一种谷氨酸脱羧酶突变体及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种谷氨酸脱羧酶突变体及其制备方 法和用途。
【背景技术】
[0002] 谷氨酸脱駿酶(glutamatedecarboxylase，简称GAD;E(^4.1 · 1 · 15)以磷酸吡咳酸 (PLP)为辅酶，能专一1性地催化L-谷氨酸脱羧合成γ-氨基丁酸（γ-aminobutyrate，GABA) 的酶。GABA广泛存在于动物、植物和微生物中，是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，在哺乳 动物中枢神经系统中具有抑制过度兴奋、解除神经紧张等生理功能。此外，GABA具有预防血 管硬化、延缓衰老、修复皮肤、降血压、镇静安神、改善睡眠和记忆力等多种重要的生理功 能，被广泛应用于医药卫生、功能食品和动物饲料等行业。2009年，我国卫生部正式批准 GABA为"新资源食品"。
[0003]在工业生产过程中，良好的热稳定性是理想的生物催化剂所应具备的特征之一。 工业生物催化过程中酶不仅处于不断"消耗"的过程，而且操作过程中会有针对性地采用更 高的温度，以提高反应速率，增加底物溶解度，降低体系粘度等，因此对酶的热稳定性提出 了更高的要求。细菌中GAD酶在50°C以上极易失活，这严重制约GAD在工业生产中的应用。
[0004] 本课题组前期筛选到一种生产γ-氨基丁酸的短乳杆菌(Lactobacillusbrevis) CGMCCNO. 1306，对该菌株的GAD基因进行克隆，构建重组质粒pET28a( + )-GAD1407，转化到 大肠杆菌BL21(DE3)中，实现了可溶性表达（申请号201010567447.9的专利文献）。但是，实 验表明谷氨酸脱羧酶在55°C下的半衰期仅为30.9min，非常不利于GAD在GABA生物制备中的 应用，其耐热性稳定性有待进一步提尚。
[0005] 定点突变(site-directedmutagenesis)是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法 向目的DNA片段(基因组或质粒）中引入特定碱基对的技术(包括碱基的添加、删除、点突变 等），通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，可迅速、高效的提高 DNA所表达目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
[0006]大量研究表明，蛋白质分子中引入脯氨酸(Prolinetheory)可以降低蛋白质去折 叠的骨架熵，增加蛋白质的刚性，显著提高蛋白质的热稳定性。但是蛋白质的热稳定性受诸 多因素的影响，因此并非所有的脯氨酸替换都能提高蛋白质的热稳定性，只有在合适的位 点进行脯氨酸替换才能真正改善其热稳定性。
[0007] 公告号为CN103031322B的专利文献公开了一种谷氨酸脱羧酶热稳定变体G311P 基因，其核苷酸序列在第311位有定点突变。公告号为CN103031323B的专利文献公开了一 种谷氨酸脱羧酶热稳定变体G56P基因，其核苷酸序列在第56位有定点突变。研究发现，此位 点突变后得到的变体基因编码的谷氨酸脱羧酶的热稳定性有所增强。通过在编码野生GAD 酶基因基础上进行定点突变，提高了其对应变体酶在在60°C和70°C下的热稳定性。随着酶 热稳定性的提高，在工业生产过程中可以采用更高的操作温度，以提高反应速率、增加底物 溶解度，有利于利用该酶通过生物转化生产GABA。
[0008] Haruyuki Atomi等（Journal of Bacteriology，2014,196)报道嗜热古细菌 Thermococcus kodakarensis GAD的最适反应温度达到80°C，该酶在80°C和90°C的半衰期 分别为l〇h和5.5h。应用同源比对策略，对热稳定性差的野生型蛋白质进行改造将是提高蛋 白质热稳定性的有效手段。
【发明内容】
[0009] 本发明根据与嗜热古细菌(Thermococcus kodakarensis)GAD氨基酸序列的比对 信息，采用定点突变的方法在短乳杆菌GAD对应的氨基酸位点引入脯氨酸残基，通过理性设 计提高GAD的热稳定性，获得的突变体比野生型GAD具有更好的热稳定性，提高了GAD在工业 上的应用价值。
[0010] 一种谷氨酸脱羧酶突变体，氨基酸序列如SEQIDN0.2所示。
[0011] 本发明研究的基础是来自短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)CGMCCNO.1306的 GAD1407基因。本发明提供的谷氨酸脱羧酶突变体氨基酸序列的第364位由甘氨酸G突变为 脯氨酸P，该突变体(G364P)的半失活温度(T5Q15)为61.6°C，比野生型酶提高2.5°C;在55°C 下的半衰期(ti/2)为45.4min，比野生型酶延长14.5min。
[0012] 本发明提供了编码所述谷氨酸脱羧酶突变体的基因。本发明将编码野生型谷氨酸 脱羧酶第364位甘氨酸的密码子GGG替换为编码脯氨酸的CCG，该突变体的核苷酸序列如SEQ IDNO. 1所示。本发明还提供了包含所述基因的表达单元、重组质粒和转化子。
[0013] 作为优选，所述表达单元的启动子为T7启动子、lac启动子或araBAD启动子。在这 些启动子的作用下，谷氨酸脱羧酶的突变酶可以直接在大肠杆菌宿主细胞中实现胞内可溶 表达。
[0014]作为优选，所述重组质粒的原始载体为质粒pET28a( + )。
[0015]作为优选，所述转化子的宿主细胞为大肠杆菌细胞。
[0016]本发明还提供了一种谷氨酸脱羧酶突变体的制备方法，包括以下步骤：
[0017] (1)将来自嗜热古细菌(Thermococcuskodakarensis)的谷氨酸脱羧酶的氨基酸 序列与野生型谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列进行比对，选择来自嗜热古细菌(Thermococcus kodakarensis)的谷氨酸脱羧酶中脯氨酸所对应的野生型谷氨酸脱羧酶氨基酸位点为突变 位点；
[0018] (2)针对所述突变位点替换为脯氨酸设计定点突变引物，以野生型谷氨酸脱羧酶 基因为模板，进行PCR扩增，扩增产物转化至宿主细胞，表达获得定点突变体；
[0019 ] (3)从所有突变体中筛选获得热稳定性最高的酶突变体。
[0020]该方法可有效增加突变成功的概率，降低筛选工作量，提高实验效率。采用该方法 获得的突变体比野生型GAD具有更好的热稳定性，从而证明了本发明通过同源比对策略选 择突变位点的筛选方案是可行的。
[0021 ]作为优选，所述野生型谷氨酸脱羧酶分离自短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)。 [0022] 本发明对短乳杆菌GAD氨基酸序列与嗜热古细菌(Thermococcuskodakarensis) GAD氨基酸序列对比，引入脯氨酸的突变位点分别为M70、K89、S162、A224、A242、A261、G277、 ￥284、￥306、￥323、6364、6372^427，采用?〇?定点突变的方法对上述位点进行突变，获得突 变酶。通过测定半失活温度(T5Q15)和半衰期(t1/2)对突变酶的热稳定性进行表征，最终获得 一种GAD热稳定性提高的突变体(G364P)。
[0023]作为优选，制备核苷酸序列如SEQIDNO. 1的GAD突变体的定点突变引物为：
[0024] G364P-F:5 '-ATCGCTCACTAAATTACCGGGCTTTTCCCTCATTAAT-3 '；
[0025] G364P-R:5 '-TAATGAGGGAAAAGCCCGGTAATTTAGTGAGCGATTTC-3 '。
[0026]本发明还提供了所述谷氨酸脱羧酶突变体在催化L-谷氨酸或其钠盐生成γ-氨基 丁酸中的应用。
[0027] 本发明具备的有益效果:本发明与嗜热古细菌(Thermococcuskodakarensis)GAD 氨基酸序列比对，采用定点突变的方法在在短乳杆菌GAD对应的氨基酸位点引入脯氨酸残 基，该方法有效提高正突变概率，节省时间，提高实验效率及可行性，并筛选得到热稳定性 优于野生酶的突变酶，该方法能为其它酶的热稳定性改造提供借鉴和应用。该突变酶在催 化L-谷氨酸或其钠盐生成γ-氨基丁酸的过程中具有更好的热稳定性，有利于GABA的工业 化生产。
【附图说明】
[0028] 图 1 为野生酶GAD(gi| 2953880)与嗜热古细菌ThermococcuskodakarensisGAD (giI5716007)的氨基酸序列比对图。
[0029] 图2为质粒pET28a( + )_gad的基因图谱。
[0030]图3为定点突变原理示意图。
[0031]图4为GAD突变体G364P的SDS-PAGE图，其中l:Proteinmarker;2:40mM咪唑洗脱的 样品；3:100mM咪唑洗脱样品;4:250mM咪唑洗脱样品。
[0032]图5为突变酶G364P和野生酶GAD在pH4.8条件下的半失活温度(T5Q15)，其中A为野 生酶GAD，B为突变酶G364P。
[0033] 图6为突变酶G364P和野生酶的半衰期t1/2,其中A为野生酶GAD，B为突变酶G364P。
【具体实施方式】
[0034]为进一步说明本发明，结合以下实例进行具体说明。
[0035] 本发明研究的基础是来自短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)CGMCCN0.1306中的GAD基因。其中短乳杆菌（Lactobacillusbrevis)CGMCCNO.1306已在中国专利申请 200510049189.4和中国专利申请200510049187.5中公开，由浙江大学保藏在中国普通微生 物保藏管理中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院）。本申请使用的菌株由浙江大学馈 赠。
[0036] 表达宿主菌E.coliBL21(DE3)为浙江大学生物工程研究所保藏；pET28a( + )_GAD1407重组质粒由浙江大学生物保存；FastDigestDpnI限制酶购自Fermentas InternationalInc.Canada;PrimeStarMaxDNA聚合酶购自TaKaRa公司；Ni-NTAagarose 层析介质购自北京全式金生物技术有限公司；质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、DNA Marker、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG)购自生工生物工程(上海)股份有限公司。培养基 为LB培养基，表达培养基为TB(胰蛋白胨12g/L、酵母粉24g/L、甘油4mL/L、KH2P〇4 17mmo1 /L、 K2HP〇4 72mmol/L)培养基，均含有50yg/mL卡那霉素。
[0037] 本发明根据与古细菌(Thermococcusk