）：
[0181 ]内参-1的Ct值小于内参-2的Ct值，因为突变发生，对应的WT模板数目减少。
[0182] 判读规则一：Δ Ct_l> Δ Ct-2
[0183] 判读规则二：ACt_2〈8
[0184] 同时，如果Δ Ct_2〈4，则为强阳性;如果4〈 Δ Ct_2〈8，则为弱阳性。
[0185] 双内参判读规则的设计方案，能够有效判别基因突变的存在，提高检测的准确性 和灵敏度，减少漏检率。
[0186] 注：
[0187] Δ Ct-Ι:突变组Ct值减去内参-1组Ct值。
[0188] Δ Ct-2:突变组Ct值减去内参-2组Ct值。
[0189] 2.利用试剂盒中对样品进行桑格测序的试剂对样品进行测序，目的是:一方面辅 助验证ARMS检测结果的准确性;另一方面，重点针对ARMS检测结果为阴性的样本，以发现新 的基因突变，具体步骤为：
[0190] (1)样本DNA提取:采用天根DNA提取试剂盒DP331，并严格按照此试剂盒说明书进 行操作。
[0191] (2)DNA浓度测定:0D260/280比值在1.92.1之间为佳。
[0192] (3)PCR 扩增：
[0193] PCR扩增体系成分：
[0194]
[0196] 注:操作必须严格分区进行，PCR扩增体系配制(模板除外）必须在体系配制专区进 行，而模板的添加需在另一专区进行，不能和其他成分在一个区内进行，避免模板之间的交 叉污染。
[0197] PCR扩增程序：
[0198]
[0199] (4)PCR 产物纯化：
[0200] 纯化酶采用USB ExoSAP-IT PCR Product Cleanup(货号78200)。并严格按照其说 明书进行操作。模板量(PCR产物)为5uL，纯化酶加 2uL。
[0201] (5)测序反应：
[0202] 测序反应体系成分：
[0203]
[0204] 测序反应程序：
[0205]
[0206] (6)测序反应产物纯化上机(ABI 3130XL测序仪）：
[0207] a)加入lyL 125mM EDTA到管底，然后加入lyL 3M NaAc到管底。
[0208] b)加入25yL 100%酒精，封严之后震荡混匀，室温放置15min。
[0209] c)4000-5000rpm离心30min，马上倒置96孔板，离心至350rpm停止离心。
[0210] d)加入35yL 70%酒精，4500rpm 4°C离心15min,马上倒置96孔板，离心至300rpm 停止离心，重复1次。
[0211] e)待酒精挥发之后，加入l〇yL甲酰胺溶解DNA。
[0212] f )95°C变性4min，冰上冷却4min，上机。
[0213]实施例5:试剂盒的灵敏度检测
[0214]取含有EGFR突变基因片断DNA的质粒（由济南银丰医学检验有限公司制备得到）， 配制成突变质粒数目为1000个拷贝、100个拷贝、10个拷贝，作为样品。
[0215] 然后采用实施例4的试剂盒进行检测。
[0216] 结果表明本发明的试剂盒最低能够检测到含量低至10个拷贝的突变。
[0217] 实施例6:临床样本检测
[0218] 在检测者知情同意的情况下，选取100例检测样本，采用本发明实施例4的试剂盒 进行检测。
[0219] 检测结果表明，所检测的100例样本中有6例发生了基因突变。
[0220]作为对比，所有样本同时采用专利CN104818318A中提供的检测试剂盒和检测方法 进行检测，结果表明：发生基因突变的有4例。采用本实施例试剂盒的检测出的阳性样本，而 采用专利CN104818318A中提供的检测试剂盒未检测出基因突变的，经测序证明，其为阳性 样本。
[0221] 所有的样本均经过直接测序检测验证，结果与采用本发明的试剂盒的分型检测结 果完全一致，说明本发明的试剂盒及其检测方法准确、有效，特异性强，检测结果无假阳性 和假阴性。部分样本的ARMS荧光定量检测结果和测序结果分别如图5-图20所示。
[0222] 另外，本发明试剂盒还大幅的降低了检测的成本，一般的双标探针合成价格约为 1000元/条，使用工作浓度〇.2umol/L，一般能做3,000-5,000个反应；而本发明所采用的 SYBR-Green-I染料100uL价格为600元左右(购自Invitrogen公司），按照终浓度1:30000-1: 50000使用，能够做150，000-250，000个反应。检测成本显著降低。
【主权项】
1. 一种检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的ARMS引物，其特征在于，所述ARMS引物的序 列如SEQIDN0·1至SEQIDN0·31所示。2. 权利要求1所述的ARMS引物在制备检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的试剂盒中的应 用。3. -种检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于，包括:权利要求1所述 的ARMS引物和用于扩增第一内参的引物； 所述第一内参为GAPDH基因，用于扩增第一内参的引物序列如SEQIDN0.32和SEQID NO. 33所示。4. 如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中，还包括如下物质中的至少一 种:DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液、SYBR-Green-I和4种dNTP混合物。5. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为Taq HS DNA聚合酶。6. 如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中还包括用于对样品进行桑格测序 的试剂，所述试剂中包含用于扩增EGFR、KRAS和BRAF基因中任意一个、两个或全部的一个或 多个外显子区域的扩增引物对。7. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增引物对包括：用于扩增EGFR基因 的外显子18的区域的扩增引物对，如SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35所示； 用于扩增EGFR基因的外显子19的区域的扩增引物对，如SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.37 所示； 用于扩增EGFR基因的外显子20的区域的扩增引物对，如SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39 所示； 用于扩增EGFR基因的外显子21的区域的扩增引物对，如SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41 所示； 用于扩增KRAS基因的外显子2的区域的扩增引物对，如SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43 所示； 用于扩增KRAS基因的外显子3的区域的扩增引物对，如SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.45 所示； 用于扩增KRAS基因的外显子4的区域的扩增引物对，如SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47 所示； 用于扩增BRAF基因的外显子15的区域的扩增引物对，如SEQ ID NO.48和SEQ ID NO.49 所示。8. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述用于对样品进行桑格测序的试剂中， 还包含对EGFR、KRAS和BRAF基因扩增产物进行测序的测序引物；其序列分别如SEQ ID N0.34、SEQ ID N0.37、SEQ ID N0.39、SEQ ID N0.41、SEQ ID N0.43、SEQ ID N0.44、SEQ ID NO .46和SEQ ID NO .48所示。9. 权利要求3-8任一项所述的试剂盒在制备检测或辅助检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突 变的产品中的应用。10. -种非诊断目的的利用上述试剂盒检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的方法，其特 征在于，采用权利要求1所述的ARMS引物对待测样品的目的基因进行PCR扩增，在81°C采集 荧光信号，根据Ct值对检测结果进行判读，若△ Ct-Ι的△ Ct-2差别在1个循环内，△ Ct-2>8， 则检测结果为阴性； 若Δ Ct-1> Δ Ct-2, Δ Ct-2〈8,则检测结果为阳性。
【专利摘要】本发明公开了一种检测人EGFR、KRAS、BRAF基因突变的ARMS引物，其特征在于，所述ARMS引物的序列如SEQ？ID？NO.1至SEQ？ID？NO.31所示。本发明还公开了含有上述ARMS引物。本发明在ARMS实时荧光定量技术中引入了双内参系统，除了一般的内参对照外，还增加了和突变位点一致的正常位点参照，双内参系统和对应的双重判读规则避免了现有技术的缺陷，提高了检测的准确性，减少了错误率；而且本发明的检测试剂盒中还含有用于对样品进行桑格测序的试剂，联合桑格测序技术和ARMS实时荧光定量技术，既能对已知基因的突变位点进行检测，又能发现新的突变位点，保证了检测的灵敏度。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105567854
【申请号】CN201610115008
【发明人】黄理, 刘海云, 李保伟
【申请人】济南银丰医学检验有限公司
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年3月1日