r>[0051 ] 2、然后在ddPCR平台上，ddPCR体系配方：2X One-step RT-ddPCR Supermix 10yL， 上游引物，下游引物分别为1此，探针0.5yL，RNase Free dH2〇 3.5yL，阳性模板4yL，总体积 20yL(引物和探针的浓度均为ΙΟμΜ)。做8个复孔，然后生成微滴。
[0052] 3、上PCR 仪扩增，为 50°C 反转录 lOmin; 95°C 预变性 lOmin; 94°C 变性 30sec，50 ~60 °C(仪器自动分布8个温度梯度)退火6〇sec，共40个循环;98°C10min结束反应。上微滴数字 PCR检测仪检测。
[0053] 4、分析结果:根据实验结果选择57~60°C的退火温度。
[0054] 实施例3引物、探针浓度的优化实验
[0055] 设计引物探针浓度均为ΙΟμΜ，组合为F2R2P2,体系配置方法见表2。
[0056] 表2
[0057]
[0058] 然后在ddPCR平台上生成微滴，转移到96孔板内，封铝膜。
[0059] 上PCR仪扩增，PCR的扩增程序为50°C反转录10min;95°C预变性10min;94°C变性 30sec，60°C退火60sec，共40个循环;98°C10min结束反应。上微滴数字PCR检测仪检测。
[0060] 分析结果:根据实验结果选择F2R2+P2引物探针配方，选择引物分别为1.8yL，探针 为0.8yL。
[0061 ]实施例4PCR扩增升降温速度的优化实验
[0062] 1、然后在ddPCR平台上，引物探针组合F2R2+P2(浓度为ΙΟμΜ)，用ddPCR体系配方： 2X One-step RT-ddPCR Supermix for probes 10yL，上游引物，下游引物分别为1.8yL，探 针为0.8yL，RNase Free dH2〇3.6yL，阳性模板2yL，总体积20yL。每台仪器做4个复孔。然后 生成微滴，转移到PCR小管内。
[0063] 2、在两台同样的PCR仪平台上扩增，为50°C反转录10min;95°C预变性10min;94°C 变性30sec，58°C退火60sec，共40个循环;98°C10min结束反应，一台设置升降温速度设置为 5°C/sec，另一台上设置升降温速度设置为2.5°C/sec，扩增结束后，把PCR小管内的扩增产 物转移到同一块96孔板内，封铝膜，上微滴数字PCR检测仪检测。
[0064] 3、分析结果:根据实验结果分析发现，升降温速度慢的最后检测的微滴数比升降 温速度快的多，扩增效率高，升降温速度慢的阴性微滴和阳性微粒之间的距离分的很开，很 容易区分，升降温速度快的阴性微滴和阳性微粒之间的距离分的不开，不容易区分，故选择 2.5°C/sec升降温速度。
[0065] 实施例5病毒RNA提取
[0066] 取100yL组织样品研磨上清液置1 ·5mL eppendorf管中，加500yL溶液A，混匀，室温 剧烈震荡15s，室温静置5min。加120yL溶液B，小心盖上帽盖，室温剧烈震荡15s，室温放置 5min。12，OOOrpm，4°C，离心15min，可见分为三层，上层水相含RNA。转移水相至一新 eppendorf管，加入等量溶液C(约500yL)，混勾，室温放置15min。12，000rpm，4°C，离心 lOmin，离心后在eppendorf?管边和底部可见有胶样RNA沉淀。洗RNA:弃上清，加 lOOOyL 75% 乙醇（使用前用溶液D加无水乙醇配置而成，_20°C预冷）漂洗沉淀，12000rpm，4°C，离心 5min，弃上清。室温充分干燥RNA沉淀。加15yL RNase Free dH20,即可用于PCR扩增。可以-20°C保存备用。
[0067]实施例6检测猪蓝耳病美洲型经典株病毒的ddPCR方法的建立
[0068] 1、微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒的组装
[0069] 用合适的外包装盒包装以下试剂，贴标签(标示名称、批号、生产日期、有效期等）。
[0070] 溶液A(RNase Free dH20)l支，lmL;溶液B(-步法ddPCR探针法预混液）一支，900μ L;溶液C(探针法ddPCR微滴发生油）一支，7mL;溶液D为ddPCR探针法质控液，3.5mL;溶液Ε (阳性对照）一支，40yL;溶液F(阴性对照）一支，40yL;使用基因组RNA为阳性模板，使用 Tris-EDTA缓冲液(0.01M pH8.0)稀释后冷冻保存。将检验合格的阳性对照制剂按400yL定 量分装。使用RNase Free dH20为阴性对照。
[0071] 上述一步法ddPCR探针法预混液其900yL的配方为：500yL的2乂〇1^-8七6?1?1'-ddPCR Supermix for probes，上、下游引物分别为90yL，特异探针为40yL，引物和探针的浓 度均为lOyIVLRNase Free dH2〇 180yL〇
[0072] 使用时，在18yL的ddPCR探针法预混液中加入2yL的RNA模板，得到20yL的ddPCR反 应液，用于制备微滴。
[0073] 2、ddPCR方法的建立
[0074] (1)制备ddPCR反应液，总体积20yL。向PCR扩增管中加入下列反应物：
[0075]
[0076] 空白对照：以RNase Free dH2〇代替模板，同样条件下扩增。
[0077] (2)取微滴发生卡置于卡托中固定，将20yL反应液加入到微滴发生卡中间一排的8 个孔内，不足8个样品时用20yL IX溶液D补足，建议使用8通道20yL排枪和20yL枪头（不能 用200uL枪头），加样时枪头接近孔一侧底部，与侧壁呈大约15°角，缓慢打出液体，打出一部 分后慢慢提升枪头位置再打出余下液体，不要将枪按至超过第一档位置以免引入气泡。 [00 78] (3)在微滴发生卡最底下一排8个孔中各加入70yL微滴生成油，同样不能有空着的 孔。
[0079] (4)盖上胶垫，注意两边的小孔都要钩牢。
[0080] (5)将以上卡托轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴，注意仪器上指示 灯状态，一般2分钟之内完成。
[0081 ] (6)微滴生成于微滴发生卡最上面一排孔内，建议使用8通道排枪和200yL枪头小 心缓慢吸取，调整吸取体积为40此，将卡托放平，枪头以与孔壁呈30~45°角放入，轻触孔 底，约5秒吸取40uL，再同样缓慢地打入96孔板相应位置孔内（约5秒），枪头贴近孔壁接近孔 底，注意封上盖以防油挥发，每次弃去已使用过的微滴发生卡和胶垫。
[0082] (7)转移油滴进入96孔板内完成后，用预热好的PX1热封仪对其进行封膜(膜亮面 朝上，暗面向下），推荐的运行程序为：180°C，10s，一般无需颠倒方向二次封膜；
[0083]封好膜之后应该在30分钟内进行PCR反应，或者放于4°C冰箱4小时之内进行PCR， 可在任意一台96孔PCR仪上完成，注意升降温速度< 2.5°C/s。推荐反应条件：
[0084]
[0086] (8)将之前完成PCR的96孔板放入plate holder中组装好，注意板斜角方位，组装 好之后轻轻地平稳放入微滴读取仪中。
[0087] (9)打开QuantaSoft软件，建议每次实验之前做一次系统清洗，若一周以上未使用 建议先做一次填充油路再做系统清洗。之后对96孔板中样品信息进行设置，主要是提供实 验名称、实验类型以及探针信息等，完成后即可运行仪器，结束后结果会被自动分析，人工 核实后保存结果。
[0088] 4、结果分析和判定
[0089]本发明试剂盒检测结果的判定方法为：（1)阳性对照:20±2个拷贝；（2)阴性对照： 〈1个拷贝；待测样本结果判定：（1)阳性:标本检测结果2 1个拷贝。（2)阴性:标本检测结果〈 1拷贝。
[0090] 实施例7特异性检验
[0091] 用制备的试剂盒分别检测猪健康细胞培养物，猪圆环病毒，伪狂犬病病毒，猪细小 病毒，猪传染性胃肠炎病毒各10份，结果全为阴性;检测猪猪蓝耳病美洲型经典株病毒感染 的组织与细胞培养物各10份，结果全为阳性。
[0092] 以上检测结果证明了本发明的试剂盒特异性好、灵敏度高、可直接定量，检测方便 快捷、结果准确可靠。
[0093] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型经典株的特异性引物和探针组合，其 特征在于，包括1对特异性引物和1条与引物对配合使用的特异探针，其核苷酸序列分别为： F：TGGTTTCTCTCTGGCTTTTAGGTC R：GTAGGTTCCATCTGGTGCGGT P：FAM-TTGCTGGTCTCGTCACCCCCTAT-BHQ1〇2. 权利要求1所述的特异性引物和探针组合在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型经 典株检测试剂盒或检测试剂中的应用。3. -种含有权利要求1所述特异性引物和探针组合的试剂盒。4. 如权利要求3所述的试剂盒，其为微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒。5. 如权利要求4所述的试剂盒，检测试剂包括无RNA酶的蒸馏水，一步法ddPCR探针法预 混液，探针法ddPCR微滴发生油，质控液，阴性对照和阳性对照。6. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有猪蓝耳病美洲型经典 株病毒基因组RNA的提取液，阴性对照为无RNA酶蒸馏水。7. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述一步法ddPCR探针法预混液其900μ1的 配方为：500yL的2ΧOne-stepRT-ddPCRSupermixforprobes，上、下游引物分别为90yL， 特异探针为40yL，引物和探针的浓度均为ΙΟμΜ，以及无RNase酶蒸馏水180yL。8. 如权利要求4-7任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的工作程序为： (1) 配制ddPCR反应液;ddPCR反应液20μ1配方为:一步法ddPCR探针法预混液18μ1，待测 样品RNA模板为2μ1; (2) 制备微滴，然后将微滴转入PCR板，于PCR仪中进行扩增； (3) 将完成PCR扩增的PCR板放入微滴分析仪中，检测微滴，分析数据，显示检测结果。9. 如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，步骤（2)中PCR的扩增程序为50°C反转录 lOmin; 95°C预变性lOmin; 94°C变性30sec，57 ~60°C退火 60sec，共40个循环；98°C10min结 束反应，每步都设置2.5°C/sec的降温速度。10. 权利要求3-9任一所述的试剂盒在猪疫病检测和预防中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型经典株的特异性引物和探针组合，包括1对特异性引物和1条与引物对配合使用的特异探针。本发明还提供一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型经典株的检测试剂盒，其具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、可直接定量，无需标准曲线、操作简便等优点，可以在疫情预爆发前便于在早期内确定疫病，做好预防，从源头控制疫情。
【IPC分类】C12Q1/70, C12N15/11, C12R1/93, C12Q1/68
【公开号】CN105483294
【申请号】CN201610069032
【发明人】陈晨, 翟新验, 吴佳俊, 原霖, 张硕, 韩焘, 周智, 倪建强, 刘颖昳, 訾占超, 徐琦, 李硕, 王静, 马付坤
【申请人】北京佰鸥创投生物科技有限公司, 中国动物疫病预防控制中心
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2016年2月1日