的轻链(RK71)、RSVG78 的重链(RH78)、RSVG78 的轻链(RK78)的质粒，并送样 测序。
[0039]测序结果显示单克隆抗体RSVG71的重链、轻链(KAPPA)的核酸序列分别如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示，其相应的重链、轻链(KAPPA)的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3和 SEQ ID N0:4所示；单克隆抗体RSVG78的重链、轻链(KAPPA)的核酸序列分别如SEQ ID N0:5 和SEQ ID NO:6所示，其相应的重链、轻链(KAPPA)的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。
[0040] 实施例2单克隆抗体RSVG71和RSVG78的表达和纯化
[00411用实施例1中获得的含有RSVG71的重链(RH71)的质粒和含有RSVG71的轻链(RK71) 的质粒，以及用含有RSVG78的重链(RH78)的质粒和含有RSVG78的轻链(RK78)的质粒分别转 染293T细胞。先用0pti-MeM(lX)buffer分别稀释质粒和PEI，然后将PEI-Opti-MeM混合物缓 慢加入到质粒-Opti-MeM混合物管中，室温静置20分钟后，再将PEI和质粒混合物加入到细 胞悬液中。转染时细胞浓度为0.25~0.5 X IO6个细胞/ml，每孔细胞的转染使用2.5yg含有 RSVG71重链的质粒+2.5yg含有RSVG71轻链的质粒+IOyg PEI，以及2.5yg含有RSVG78重链的 质粒+2.5yg含有RSVG78轻链的质粒+IOyg PEI。转染结束后在37°C培养48h后收获上清，用 ELISA检测上清。
[0042] 使用rProtein A Sepharose Fast Flow(GE)纯化表达的抗体蛋白。分别收集表达 RSVG71和RSVG78的293T细胞培养物上清，10000rpm，4°C离心10min，取上清，将该上清加入 到已用平衡缓冲液（2OmM磷酸盐缓冲液，15OmM氯化钠 ，pH 7.4)平衡好的rPr〇 t e in A Sephar〇 se Fas t F1 〇w柱上，用同样的平衡缓冲液洗10个床体积，再用洗脱缓冲液（0.1M Gly-HCl缓冲液，pH 2.5)流洗5个床体积，收集前3个床体积，向收集的洗脱液中加入1/10提 及的中和液（1M Tris-HCl缓冲液，pH 9.0)混勾，加入到Amicon Ultra_15Centrifugal FiIters(Merck Millipore)中，5000G、4°C离心20miη，浓缩蛋白，再向Amicon Ultra-15Centrifugal ?：[]^6^中加入上述平衡缓冲液，50006、4°〇离心2〇111；[11，更换新的平衡缓冲 液，重复3次，分别获得浓缩后的RSVG71和RSVG78抗体蛋白，将其分别转到1.5ml离心管中， 取样测定蛋白质含量，然后置于4°C保存。
[0043]分别取纯化的RSVG71抗体和纯化的RSVG78抗体进行电泳，结果如附图1所示，其中 泳道M是标准蛋白；泳道RSVG71是纯化的RSVG71抗体，有两个明显条带，分别是约50KDa的重 链和约22KDa的轻链;泳道RSVG78是纯化的RSVG78抗体，有两个明显条带，分别是约50KDa的 重链和约22KDa的轻链。
[0044] 实施例3 RSV G抗原的表达纯化
[0045] (I)G蛋白表达载体的构建
[0046]首先通过基因工程手段人工合成G蛋白目标序列，在其序列的N端增加6个His，可 以与镍柱中的镍结合，从而可以通过亲和层析进行纯化，并在两端增加 Nhel/Notl两个酶切 位点。将合成的G蛋白DNA片段和表达载体pcDNA3. l-Zeo( + )(Invitrogen公司）均通过NheI/ NotI进行双酶切，回收G蛋白目的片段和表达载体片段，进行连接，转化，通过PCR和酶切方 法鉴定阳性克隆，最后通过测序验证表达载体的正确性。采用碱裂解法大量提取质粒用于 瞬时转染。
[0047] (2)瞬时转染293F细胞
[0048]获得的重组质粒 pcDNA3.1-Zeo( + )_G 转染 293F 细胞。先用 Opti_MeM(lX)buffer 分 别稀释质粒和PEI，然后将PEI-Opti-MeM混合物缓慢加入到质粒-Opti-MeM混合物管中，室 温静置20分钟后，再将PEI和质粒混合物加入到细胞悬液中。转染时细胞浓度为0.25~0.5 X IO6个细胞/ml，每孔细胞的转染使用5yg重组质粒pcDNA3. l-Zeo( + )-G+10yg PEI。转染结 束后在37°C，5 % CO2的培养箱中培养96h后收获上清。
[0049] (3)G蛋白的纯化
[0050] 收集大规模培养的293F细胞上清，离心后采用镍柱进行纯化，镍柱中的镍离子能 够与His标签结合，也能够与咪唑进行结合。首先将样品按一定流速流过镍柱，使得样品中 的G蛋白与镍柱结合，然后加入不同浓度的咪唑，与G蛋白竞争结合镍柱，从而将G蛋白洗脱 下来。取3ml Ni-NTA填装层析柱，用缓冲液l(20mM Tris-HCl pH8.0,0.5M NaCl)平衡6~8 个床体积，流速为2ml/min;将细胞上清12000rpm离心10min，取上清上样，流速为lml/min; 用缓冲液1再洗5个床体积，流速为2ml/min;分别用含10mM、300mM咪唑的洗脱缓冲液进行阶 段洗脱10个床体积，流速为2ml/min，G蛋白的主要洗脱峰出现在300mM咪唑的洗脱条件。经 纯化获得的G蛋白其分子量约为60KDa，如附图2，与理论分子量一致。
[0051 ] 实施例4 RSVG71和RSVG78抗体与抗原G蛋白的ELISA检测
[0052]所用试剂包括：
[0053] PBS( IX):用PBS( 10X)和去离子水配置。
[0054] PBST:PBS( IX)加 Tween-20至终浓度为0 · 05%。
[0055] 封闭液:PBS( 1Χ)+2 % BSA+2 %新生牛血清，现用现配。
[0056] 稀释液:PBST+1 %BSA，稀释抗体用。
[0057] 终止液:将6ml 95%-98%的浓硫酸慢慢加入180ml水中，冷却后备用。
[0058] 一抗:本发明制备得到的RSVG71和RSVG78抗体，稀释成工作浓度为100μg/ml。
[0059] 二抗：Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG(H+L)(购自 Jackson ImmunoResearch)，取I · 5ml的无 RNase水完全溶解后，备用。
[0060] 用?85(1乂）（？!17.4)缓冲液稀释6蛋白作为抗原，使包被抗原溶液的终浓度为2即/^ 1，吸取1〇〇μ1包被抗原溶液加入到96孔板的每孔中，2-8°C包被过夜，用I 3BST清洗5次，然后 每孔加入200μ1封闭液，37°C封闭2h，封闭结束后用PBST清洗5次，每次停留1分钟。
[0061]用抗体稀释液(PBST+1%BSA)将一抗做5倍稀释：即取7个高压灭菌的1.5ml离心 管，每一管加入240μ1的抗体稀释液，从工作溶液中取60μ1 -抗溶液，涡旋震荡混匀后，标记 为1:5稀释，从1:5稀释的溶液中取60μ1放入下一管中，以此类推，分别为：1:5，1:25，1:125， 1:625,1:3125,1:15625,1:78125,分别加到相应的孔中，每孔100μΙ，做两个平行，并设立两 个空白孔用PBST代替一抗，37°C孵育90min，然后用PBST清洗5遍。
[0062] 用抗体稀释液(PBST+1%BSA)将二抗做4000倍稀释，每孔加入100yl，37°C孵育lh， 然后用PBST清洗5遍，加入TMB显色液，100μΙ/孔，室温孵育15min，孵育结束后加 AH2SO4终止 液终止反应。在酶标仪上读取0D450nm读数。
[0063] 将得到的数值以柱形图的形式表示，如附图3。结果显示，RSVG71和RSVG78抗体与G 抗原的结合是特异性的，并且与阴性对照相比，在初始浓度lOOng/ul下差异显著。
[0064]应当理解的是，本发明的上述【具体实施方式】仅仅用于示例性说明或解释本发明的 原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何 修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨 在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修 改例。
【主权项】
1. 一种全人源抗RSV G蛋白单克隆抗体RSVG71，其重链的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所 示，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示。2. -种全人源抗RSV G蛋白单克隆抗体RSVG78,其重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所 示，其轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO :8所示。3. 包含权利要求1或2的抗体的单个重链和/或单个轻链的单域抗体、嵌合抗体、抗体融 合蛋白抗体、抗体/抗体片段-因子融合蛋白或抗体/抗体片段-化学偶联物。4. 权利要求1或2的抗体的抗原结合片段，所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab'）2、5. -种分离的DNA分子，编码权利要求1-3任一项的抗体或权利要求4的抗原结合片段 的核酸序列。6. 权利要求5的核酸序列，其包含SEQ ID NO: 1和/或SEQ ID NO:2的序列。7. 权利要求5的核酸序列，其包含SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6的序列。8. 含有权利要求5-7任一项的核酸序列的载体。9. 含有权利要求5-7任一项的核酸序列或权利要求8的载体的宿主细胞。10. 权利要求9的宿主细胞，其是用权利要求8的载体转化的宿主细胞。11. 权利要求1-3任一项的抗体、权利要求4的抗原结合片段、权利要求5-7任一项的核 酸序列、权利要求8的载体或权利要求9或10的宿主细胞在制备用于预防或治疗RSV相关疾 病的治疗剂中的应用，其中所述RSV相关疾病选自由病毒性肺炎、间质性肺炎、毛细支气管 炎组成的组。12. 权利要求1-3任一项的抗体、权利要求4的抗原结合片段、权利要求5-7任一项的核 酸序列、权利要求8的载体或权利要求9或10的宿主细胞在制备用于检测RSV的检测试剂中 的应用。13. 用于治疗RSV相关疾病的药物组合物，包括治疗有效量的权利要求1-3任一项的抗 体、权利要求4的抗原结合片段、权利要求5-7任一项的核酸序列、权利要求8的载体或权利 要求9或10的宿主细胞，和一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。14. 制备全人源抗RSV G蛋白单克隆抗体的方法，包括如下步骤： (1) 提供表达载体，所述表达载体含有编码权利要求1-3任一项的抗体或权利要求4的 抗原结合片段的DNA分子，以及与所述DNA分子可操作相连的表达调控序列； (2) 用所述表达载体转化宿主细胞； (3) 在适合表达所述抗体的条件下，培养所述单克隆抗体的表达系统； (4) 分离纯化获得所述的单克隆抗体。
【专利摘要】本发明提供特异性结合呼吸道合胞病毒(RSV)的粘附(G)蛋白的全人源单克隆抗体RSVG71或RSVG78，公开了其编码核酸、包含它们的载体或宿主细胞以及它们的制备方法。本发明还公开了全人源的抗RSV单克隆抗体RSVG71或RSVG78在预防和治疗RSV相关疾病中的应用，以及它们在检测RSV中的应用。
【IPC分类】A61K39/42, G01N33/569, C12N15/13, C07K16/10, A61P11/00, A61P31/14, G01N33/577
【公开号】CN105542003
【申请号】CN201610114801
【发明人】戴凯凡, 刘国华, 李蓬飞, 王全英
【申请人】苏州博泰神州生物技术有限公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年3月1日