从细胞培养基中去除微生物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本文公开的实施方案涉及从细胞培养基中去除包括病毒在内的微生物的组合物 和方法。
【背景技术】
[0002] 用于蛋白生产的常规方法通常包括细胞培养方法，例如重组工程化以在生物反应 器中利用化学成分确定的细胞培养基产生所关注的蛋白（例如，单克隆抗体）的培养哺乳 动物或细菌细胞系。减少生物反应器被微生物如细菌、真菌、支原体和病毒污染是生物制药 产业的重要问题，特别是在所关注的蛋白用于治疗用途时更是如此。
[0003] 在微生物中，细菌、真菌和支原体通常可以通过适当滤器过滤细胞培养基 来去除。例如，一般认为具有0.2 iim(um)标称孔径评级的微滤膜适合用于去除 Brevendumonas diminuta属的细菌。认为具有0. lym标称孔径评级的膜适合用于去除 支原体，主要是莱氏无胆甾原体（Acholeplasma laidlawii)属。参见，例如，Folmsbee和 Moussorakis，BioProcess International，Vol.l0，No.5,2012，pp. 60 - 62 (May 2012)。此 外，认为具有20nm标称孔径评级的膜适合实现代表最小病毒的细小病毒或细小病毒样颗 粒的最小4对数减少。
[0004] 人们认为产生具有用于病毒去除的孔径评级的膜是具有挑战性的，因为减少孔径 评级从而保留病毒可以导致膜孔的部分或完全收缩，从而使膜通透性显著降低至不期望的 水平。此外，目前没有特别设计用于在上游过程中有效去除病毒并可商购的膜滤器。
[0005] 通常用于细胞培养步骤下游的病毒屏障滤器对于去除上游病毒无效的原因之一 是由于上游和下游组合物之间的显著差异。例如，在上游过程的情况下，细胞培养基中没有 细胞或表达的蛋白。但是，存在营养素、脂质、氨基酸和其他组分（例如，提供流体动力学细 胞保护的普流罗尼克（Pluronic) F68)，全部是细胞生长和成活所需要的。相比之下，在下游 过程的情况下，细胞培养基包含细胞、细胞碎片、宿主细胞蛋白以及表达的蛋白。因此，在下 游过程的情况下，常使细胞培养基在进行病毒过滤步骤之前进行许多纯化步骤以去除不期 望的病毒过滤污染物。
[0006] 值得注意的是，因为需要纯化的组合物性质的差异，例如，在上游病毒去除情况 下的化学成分确定的细胞培养基相比在下游病毒去除情况下的包含表达的重组蛋白的细 胞培养基，通常在下游用于病毒去除的膜滤器在上游为了相同目的使用时往往不会工作太 好。参见，例如，Zydney et al.，Journal of Membrane Science, 297:16-50 (2007)。
[0007] 已尝试开发病毒屏障滤器，其可以特异性地用于在上游过滤化学成分确定的细胞 培养基。参见，例如，Biotechnol Prog. ,16:425-434(2000)讨论了用各种滤器获得的病毒 保留结果。如这篇论文中证实的，再生纤维素滤器显示出测试的任何滤器中最高的通量，并 且还表现出高病毒保留；但是，这样的膜并不适合于目前工业中通常采用的灭菌方法，通过 适当汽蒸或通过Y辐射灭菌。虽然，这篇论文还描述了 PES滤器，但是由于其低通量，一般 认为这种滤器不适合作为病毒屏障滤器用于上游用途。
[0008] 此外，美国公开第20130344535号讨论了利用超过24小时的过滤时间和利用某些 孔隙度的滤器过滤化学成分确定的细胞培养基以去除病毒污染物。
【发明内容】
[0009] 本文公开的实施方案提供新组合物，其用于从化学成分确定的培养基中去除微生 物，特别是病毒，所述化学成分确定的培养基用于培养表达所关注的蛋白的细胞。因此，这 类组合物可以在将细胞培养基转入生物反应器的步骤之前使用，所述生物反应器用于培养 细胞，例如表达所关注的重组蛋白的哺乳动物细胞。
[0010] 本文所述的组合物是基于膜的表面改性，其获得这样的膜，当化学成分确定的细 胞培养基滤过所述膜时，所述膜表现出被所述培养基中的一种或多种组分污染减少。
[0011] 在一些实施方案中，本文所述的组合物涉及具有用聚合物改性的表面的多孔膜， 所述聚合物包含随机排列和交联的双丙酮丙稀酰胺（diacetone acrylamide)单体以及一 种或多种非丙稀酰胺（non-acrylamide)可交联单体。
[0012] 在各种实施方案中，利用能源将包含随机排列和交联的双丙酮丙烯酰胺单体以及 一种或多种非丙烯酰胺可交联单体的聚合物直接包覆在多孔膜的表面上。示例性能源包括 但不限于热、电子束、紫外光和y辐射。
[0013] 示例性非丙烯酰胺可交联单体包括但不限于聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA)、甘油 二丙烯酸酯、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、四乙二醇二 丙烯酸酯和四乙二醇二甲基丙烯酸酯。在一具体实施方案中，非丙烯酰胺可交联单体为 PEGDA〇
[0014] 在一些实施方案中，所述多孔膜为不对称膜，例如，聚醚砜（PES)膜。
[0015] 本文还提供利用所述改性的多孔膜从化学成分确定的细胞培养基中去除病毒污 染物的方法，例如，通过所述改性的膜过滤化学成分确定的细胞培养基。
[0016] 在一些实施方案中，用包含以下结构的聚合物改性多孔不对称PES膜：
[0017]
[0018] 其中，
[0019] Ml 为中性 DACm 单体：H2C = CH-C (0) -NH-C (CH3) 2-CH2-C (0) -CH3;
[0020] M2 为中性 PEGDA 单体：H2C = CH-C (0) -0- (CH2-CH2-0) n-C (0) - CH = CH2;
[0021] Ml' 为自由基化的 DACm 单体：*H2C-CH-C(0)-NH-C(CH3)2-CH2-C(0)-CH 3;
[0022] M2' 为自由基化的 PEGDA 单体：*H2C-CH-C (0) -0- (CH2-CH2-0) n-C (0) -CH-CH2*;
[0023] P指随机聚合物网络；
[0024] n = 6、7、8、9、10、11 ;并且
[0025] 符号指烯基自由基。
[0026] 在一些实施方案中，用聚合物改性多孔不对称PES膜，所述聚合物包含以下结构：
[0027]
[0028] 其中，
[0029] Ml 和 M2 指中性 PE⑶A 单体：H2C = CH-C (0) -0- (CH2-CH2-0) n-C (0) - CH = CH2;
[0030] Ml' 和 M2' 指自由基化的 PEGDA 单体：*H2C-CH-C(0)-0-(CH2-CH2-0)n-C(0)-CH-CH 2*;
[0031] P指随机聚合物网络；
[0032] n = 6、7、8、9、10、11 ;并且
[0033] 符号指烯基自由基。
[0034] 在一些实施方案中，提供从化学成分确定的细胞培养基中去除一种或多种病毒污 染物的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)提供化学成分确定的细胞培养基；以及（b) 在将培养基转入生物反应器之前或期间通过多孔膜过滤所述化学成分确定的细胞培养基， 其中所述膜具有用聚合物改性的表面，所述聚合物包含随机排列和交联的双丙酮丙烯酰胺 单体以及一种或多种非丙烯酰胺可交联单体，其中所述生物反应器内的化学成分确定的细 胞培养基中的一种或多种病毒污染物的水平低于通过所述改性的膜过滤所述培养基之前 的水平。
[0035] 在一些实施方案中，将本文所述改性的膜并入装置。示例性装置形式包括但不限 于圆盘（disc)、折叠筒（pleated cartridge)、卷绕式筒（spirally wound cartridge)和 多片平板（multi-plate flat sheet)。
[0036] 在一些实施方案中，所述化学成分确定的细胞培养基是可商购的化学成分确定的 细胞培养基，例如，Lonza Power CH0、CD Opti CH0、EMD Millipore Cellvento CH0 100 和 Cellvento CH0 200〇
[0037] 利用本文所述的改性的膜，化学成分确定的细胞培养基中的一种或多种病毒污染 物的水平降低至少lL〇gl。减少值（LRV)或至少4L 〇gl。减少值（LRV)或至少6L〇gl。减少值 (LRV)〇
[0038] 在各种实施方案中，将化学成分确定的细胞培养基通过本文所述的改性的膜过滤 少于24小时的时间。在一些实施方案中，在范围为4-8的pH下和/或在范围为20°C -25°C 的温度下进行过滤。
[0039] 本文还提供减少病毒保留膜被化学成分确定的细胞培养基中的一种或多种组分 污染的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供病毒保留膜；以及（b)用包含随机排列和交 联的双丙酮丙烯酰胺单体以及一种或多种非丙烯酰胺可交联单体的聚合物改性所述膜，其 中相对于未改性的膜，改性的膜被化学成分确定的细胞培养基中的一种或多种组分污染减 少。
[0040] 在一些实施方案中，病毒保留膜是基于PES膜、PVDF膜、纤维素膜或尼龙膜。
[0041] 在一些实施方案中，非丙烯酰胺可交联单体为聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA)。
【附图说明】
[0042] 图1的条形图示出利用CH0细胞培养基作为进料流，有或无普流罗尼克F68暴露 的双丙酮丙烯酰胺（DACm)均聚物改性的PES膜的处理量性能结果。前5个数据集代表如 通过V75(L/m 2)、V90(L/m2)和10X通透性（L/m2h psi)测量的，利用不同百分比的DACm溶 液（2%、4%、6%、8%和10%)改性的膜的膜性能；而后5个数据集代表也通过￥75〇7111 2)、 V90(L/m2)和10X通透性（L/m2h psi)测量的，有F68暴露的相同膜的膜性能。
[0043] 图2示出一式两份测试的，包含4% DACm-1 % MBAm改性的PES膜或4% DACm-1 % PEGDA改性的PES膜或1 % HPC改性的PES膜（作为对照）的膜装置的通量衰减曲线。Y-轴 代表表示为（J/J。）％百分比的通量衰减，该百分比是基于对非阻塞性或非污染性进料流 (例如，Milli-Q水）确定的通量J。的百分比；而X-轴代表通过每平方米膜收集的滤液的 升数（L/m 2)表示的膜的处理量或容量。
[0044] 图 3 的条形图示出 4% DACm-1 % MBAm、4% DACm-1 % PEGDA 和 1 % HPC(作为对 照）表面改性的PES膜的容量和通透性。CH0细胞化学成分确定的细胞培养基用作进料流。 X-轴代表膜，而 Y-轴代表 V75 (L/m2)、V90 (L/m2)和 10X 通透性（L/m2h psi)。
[0045] 图4的条形图示出测试的各种膜装置的平均容量和通透性，为测量的V75、V90 和10X通透性。构建每个膜装置以容纳各种表面改性的膜中每种的单层（1L-)。1%HPC 指单层膜装置，其具有通过浸没施用的吸附聚合物预处理，并且包含1. 〇〇重量（Wt) %羟 丙基纤维素（HPC)水溶液，以10%己二醇用作膜湿润助剂；3. 75% LB20指单层膜装置， 其具有通过原位电子束固化以3. 75%的浓度施用的自交联的高度乙氧基化的三丙烯酸 酯单体；4.00 % -DACm-1 % MBAm指单层膜装置，其具有单官能团的乙烯基单体4 %双丙 酮丙烯酰胺（DACm)，以及与DACm形成共聚物的二丙烯酰胺交联剂1 %亚甲基-双-丙 烯酰胺（MBAm) ;2. 00 % LB20-1 % HEA-0. 75 % TEGDA 指单层膜装置，其具有 2 % LB20， 1%丙烯酸羟乙酯（HEA)以及0.75%四乙二醇二丙烯酸酯（双官能团或交联单体）；而 4. 00% -DACml% -PEGDA575 指单层膜装置，其具有 4% DACm 和 1% PEGDA575，PEGDA575 为 575数均分子量（Mfft)的聚乙二醇二丙烯酸酯。
[0046] 图5示出的图代表一式两份测试的每种单层膜装置的平均体积对时间的曲线。测 试的膜装置为HPC ;3. 75% LB20 ;4. 00% DACm-1% MBAm ;2. 00% LB20-1% HEA-0. 75% TEGDA ;和4.