iex@&rboPac PA20,250X4mm。
[0284] 防护柱：Dionex ?^Carbo化C PA20G，50 X 4mm。
[02化]柱溫：35°C
[0286] 移动相：WlOmM和200mM NaOH MP浓度（由50%溶液制成)梯度洗脱
[0287] 梯度:初始ImM NaOH等度洗脱5min，之后进行单级梯度洗脱至33mM，后续进行再生 和平衡
[0巧引 流速:0.5mL/min
[0289] 注入体积：10化
[0290] 检测:柱后金电化学电池(4步脉冲电流测量模式）
[0291 ] 海藻糖酶投配水平是通过化a壯ord测定基于总蛋白质水平。TraT#9,摇瓶，772]ig/ mL总蛋白质，Endo-H处理；TrnT#22，摇瓶，369iig/mL总蛋白质，Endo-H处理；TaaT#24，摇瓶， 914]ig/mL总蛋白质，Endo-H处理；Megazyme海藻糖酶比活性：150U/mg(40°C，pH 5.5)， 2100U/mL〇
[0巧。实施例2:由木霉属纤维素酶制备的海藻糖酶活性
[0293] 发酵如上所述进行55小时化r)。测试的样品如下：1. SSF(对照)2.具有添加的基准 海藻糖酶(MEGAZYMES的原核生物海藻糖酶；目录号E-TREH)的SSF; 3.具有25化L里氏木霉菌 株的纤维素酶混合物(TRIO)的SSF。海藻糖酶、DPUDP2和乙醇巧tOH)的含量是在5化的发酵 结束化(F)时间点测定且在表1中示出。
[0294] 表 1 r099^1
L0296」相比于对照，从投配发酵的里氏木霉纤维素酶混合物（TRIO)看到在乙醇生产中大 于0.3%wt/v增加（16.76%wt/v对16.41 %wt/v)。另外，相比于基准海藻糖酶，从投配发酵 的里氏木霉纤维素酶混合物(TRIO)看到在乙醇生产中大于0.2%wt/v增加（16.76%wt/v对 16.55%wt/v)。此改善的收率似乎可归因于海藻糖作为组分时DP2水平的降低。运表明里氏 木霉纤维素酶混合物具有海藻糖酶活性(数据未示出）。此结果还表明里氏木霉纤维素酶中 的海藻糖酶相较于基准海藻糖酶具有改善的稳定性和/或活性。
[0巧7] 实施例3:里氏木霉（细胞外）海藻糖酶和中性（胞质）海藻糖酶（分别为TraT和 TrnT)的生产
[0298]各候选海藻糖酶的序列可WW下购得：中性(胞质）海藻糖酶GH37(tre2)=JGI PID 123226=Genbank EGR46144.1;氨基酸序列：
(沈Q ID NO:2)
[0302]从基因组DNA扩增，克隆到大肠杆菌中的标准木霉表达载体中，定序，煮解且凝胶 纯化出细菌DNA，PCR扩增剔除表达盒。进行剔除海藻糖酶向LVS-EndoT Delete菌株的阳G转 化且置于VOG化板上。转化发生在3-4天后。挑选出各稳定海藻糖酶的大约100个转化体。将 各稳定转化体转移到24孔板且允许在28°C下在Aachen培养基中生长6天。通过蛋白质表达 (SDS-PAGE凝胶)和活性(MEGAZYMES海藻糖酶活性测定)筛选转化体的发酵肉汤。将顶部转 化体一式两份接种到250mL摇瓶中在Aachen培养基中W及在缓释微滴定板中在N旭L培养基 中。允许培养物在28 °C下生长6天。肉汤样品通过活性测定/SDS-Page针对最高活性/表达来 检验。选择顶部转化体用于1化评估。选择最终顶部候选海藻糖酶:LVS-ETD里氏木霉酸性海 藻糖酶#23。
[030引实施例4:发酵期间化aT和化nT稳定性/活性与化aT和基准海藻糖酶的比较
[0304] 海藻糖酶投配组中各组的海藻糖动力学的全面发酵性能图在图I(TraT)、图2 (TrnT)和图3(!"aaT;深绿木霉(Trichoderma atroviride)海藻糖酶）中示出。运些比较中的 每一个还包括对照和基准(MEGAZYMES)发酵。预期对照的海藻糖时间特征图初始具有海藻 糖的较小减少，接着后来在发酵中几乎相等的增加。此对照中的运些海藻糖动力学可归因 于酵母细胞中和外的自然流动和/或已知存在的微量水平的背景海藻糖酶。
[0305] 当比较投配海藻糖酶的发酵时，对于22小时取样时间看到完整的海藻糖水解。然 而，发酵中稍后的时间点显示性能的显著差异。具体地讲，对于两种里氏木霉海藻糖酶，在 发酵的整个过程中海藻糖水平保持较低（图1和图2)。然而，深绿木霉特征图示出在稍后时 间点处细胞外海藻糖水平的显著增加。因为在所有样品中海藻糖水平初始减小至低于可检 测限，所W海藻糖水平向发酵结束的运种显著升高证明了化aT稳定性/活性问题。此海藻糖 酶应用稳定性问题还对于基准(Megazyme)海藻糖酶是明显的（在图1、图2和图3中的每一者 中示出;虚线;注意在发酵的稍后时间点处海藻糖的显著增加）。
[030y 实施例5:在化OH发酵中添加TraT的效应
[0307] 基于上文的结果，针对改善在发酵中乙醇的生产的有效性，对将化aT添加到发酵 中进行评估。如上文在实施例1中所述设置发酵，其中（1)未添加海藻糖酶(对照），（2)在发 酵开始时添加0.扣g/g DS TraT,或（3)在发酵开始时添加0.25iig/g DS TraT。使发酵进行 72小时，其中在0、24、32、48、56和72小时时取样。发酵^36°(：溫度斜坡进行，不仅更指示了 发酵植物条件，还向酵母细胞提供更具应力的环境。
[0308] 如图4中所示，相比于对照（未添加海藻糖酶），在发酵开始时添加0.化g/g DS或 0.2扣g/g DS化aT导致在整个发酵中减小的海藻糖水平。相比于在对照中约0.35%wt/v (48h时间点），在IYaT样品中观察到的海藻糖峰水平他h时间点）为约0.2 % wt/v。在运些时 间点还测量了DP2水平且在图5中示出。在所有样品中DP2水平减小，但是，此减小对于经海 藻糖酶TraT处理的发酵更突出。
[0309] 图6示出含有TraT的发酵在E0F(72小时）时的化OH水平（％ v/v)显著高于对照发酵 (未添加海藻糖酶）。需注意，观察到的化OH的增加高于预期，预期是仅基于酵母对葡萄糖的 增加的消耗，此消耗来源于海藻糖通过海藻糖酶的水解。例如，如果在细胞外上清液环境中 0.2%wt/v海藻糖水平在发酵结束时完全水解，那么预期0.14%v/v乙醇增加。然而，在运些 实验中看到较大的乙醇增加。具体地，热倾斜发酵示出海藻糖超过对照的〇.22%wt/v减少 (图4,0.扣g/g DS化aT)，并且因此预期0.12%v/v乙醇减少。相反，测量到大于预期约50% 的增加（约〇.28%v/v乙醇增加；图6,0.化g/g DS化aT)。此数据还示出，EOF DP2水平不是 乙醇由于海藻糖酶处理而增加的量的绝对确定因子。尽管两个剂量示出类似的72小时EOF 海藻糖水平，但是较高剂量在整个SSF中保持更低的海藻糖水平，示出乙醇产生的最大增 加。
[0310] 参照此发现，另外的实验室级发酵数据示出，将海藻糖酶添加到SSF在发酵期间使 发酵酵母活性保持更长时间，从而实现额外的乙醇转化。具体地，在发酵开始时添加海藻糖 酶使酵母达到高于对照发酵的EOF乙醇水平(参见图7和图8)。
[0311] 实施例6:
[0312] 在后续发酵中海藻糖酶处理对海藻糖水平的效应
[0313] 如上所述进行发酵。然而，在具有海藻糖酶处理的第一发酵之后，来自那些发酵的 回糟用于制备后续发酵反应。在各种时间点测量海藻糖的量。数据在下表和图9中示出。如 可见，海藻糖特征图进行一些发酵达到较低水平。此外，在结束海藻糖酶试验之后的海藻糖 特征图示出减少海藻糖的更长时间的效应。不希望受理论束缚，可能的是，运两个效应都归 因于使回糟海藻糖水平再平衡所需的时间，如通过得到此数据的具体燃料乙醇植物的尺寸 和比率所支持。
[0314]
[0315] 尽管本文已示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域的技术人员来说 将显而易见，所述实施方案仅W举例的方式提供。众多变化、改变和替代在不脱离本发明的 情况下现将被本领域技术人员所想到。应当理解，本文所述的本发明的实施方案的各种替 代方案可用于实施本发明。意图在于，W下权利要求书定义本发明的范围并且因此可涵盖 处于运些权利要求书范围内的方法和结构W及其等效物。
【主权项】
1. 一种提高发酵反应中从液化液生产乙醇的方法，所述方法包括： a) 用葡糖淀粉酶、发酵生物和海藻糖酶发酵所述液化液；以及 b) 在所述发酵结束时回收乙醇和其它期望发酵产物，其中所述经海藻糖酶处理的发酵 相比于未经海藻糖酶处理的发酵反应产生增加的乙醇。2. -种降低发酵产物中DP2的最终浓度的方法，所述方法包括： a) 用葡糖淀粉酶、发酵生物和海藻糖酶发酵液化液；以及 b) 在所述发酵结束时回收期望发酵产物，其中所述DP2浓度相比于未经海藻糖酶处理 的发酵减小。3. 根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶为TrG4变体，SEQ ID N0:3〇4. 根据权利要求1至3所述的方法，其中所述海藻糖酶来自真核生物。5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述海藻糖酶来自丝状真菌。6. 根据权利要求5所述的方法，其中所丝状真菌为木霉属。7. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述海藻糖酶为酸性海藻糖酶。8. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述海藻糖酶为中性海藻糖酶。9. 根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述海藻糖酶以约O.lyg/g DS至约 1000yg/g DS的液化液的浓度添加。10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述海藻糖酶以约0.25yg/g DS至约100yg/g DS 的液化液的浓度添加。11. 根据权利要求10所述的方法，其中所述海藻糖酶以约〇.5yg/g DS至约10yg/g DS的 液化液的浓度添加。12. -种提高在发酵反应中从液化液生产乙醇的方法，所述方法包括： a) 用葡糖淀粉酶、发酵生物和发酵稳定的海藻糖酶发酵所述液化液；以及 b) 在所述发酵结束时回收乙醇和其它期望发酵产物，其中所述经海藻糖酶处理的发酵 相比于未经海藻糖酶处理的发酵产生增加的乙醇。13. -种通过在发酵反应中发酵生物而在时间上延长乙醇生产的方法，所述方法包括 在所述发酵开始时添加海藻糖酶。14. 一种通过在发酵反应中发酵生物而在时间上延长乙醇生产的方法，所述方法包括 在所述发酵期间添加海藻糖酶。15. 根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶为TrG4变体，SEQ ID N0:3〇16. 根据权利要求12至14中任一项所述的方法，其中所述海藻糖酶以在发酵培养基中 约0.1yg/g DS至约1000yg/g DS的浓度添加。17. 根据权利要求16所述的方法，其中所述海藻糖酶以在发酵培养基中约0.25yg/g DS 至约100yg/g DS的浓度添加。18. 根据权利要求17所述的方法，其中所述海藻糖酶以在发酵培养基中约0.5yg/g DS 至约l〇yg/g DS的浓度添加。19. 一种改善发酵反应中乙醇生产的方法，所述方法包括在整个所述发酵反应中保持 海藻糖水平低于阈值水平，其中所述阈值水平低于所述发酵开始时所述海藻糖浓度的两倍 (%wt/v) 〇20. -种改善发酵反应中乙醇生产的方法，所述方法包括将海藻糖酶添加到所述发酵 反应，从而在整个所述发酵反应中保持海藻糖水平低于阈值水平，其中所述阈值水平低于 未将海藻糖酶添加到过程中时在发酵期间将存在的所述海藻糖浓度的一半（％wt/v)。21. 根据上述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括附加酶，所述附加酶选 自：酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷 酶、卡拉胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β_1，4-葡 聚糖酶、内切-β_甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素 酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂氧合酶、甘露聚糖酶、氧化 酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂 酶、植酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、普鲁兰酶、还原酶、鼠李-半乳糖醛酸酶、葡聚糖 酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶和木糖苷酶。22. -种用于乙醇生产的改善的发酵方法，所述方法包括使用海藻糖水平低于0.05% wt/v的回糟或稀塔馏物。23. -种用于乙醇生产的改善的发酵方法，所述方法包括在所述发酵反应中使用海藻 糖水平低于〇. 1 % wt/v的回糟或稀塔馏物。24. -种用于在发酵反应中改善乙醇生产的方法，所述方法通过将海藻糖从所述回糟 中除去。25. -种用于通过除去海藻糖来改善在包含液化液和回糟的发酵反应中的乙醇生产的 方法，所述方法包括在发酵反应中使用海藻糖酶，其中海藻糖水平低于所述发酵反应的 0.01%w/v〇26. -种用于通过从包含回糟的液化中除去海藻糖来改善发酵反应中乙醇生产的方 法，所述方法包括通过用海藻糖酶处理来除去回糟中的海藻糖，其中海藻糖水平低于所述 回糟的0.05%w/v。27. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中乙醇生产的增加量相比于未经海藻 糖酶处理的发酵为0.1%(v/v)或更大、0.15%(v/v)或更大、0.2% (v/v)或更大、0.25%(v/ v)或更大、0.3% (v/v)或更大、0.4% (v/v)或更大、1.0%或更大。28. -种提高在发酵反应中从液化液生产乙醇的方法，所述方法包括： a) 用一种或多种淀粉酶、发酵生物和海藻糖酶发酵所述液化液；以及 b) 在所述发酵结束时回收乙醇和其它期望发酵产物，其中所述经海藻糖酶处理的发酵 相比于未经海藻糖酶处理的发酵反应产生增加的乙醇。29. 根据权利要求28所述的方法，其中所述一种或多种淀粉酶选自α-淀粉酶、β-淀粉 酶、葡糖淀粉酶或产麦芽糖淀粉酶。
【专利摘要】本发明公开了使用海藻糖酶改善发酵产物包括乙醇的收率，改善酵母健康状态，尤其是减小发酵结束DP2水平的方法。
【IPC分类】C12C11/00, C12P7/06
【公开号】CN105722989
【申请号】CN201480059071
【发明人】B·科科特, C·弗勒门, 帕茨米诺 D·E·托里斯, D·M·小坎农, D·E·华德, H·费斯特, J·K·舍蒂, K·A·克拉克森, K·阿尔伯斯, M·范布鲁塞尔, M·乔, M·谢弗斯, M·W·斯海勒, M·华德, P·克勒伊托夫, R·F·萨拉, R·J·普莱特二世, R·拉比诺维奇, S·巴伦兹
【申请人】丹尼斯科美国公司
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2014年10月28日
【公告号】WO2015065978A1