Prrsv美洲型经典株数字pcr绝对定量检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及试剂盒检测技术领域，具体的说涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒美 洲型经典株数字PCR绝对定量检测方法和检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种以怀孕母猪繁殖障碍、尤其哺乳仔猪呼吸困难为特征的高度接触 性传染病。本病在1987年首次暴发于美国，随后在加拿大、欧洲与亚洲相继出现，目前已经 在世界范围内流行，每年造成巨大的经济损失。我国在1995年首次出现PRRS，随后迅速蔓 延。2006年在我国全面暴发了体温高、发病率高、死亡率高为主要临床特征的猪"高热病"， 而导致该病的病原是较之前在国内流行的经典PRRSV发生变异的高致病性猪繁殖与呼吸综 合征病毒(highly pathogenic PRRS，HP-PRRS)。目前为止，PRRSV有两种型，欧洲型和美洲 型，而美洲型又分为两种亚型，经典美洲株和高致病性美洲株，三种亚型毒株在基因序列上 存在一定差异。我国国内主要流行的为美洲型毒株，而欧洲株在国内也偶有发现，因此在临 床上需要一种能够快速诊断PRRSV美洲型经典株的检测方法。
[0003] 传统的PRRSV检测方法主要包括病毒的分离与鉴定、免疫过氧化物酶单层实验 (IPMA)、间接免疫荧光实验（IFA)和间接酶联免疫吸附实验（间接ELISA)等。目前最常用核 酸检测方法有反转录-聚合酶链反应实验(RT-PCR)和荧光RT-PCR(Realtime RT-PCR)等实 验。传统的PRRSV检测方法存在需要使用高成本仪器设备，试验所需时间较长等不足。RT-PCR和Real time RT-PCR虽然较之以往方法具有特异性更强、灵敏度高、重复性好，且自动化 程度高等特点，但是上述方法均只能实现定性和半定量的检测，无法对病毒核酸进行精确 定量，在灵敏度和敏感性特异性上仍存在一定的局限性。
[0004] 数字化PCR(Digital PCR，dPCR)的概念早在 1999年就由Bert Vogelstein采用并 发表相关文献，其初衷是为了能够从临床样品（如尿液、淋巴液、血浆、粪便等)大量的正常 体细胞中检测出微量的突变细胞，但由于当时能用于稀释样品的耗材只是384孔板，因此还 不能非常好地体现数字PCR的核心理念--"无限稀释"（terminal dilution) jio-Rad公 司的QX200系统核心的微滴化技术能够将一份样品分成20,000个纳升级的微滴，本质上将 传统定量PCR的一个test变成20,000个test，大大提高了核酸序列检测的灵敏度和精准度， 是对"无限稀释"这一概念的完美演绎，其方法原理可称为微滴式数字化PCR(Dr 〇plet Digital PCI^ddPCRhQXSOOddPCR系统包括两台仪器:微滴发生器和微滴分析仪，及其相关 的耗材。微滴发生器将每个样品分成20,000个均匀的纳升级微滴，其中每个微滴或不含待 检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。每个微滴都作为一个独立的PCR反应 器。随后微滴转移至96孔PCR板上，开展终点PCR扩增。采用微滴分析仪(droplet reader)逐 个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0,最终根 据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。 与传统的定量PCR相比，数字PCR的精确度和灵敏度更佳。利用微滴式数字PCR技术，研究人 员可以检测稀有突变，精确测定拷贝数变异，并对基因表达进行绝对定量。癌症相关突变因 浓度较低，往往逃过检测。凭借QX200系统的高灵敏度，研究人员如今可检测浓度低至1/1， 000,000的靶分子。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、可实现 精确定量的数字PCR检测方法和数字PCR检测试剂盒，用于猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型 经典株的快速精确检测。
[0006] 本发明的第一个技术目的是提供用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型经典 株的特异性引物和探针组合，包括1对特异性引物和1条与引物对配合使用的特异探针，其 核苷酸序列分别为：
[0007] F：TGGTTTCTCTCTGGCTTTTAGGTC
[0008] R：GTAGGTTCCATCTGGTGCGGT
[0009] P：FAM-TTGCTGGTCTCGTCACCCCCTAT-BHQ1〇
[0010] 本发明提供了上述的特异性引物和探针组合在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒美 洲型经典株检测试剂盒或检测试剂中的应用。
[0011] 本发明提供了一种含有上述特异性引物和探针组合的试剂盒。所述试剂盒优选为 微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒。
[0012] 本发明的另一技术目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度和精确 度的、操作简单的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型经典株的检测试剂盒，其中包含1对 特异性引物和1条与引物对配合使用的特异探针，其核苷酸序列分别为：
[0013] F：TGGTTTCTCTCTGGCTTTTAGGTC
[0014] R：GTAGGTTCCATCTGGTGCGGT
[0015] P：FAM-TTGCTGGTCTCGTCACCCCCTAT-BHQ1〇
[0016] 还包含病毒总RNA提取试剂和检测试剂;所述检测试剂包括无 RNA酶的蒸馏水，一 步法ddPCR探针法预混液，探针法ddPCR微滴发生油，质控液，阴性对照和阳性对照。
[0017] 所述病毒总RNA提取试剂含有TRIzoL、氯仿或异戊醇、异丙醇。所述一步法ddPCR探 针法预混液其900μ1 的配方为：500yL的2X One-step RT-ddPCR Supermix for probes，上、 下游引物分别为90此，特异探针为40yL，引物和探针的浓度均为ΙΟμΜ，以及无 RNase酶蒸馏 水180yL。
[0018] 所述阳性对照为含有猪蓝耳病美洲型经典株病毒基因组RNA的提取液，阴性对照 为无 RNA酶蒸馏水。
[0019] 本发明的试剂盒其工作原理是采用微滴式数字化PCR(ddPCR)，所述试剂盒的工作 程序为：
[0020] (1)配制ddPCR反应液;ddPCR反应液20μ1配方为：一步法ddPCR探针法预混液18μ1， 待测样品RNA模板为2μ1;
[0021 ] (2)制备微滴，然后将微滴转入PCR板，于PCR仪中进行扩增；
[0022] (3)将完成PCR扩增的PCR板放入微滴分析仪中，检测微滴，分析数据，显示检测结 果。
[0023]在本发明的一个实施例中，制备微滴的方法是采用Bio-Rad公司的QX200系统中的 微滴发生器，按照说明书操作进行微滴制备即可。
[0024] 其中，步骤(2)中PCR的扩增程序为50°C反转录10min;95°C预变性10min;94°C变性 30sec，57~60°C退火60sec，共40个循环;98°C10min结束反应，每步都设置2.5°C/sec的降 温速度。
[0025]本发明提供的试剂盒在猪疫病检测和预防中的应用也属于本发明的保护范围。 [0026]本发明试剂盒检测结果的判定方法为：（1)阳性对照:20±2个拷贝；（2)阴性对照： 〈1个拷贝；待测样本结果判定：（1)阳性:标本检测结果2 1个拷贝。（2)阴性:标本检测结果〈 1拷贝。
[0027] 本发明摸索了引物和探针的浓度，找到了最适微滴式数字PCR的引物和探针的工 作浓度。摸索了 PCR反应过程中最适的升降温速度，以提高数字PCR的扩增效率，使本发明方 法能够与BI0-RAD公司的QX200系统相结合。
[0028] 本发明试剂盒具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、可直接定量，无需标 准曲线、操作简便等优点，可以在疫情预爆发前便于在早期内确定疫病，做好预防，从源头 控制疫情。具体表现在：
[0029] (1)高特异性:本发明根据猪蓝耳病美洲型经典株病毒衣壳蛋白基因组序列设计 了特异性引物和特异探针，其特异性极高，且非常稳定，保证了反应的顺利进行，进一步确 保猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型经典株检出的特异性；
[0030] (2)高灵敏度:检测浓度低至1/1，000,000的靶分子;能够直接定量待测样本中的 拷贝数；
[0031] (3)低模板：由于检测的灵敏度很高，可以检测出低丰度的目的基因，所以可以降 低模板用量，稀释模板浓度，对于一些珍贵，稀少的样本可以有更多的研究。
[0032] (4)可直接定量，无需标准曲线：与传统的PRRSV检测方法相比，该试剂盒可直接定 量，无需标准曲线，操作简便、准确无误，有效预防猪疫病的大规模爆发。
【具体实施方式】
[0033]以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0034]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 [0035]实施例1引物及探针的设计与筛选
[0036] 1、本发明引物、探针设计:根据Genbank已发表的猪蓝耳病美洲型经典株病毒根据 Genbank已发表的猪蓝耳病美洲型经典株病毒基因组序列KP771778.1，选择N衣壳蛋白为靶 基因，进行适用于ddPCR的特异性引物和探针的设计为靶基因，进行适用于ddPCR的特异性 引物和的设计。
[0037] 本实施例给出了筛选最佳引物的过程，选择用软件设计出的其中几对备选引物进 行筛选，备选引物如下，见表1。
[0038] 表1
[0039]
[0040] 2、引物的筛选
[0041] (1)引物随机配为四对:F1R1、F1R2、F2R1、F2R2;
[0042] (2)然后用染料法做荧光定量PCR，PCR体系配方：2Xone-step SYBR Green Supermix 10yL，上游引物，下游引物分别为lyL，RNase Free dH2〇 3yL，阳性模板5μΙ^ΡΟ? 的扩增程序为50°C反转录10min;95°C预变性10min;94°C变性30sec，60°C退火60sec，共40 个循环;65°C-95°C每5秒升高0.5°C溶解曲线，结束反应。
[0043] (3)结果分析，选择没有非特异性扩增的引物对F2R2。
[0044] 3、探针的筛选
[0045] (1)引物探针的组合为：1、F2R2+P1，2、F2R2+P2
[0046] (2)然后在ddPCR平台上，ddPCR体系配方：2X One-step RT-ddPCR Supermix 10μ L，上游引物，下游引物分别为lyL，探针0.5yL，RNase Free dH20 3.5yL，阳性模板4yL，总体 积20yL(引物和探针的浓度均为ΙΟμΜ)。然后生成微滴。
[0047] (3)上 PCR 仪扩增，为 50°C 反转录 10min;95°C 预变性 10min;94°C 变性 30sec，60°C 退 火60sec，共40个循环;98°C lOmin结束反应。上微滴数字PCR检测仪检测。
[0048] (4)分析结果:根据实验结果选择F2R2+P2引物探针组合。
[0049] 实施例2在ddPCR平台上检测猪蓝耳病美洲型经典株病毒的PCR方法退火温度的优 化。
[0050] 1、选择引物探针的组合为:F2R2+P2。