快速检测猪2型圆环病毒的实时荧光rpa试剂盒、试纸条rpa试剂盒及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测猪2型圆环病毒的试剂盒及其用途，特别涉及一种基于RPA反 应的用于快速检测猪2型圆环病毒的实时荧光RPA试剂盒以及试纸条RPA试剂盒，还涉及二 者在快速检测猪2型圆环病毒中的用途，本发明属于预防兽医学检验领域。
【背景技术】
[0002] 自PCR技术诞生以来已经有三十年了。从经典PCR、实时定量PCR再到现在的数字 PCR，这一技术在不断蜕变却从未淡出我们的视野。但是该技术需要特殊昂贵的热循环仪器 以及熟练的操作人员，费时费力，难以用在现场诊断以及实验条件差的地方。在发展中国家 实验室中，由于PCR实施所需要的基础设备和技术所限，大多数发展中国家仍然集中在使用 传统的试验方法，比如血清学方法、显微镜技术，或者培养以及鉴定传染性以及非传染性疾 病。为了填补传统方法和PCR之间的空缺，新的等温分子诊断技术正在开发，该方法尤其适 用于基础设施、实验设备以及试验技术难于支持使用PCR进行诊断的地方。
[0003] 与常规方法相比较，等温扩增实验具有很高的敏感性和特异性，这些原因促使不 同的公司商业化不同的等温扩增技术，比如，环介导的扩增(LAMP;Eiken，日本），RPA(RPA; Alere,USA and TwistDx,UK)，链置换扩增（strand displacement amplification，Becton Dickson, USA)。在这些技术中，LAMP是使用最为广泛，且最成熟的试验方法。与RPA方法相比 较，LAMP技术具有试验设计比较麻烦(3对引物），特异性相对较弱（能扩增很多条带），时间 仍然相对较长，以及易于污染等不足的地方。
[0004] 英国TwistDx Inc公司开发的重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase 八1]^11;^〇&1:;[011，1^^)被称为是可以替代?0?的核酸检测技术。以此为基础的丁\/151八111|3 :? 核酸扩增产品能够在15分钟内，37°C_42°C之间进行核酸检测。现在使用最多的、最为成熟 的为进行实时监控的体系（如了你丨51八1耶(^^0试剂盒，代31-1:;[1116 1^4)以及基于试纸条的 终点检测（T\vistAmp?nfo试剂盒，Recombinase Polymerase Amplification Assay combined with lateral flow test，LFS RPA)0
[0005] 实时荧光RPA(real-time RPA)试验需要能激发并检测荧光基团的恒温仪器，比如 酶标仪或实时检测的热循环仪。自开发以来，该技术已经被广泛的应用到人类疾病、兽医药 物、食品工业以及农业中，比如用于土拉弗朗西斯菌、细螺旋体、HIV-1DNA、鼠疫杆菌、炭疽 杆菌、天花病毒、B型链球菌、大肠杆菌产生的志贺毒素、中东呼吸综合征冠状病毒、裂谷热 病毒、口蹄疫病毒、牛冠状病毒、埃博拉病毒、苏丹病毒、马尔堡病毒、施马伦贝格病毒、牛病 毒性腹泻病毒、黄热病毒以及戈登病毒等病原的检测。
[0006] 对于试纸条RPA(LFS RPA)试验而言，只要温度能控制在37_42°C之间就行，比如可 以在水浴锅等设置中进行反应，或者直接用人的体温进行加热，随后可以通过侧流层析试 纸条LFS(Hybridetect 2T，Milenia Biotec GmbH,Germany)读取试验结果。自开发以来，该 技术已经被广泛的应用到人类疾病、兽医药物、食品工业以及农业中，比如用于感染性皮下 及造血组织坏死病毒（IHHNV)、恶性疟原虫、洋李痘疱病毒、羌虫、力克次体、隐孢子虫以及 黄热病毒等的检测。与常规方法相比较，该实验具有很高的敏感性和特异性。
[0007] 猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)属于圆环病毒科，圆环病毒属的成员，PCV 是小的、无囊膜的DNA病毒，直径大约为17纳米。根据DNA序列、抗原性以及致病性可将其分 为两个不同的基因型一 PCV1和PCV21CV1被认为不具有致病性，并且在猪肾细胞系(PK-15) 中持续感染。可是，PCV2断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的主要病原，表现为免疫系统损 失，淋巴细胞减少、淋巴结肿大等病变，同时引发其他病原的继发感染，目前已成为严重阻 碍养猪业发展的主要病原之一。进一步来说，PCV2是一种免疫抑制病毒，感染该病毒的猪更 容易被其他病毒或者细菌感染。调查显示，PCV2在猪体内广泛存在。因此，建立一种快速、简 单、特异、敏感的检测方法来检测PCV2对于该病的防控起着关键的作用。
[0008] Zhou等（Zhou，S·，et al.,Loop-mediated isothermal amplification for detection of porcine circovirus type 2.Virol J,2011 ·8:ρ·497·)公开了一种检测猪 2型圆环病毒的环介导等温扩增法。通过LAMP的扩增结果表明，该方法能够出现很多扩增条 带，因此该方法存在非特异性扩增，而且该方法需要设计三对引物来进行扩增，因此增加了 实验设计的难度，并且增加了其与其他检测平台相结合的难度。并且检测温度较高(63°C)， 检测时间较长(60min)。并且需要核酸电泳对扩增产物进行检测，增加了污染的可能性。
[0009] Yang等（Yang，Z.Z.，et al·，Detection of PCV2DNA by SYBR Green I-based quantitative PCR. J Zhejiang Univ Sci B，2007 · 8(3): p · 162-9 ·)公开了一种基于SYBR green I的用于检测PCV2DNA的实时荧光定量PCR法。该方法需要复杂的试验设备以及熟练 的操作人员，该方法需要较长的试验时间（大约1.5h)。由于SYBR Green I非特异性结合所 有的双链DNA，因此，该方法的特异性相对较差。
[0010] 本发明针对猪2型圆环病毒的0RF2基因，建立并评估了基于荧光探针的RPA(real-time RPA)检测试剂盒以及基于试纸条的LFS RPA检测试剂盒以实现快速检测猪2型圆环病 毒的目的，据我们所知，国内外尚无建立这样的试剂盒用于检测猪2型圆环病毒。
【发明内容】
[0011] 本发明所要解决的技术问题是提供一种能快速、简单、特异的鉴定猪2型圆环病毒 的检测方法及试剂盒。
[0012] 为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
[0013]本发明发明人针对猪2型圆环病毒的0RF2基因设计引物和探针。同时通过对来自 于 GenBank中的 KR559725.1、KR559695.1、KM455975.1、KP768481.1、JN181905.1、 JN181902.1、KF850461.1、KC620515.1、KF035059.1、KF951567.1、KF951570.1、ΚΜ624031.1 和JQ002672.1的0RF2基因同源序列进行比对分析，进一步确定了猪2型圆环病毒0RF2基因 的保守区域，针对该区域设计引物和探针，以期能够检测到尽可能多的猪2型圆环病毒。所 有的引物和探针都由生工生物(上海，中国）合成。本发明分别设计合成了三对上游引物和 三对下游引物，通过对引物与探针组合进行扩增效果评价，最终将其中一对能够产生最强 的扩增信号的引物对与探针组合应用到本发明中。针对实时荧光RPA(real-time RPA)与试 纸条RPA(LFS RPA，Recombinase Polymerase Amplification Assay combined with lateral flow test)的不同检测特点，本发明分别设计了用于猪2型圆环病毒检测的实时 荧光RPA以及试纸条RPA检测的引物和探针序列，该两种试剂盒针对同一靶标序列，但引物 和探针的修饰碱基和检测平台不同。
[0014]本发明一种用于快速检测猪2型圆环病毒的实时焚光RPA(real-time RPA)检测试 剂盒，包括有一对引物和一条探针，
[0015]其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：
[0016] 上游引物：5'-AAACCTGTCCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCA-3'（SEQ ID N0.1 所示）
[0017] 下游引物：5'-TTGTATTCCTGGTCGTATATACTGTTTTCGAACGC-3'（SEQIDN0·2所示）
[0018] 探针：5 ' -ATTACTTCCAACCAAACAACAAAAGAAATCAGCTG
[0019] -FAM-dT-G-THF-C-BHQl-dT-GAGACTACAAACTGC-P-3'（SEQIDN0.3K*)
[0020] 其中，FAM-dT表示携带有荧光素基团的胸腺嘧啶核苷酸，THF表示四氢呋喃连接 子，BHQl-dT表示携带有荧光淬灭基团M1Q1的胸腺嘧啶核苷酸，P表示磷酸，用于阻止链的延 伸。
[0021] 在本发明所述的实时荧光RPA检测试剂盒中，优选的，所述试剂盒中还包括水解缓 冲液，醋酸镁以及ddH20。
[0022] 使用本发明所述的实时荧光RPA检测试剂盒检测猪2型圆环病毒，优选的，反应体 系如下：14.75yL的水解缓冲液，1.05yL的ΙΟμΜ上游引物，1.05yL的ΙΟμΜ下游引物，0.075yL 的ΙΟμΜ探针，2yL的病毒DNA模板，4.825yL的ddH20以及1.25yL的280mM醋酸镁；
[0023] 扩增反应在温度设定为37_39°C的实时荧光定量PCR仪中进行，反应时间为20min_ lh，结束后通过Mx3005P软件对结果进行分析。
[0024] 更优选的，扩增反应在温度设定为37°C的实时荧光定量PCR仪中进行，反应时间为 20min，结束后通过Mx3005P软件对结果进行分析。<