆分；步骤(5):将拆分回收得到的乙酰化的D-叔亮氨酸或氯乙酰化的D-叔亮氨酸进行消旋，再用L-氨基酰化酶进行拆分，得到L-叔亮氨酸。[0012]本发明的有益效果为:本发明可同时制备二种构型的手性叔亮氨酸，从经济效益上讲，成本显著低于用生物还原法分别制备D-和L-叔亮氨酸。目前市场上D-叔亮氨酸的价格是L-叔亮氨酸的3倍。L-叔亮氨酸的市场规模远大于D-叔亮氨酸。本发明可以将酶催化后回收的氯乙酰氯D-叔亮氨酸进行消旋，再循环拆分，可以只得到L-叔亮氨酸。由于合成的D-和L-叔亮氨酸成本非常低，其综合成本依然低于生物还原转化方法。【具体实施方式】[0013]下面以实施例来具体说明本发明，但不以任何形式限制本发明。[0014]实施例1:1升(10.9摩尔)正丁醇溶于2.3升浓硫酸，在0°C左右的条件下，慢慢滴加1，1-二氯乙烯964ml(12摩尔)，反应过程中，控制反应体系的温度在0-2°C，滴加完毕，反应3小时。将反应液倒于碎冰上，用4升正己烷提取产物三次，回收溶剂，产物用浓盐酸水解，用苯提取产物，回收溶剂得到3，3-二甲基丁酸(1.14公斤，90%收率)。将产物加入少量红磷做催化试剂，在130°C，同时通入空气和氯气，反应完全，通空气赶去多余的氯气，减压蒸馏(收集102-109。。/1mmHg)，得到2-氯-3，3-二甲基丁酸(1.31公斤，89%收率)，氯代物溶于浓氨水(13M)，在50°C保温16小时，液相检测氨基接近完全(小于2%)，赶去多余的氨后，浓缩干，用乙酸在100°c溶解氨基酸，过滤除去氯化铵。蒸馏回收乙酸，得到D，L-叔亮氨酸(1.06公斤，93%得率)。[0015]实例2混旋的叔亮氨酸溶于水，加入氢氧化钠调节到pH=10，控制温度在0°C，慢慢滴加乙酰氯，同时氢氧化钠控制PH，直到反应液茚三酮检测不显当前第1页1 2