一种高效提取拟南芥内层黏液层的方法
【专利摘要】本发明公开一种高效提取拟南芥内层黏液层的方法，属于多糖提取领域。本发明的方法是利用超声波提取内层黏液层。该方法经济、简化劳动：提取溶液为水，无需进行脱盐处理便可得到大量的种皮黏液层，而酸碱盐法提取时，残留的盐分需要去除。节省时间：震荡法和酸碱盐法提取时间一般为1～2h，后期还需要进行脱盐，本方法可在20S完成提取。提取效率高：震荡法和酸碱盐法提取过后的种子经钌红染色后显示有大量黏液层残留，而本方法提取后，基本无黏液层残留。该方法具有高效、稳定、重现性好等优点，能最大程度地将黏液层提取出来，可使黏液层的分析更加精确，推动黏液层形成机理的研究，在化工行业中，本方法可缩短提取时间，减少成本。
【专利说明】
一种高效提取拟南芥内层黏液层的方法
技术领域
[0001]本发明属于多糖提取领域，特别涉及一种高效提取拟南芥内层黏液层的方法。
【背景技术】
[0002]被子植物的胚在发育时，覆盖在胚周围的珠被会形成种皮，种皮将外界的各种不利因素隔离并可以调节种子的萌发，一些种子植物(如十字花科、茄科、亚麻科和车前草科等)的种皮在形成时，外层细胞会分泌大量黏液，形成一层胶状的黏液层围绕种子，这层黏液层对促进种子的吸水和扩散有重要作用。由于黏液层富含果胶成分，已经成为获得果胶的重要原料。拟南芥种皮的外层细胞在分化时会在初生细胞壁和细胞膜之间积累大量的黏液，并且在细胞中央形成柱形的细胞质，这层细胞质周围会形成一层加厚的次生细胞壁，最终形成一种火山形成的结构，称为小柱。在种子吸水时，种皮外层细胞壁破裂释放出黏液，最先释放出的为外层黏液层，主要成分为无支链、非甲基化、非乙酰化的rhamnogalacturonan I(RG I)。还有一层黏液紧紧粘附于种皮，称为内层黏液层，这层黏液与种子的联结非常紧密，非常难以提取，这可能是由于黏液中的大分子交联或者黏液与小柱之间的交联，也有可能是外层细胞破碎后残留于种皮进而阻止黏液的释放(Western TL,Skinner DJ,Haughn Gff(2000)Differentiat1n of mucilage secretory cells of theArabidopsis seed coat.Plant phys1logy 122:
[0003]345-356)，内层黏液层的成分也主要为RG I，又可分为两部分，外侧包含有半乳聚糖和低甲基化的HG，内侧包含有纤维素、半乳聚糖和高甲基化的HG。
[0004]拟南芥的外层黏液层非常容易获得，将拟南芥种子浸于水中震荡几分钟即可，但内层黏液层却非常难以提取，在科研实验中，拟南芥内层黏液层的提取主要通过震荡、化学试剂如酸喊盐等来提取(Macquet A1Ralet MC,Kronenberger JjMar1n-Poll A1North HM(2007) In situ, chemical and macromolecular study of the composit1n ofArabidopsis thaliana seed coat mucilage.Plant&cell phys1logy 48:984-999)，但这些方法提取到的只是内层黏液层的一部分，还有大量的内层黏液层成分残留于种皮上。建立一种高效的拟南芥黏液层的提取方法，不但可以促进黏液层合成机理的研究，还可以为黏液层的化工提取提供方便。
【发明内容】
[0005]为了克服现有拟南芥内层黏液层提取方法的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种高效提取拟南芥内层黏液层的方法。本发明的方法是利用超声波提取内层黏液层。该方法具有高效、稳定、重现性好等优点，能最大程度地将黏液层提取出来。
[0006]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0007]—种高效提取拟南芥黏液层的方法，包括以下步骤:
[0008](I)获得干燥的拟南芥种子；
[0009](2)提取拟南芥种子的外层黏液层；
[0010](3)取步骤(2)中去除外层黏液层的种子，利用超声波进行超声处理，获得内层黏液层。
[0011]为了更好的实现本发明:还包括如下步骤:
[0012](4)对步骤(2)得到的外层黏液层和步骤(3)得到的内层黏液层分别进行三氟乙酸水解；
[0013](5)对步骤(4)得到的水解液进行高速离心，分别取上清和沉淀；
[0014](6)对步骤(5)得到的沉淀用蒽酮法测定结晶纤维素含量；
[0015](7)利用硫酸苯酚法测定步骤(4)得到的水解液中的糖含量，对照标准曲线，计算得到黏液层中的糖含量；
[0016](8)对步骤(2)、(3)处理后的种子进行钌红染色。
[0017]步骤(I)中所述的获得干燥的拟南芥种子通过以下方法实现，为了保证实验的可重复性，将拟南芥种子置于干燥的室温下一星期，使种子尽量脱水，最后收集起来置于低温低湿种子柜中保存。
[0018]步骤(2)中所述的外层黏液层的提取溶剂为水;优选为纯净水；
[0019]步骤(2)中所述的提取的条件优选为置于150rpm的摇床上震荡5?1min;
[0020]步骤(2)中所述的提取拟南芥种子的外层黏液层通过以下方法实现:称取拟南芥种子，加入纯净水(拟南芥种子:纯净水=5mg:1mL)，震荡，离心，取上清，为外层黏液层；用纯净水清洗种子3?5次，去除残留的外层黏液层，最后加入纯净水(拟南芥种子:纯净水=5mg:ImL)。
[0021 ]所述的震荡的条件优选为置于150rpm的摇床上震荡5?1min;
[0022]所述的离心的条件优选为2000?5000rpm离心Imin;
[0023]步骤(3)中所述的内层黏液层的提取溶剂为水;优选为纯净水；
[0024]步骤(3)中所述的超声波的振幅为20?80%;优选为60%。
[0025]步骤(3)中所述的内层黏液层的提取通过以下方法实现:取步骤(2)中去除外层黏液层的种子，超声处理，静置或离心，待种子沉到试管底部后，取上清，为内层黏液层。
[0026]所述的超声处理是置于超声波破碎仪(Sonics VCX130PB，装备有3mm探头，振幅60%)进行超声处理；
[0027]所述的超声处理的时间优选为1S?2min ；优选为20S?60S ；更优选为20S ；
[0028]所述的静置的时间优选为I?5min;
[0029]所述的离心的条件优选为2000?5000rpm离心lmin;
[0030]步骤(4)中所述的水解的条件优选为121°C条件下水解0.5?lh。
[0031]步骤(4)中所述的三氟乙酸水解通过以下方法实现:取步骤(2)得到的外层黏液层和步骤(3)得到的内层黏液层，分别加入三氟乙酸，在121°C条件下水解0.5?lh。
[0032]所述的外层黏液层或内层黏液层与三氟乙酸的体积比优选为5:1;
[0033]步骤(5)中所述的高速离心的条件优选为12000rpm离心5?1min;
[0034]步骤(6)中所述的测定结晶纤维素含量通过以下方法实现:对步骤(5)得到的沉淀，加入70 %硫酸，置于室温下水解Ih后加入纯净水，使硫酸浓度为17.5%;取用17.5%的硫酸梯度稀释成O，10，20，40，60，80，150，200yg/mL的葡萄糖标准溶液，加入预冷的0.2%蒽酮浓酸溶液，立即摇匀并置于冰上冷却；所有样品准备好后置于沸水浴中15min。以上样品冷却后后，置于分光光度计下测定620nm吸光值，制作标准曲线，计算样品中结晶纤维素含量。
[0035]步骤(7)中所述的硫酸苯酚法测定糖含量通过以下方法实现:取步骤(4)得到的水解液，加入5 %苯酚，加入浓硫酸，立即摇匀；取梯度稀释成O，10，20，40，60，80，150，200yg/mL的葡萄糖标准溶液，加入5 %苯酚，加入浓硫酸，立即摇匀。以上样品温室放置Ih后，置于分光光度计下测定490nm吸光值，制作标准曲线，计算样品糖含量。
[0036]步骤(8)中所述的钌红染色通过以下方法实现:配制0.01% (w/v)的钌红染色液，对种子进行染色5min，洗去染色液后置于体视显微镜下观察。
[0037]本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果:
[0038](I)经济、简化劳动。提取溶液为水，无需进行脱盐处理便可得到大量的种皮黏液层，而酸碱盐法提取时，残留的盐分需要去除。
[0039](2)节省时间。震荡法和酸碱盐法提取时间一般为I?2h，后期还需要进行脱盐，本方法可在20S完成提取。
[0040](3)提取效率高。震荡法和酸碱盐法提取过后的种子经钌红染色后显示有大量黏液层残留，而本方法提取后，基本无黏液层残留。
[0041]本发明为高效提取拟南芥内层黏液层成分提供了一种可靠的途径，在科学研究中，高效提取的拟南芥黏液层可使黏液层的分析更加精确，推动黏液层形成机理的研究，在化工行业中，本方法可缩短提取时间，减少成本。超声波提取技术现已应用于很多行业，但在拟南芥这种特殊的模式植物中还没有报道。
【附图说明】
[0042]图1是不同提取方式处理后拟南芥黏液层的钌红染色。
[0043]图2是不同提取方式对拟南芥黏液层多糖的提取量。
[0044]图3是拟南芥种子经不同时间超声处理后的钌红染色。
[0045]图4是拟南芥种子经不同时间阶段超声处理后糖的提取量。
[0046]图5是拟南芥种子荧光免疫观察;其中，A?D为超声处理前，E?H为超声处理后。
[0047]图6是硫酸苯酚法测定总糖标准曲线。
[0048]图7是蒽酮法测定结晶纤维素含量。
[0049]图8是拟南芥种子黏液层各成分含量。
【具体实施方式】
[0050]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0051]所述技术领域的普通实验人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。
[0052]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
[0053]所述的拟南芥种子为野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)Col_0种子，购自Arabidopsis B1logical Resource Center(ABRC，https://abrc.0su.edu/)。
[0054]实施例1:不同提取方式对拟南芥黏液层的提取效率研究
[0055](I)提取试剂的配制:用纯净水配制以下提取试剂:0.05M EDTA,0.2%草酸铵(w/v)，0.01M Na0H，0.05M HCl。
[0056](2)不同化学提取试剂对拟南芥黏液层的提取:准确称取5mg拟南芥种子，加入ImL纯净水，置于150rpm摇床上摇5min，3000rpm离心后，取上清，为外层黏液层。用纯净水清洗种子3遍，加入ImL对应试剂:纯净水，0.05M EDTA,0.2%草酸铵(w/v)，0.0IM NaOH，0.05MHCl，在40 0C摇床上200rpm摇Ih，3000rpm离心后，取上清，为内层黏液层。
[0057](3)超声处理对拟南芥黏液层的提取:准确称取5mg拟南芥种子，加入ImL纯净水，置于150rpm摇床上摇5min，3000rpm离心后，取上清，为外层黏液层。用纯净水清洗种子3遍，加入ImL纯净水，超声处理20S，2000rpm离心后，取上清，为内层黏液层。
[0058](4)钌红染色:步骤(2)和步骤(3)处理后的种子用纯净水洗3次，进行钌红染色，最后置于体视显微镜下观察，结果见图1。由图1可知，用化学试剂提取后，大部分黏液层还在种子上，并且经过NaOH提取后，大部分种子出现种皮碎裂的现象，种皮破裂有可能导致种子内部的糖类被抽提出来，导致结果不准确。而经过超声处理20S后，拟南芥种子上的黏液层几乎全部消失。
[0059](5)按照实施例4的方法进行总糖测定，测定结果见图2。由图2可知，用各种化学试剂来进行提取时，得到的黏液层多糖要明显少于超声法。
[0060]实施例2:超声提取拟南芥黏液层
[0061 ] (I)外层黏液层的提取:准确称取5mg拟南芥种子，加入ImL纯净水，置于150rpm摇床上摇5min，3000rpm离心后，取上清，为外层黏液层。
[0062](2)同一管种子样品经历不同超声阶段的黏液层提取:步骤(I)中的种子，累积超声5S，1S，20S，40S，lmin，2min，4min，6min后，分别取上清，为内层黏液层，每次超声间隔用纯净水清洗种子两次。
[0063](3)同一管种子样品经历不同超声阶段后黏液层变化:步骤(I)中的种子，累积超声03，53，103，203，403，11^11，21^11，41^11，61^11后，分别取种子，每次超声间隔用纯净水清洗种子两次。
[0064](4)对步骤(I)和步骤(3)获得的种子进行钌红染色，染色结果见图3。由图3可知，在超声处理20S时，绝大多数种子的黏液层已消失，但在超声4min时，出现种皮破碎，说明超声的时间对种子的影响很大，为了防止种皮破碎，应将超声时间控制在2min以内。
[0065](5)对步骤(I)和步骤(2)获得的黏液层分别按照实施例4的方法进行总糖测定，测定结果见图4和图8，由图4可知，在超声20S时，绝大多数黏液层多糖已提取出，在超声4min后，由于种皮破碎，糖含量又开始上升，因此，超声处理20S是最为合理的处理时间，由图8可知，拟南芥外层黏液层含量约为15.56mg/g，内层黏液层含量约为21.66mg/g。
[0066]实施例3:拟南芥种子黏液层的荧光观察
[0067](I)拟南芥种子用水摇5min去除外层黏液层后，用0.1M磷酸盐缓冲液(PhosphateBuffer Solut1n,PBS；lL:0.218g KH2P04，I.463g K2HP04，29.22g NaCl，pH 7.2)清洗 2次，每次5min;
[0068](2)用新鲜的5% (w/v)脱脂牛乳浸泡种子，置于慢速摇床上摇动lh;去除脱脂牛乳，并用PBS缓冲液洗涤种子5min;
[0069](3)一抗孵育:用稀释20倍的小鼠抗RG I抗体CCRC_M14(Complex CarbohydrateResearch Center)孵育种子lh，用PBS缓冲液洗涤种子5次以洗净未结合的一抗；
[0070](4)二抗孵育:用稀释50倍的FITC-羊抗小鼠抗体(康为世纪，货号CWOl 13S)孵育Ih，用PBS缓冲液洗涤种子5次以洗净未结合的二抗；
[0071](5)用0.01 %S4B(w/v,Direct Red 23,Sigma Aldrich，用20mM NaCl配制)复染5min，用PBS缓冲液洗涤种子5次；
[0072](6) Ca Icofluor 染色:取步骤(3)的种子，用 25yg/mL 的 Ca lcofluor (SigmaAldrich，用PBS 配制)染色 5min。
[0073](6)将制备好的样品置于激光共聚焦显微镜(Zeiss LSM710，RG I 490nm，S4B552nm，Calcofluor 405nm)下观察拍照，结果见图5，由图5可知，超声处理后，拟南芥种皮表面的纤维素和RG I成分绝大多数都被去除，只有少量的纤维素和RG I残留(箭头)。
[0074]实施例4:硫酸苯酚法测定总糖
[0075](I)标准曲线绘制:精确配制浓度分别为O，10，20，40，60，80，100，150，200yg mL-1的葡萄糖溶液，每个标准溶液取300yL，加入150yL新配制的5 %苯酚溶液，加入1.5mL浓硫酸，立即混匀，室温放置Ih后用紫外可见光分光光度计(上海美谱达UV-1200)在490nm波长下测量吸光值，绘制标准曲线(图6)，得到回归方程为y = -0.0134+0.02991*x。
[0076](2)样品测定:按照步骤(I)的方法，测定实施例1、2中样品的吸光值，根据标准曲线求得各样品的糖含量。
[0077]实施例5:结晶纤维素含量测定
[0078](I)黏液层结晶纤维素的获得:称取5mg种子，加入ImL纯净水，摇动5min后去除上清，清洗两次后加入ImL水，60 %振幅超声处理20S，静置使种子沉到底部后取上清。加入200yL三氟乙酸，121°C水解Ih，12000rpm离心5min后取结晶纤维素沉淀，用纯净水洗3次。对获得的结晶纤维素样品进行硫酸水解，WAHOyL 70%的硫酸，水解Ih，中间用移液器吹打5次，最后加入420yL纯净水，使硫酸最终浓度为17.5 V0o
[0079](2)结晶纤维素含量测定:用17.5%的硫酸溶液精确配制浓度分别为0，10，20，40，60，80，100，150，200yg mL—1的葡萄糖溶液，标准样品和样品分别取560yL，加入1.4mL用浓硫酸新配制的预冷的0.2%蒽酮试剂，摇匀后立即放冰上，全部样品加完后置于沸水浴中处理15min。最后用紫外可见光分光光度计(上海美谱达UV-1200)在620nm波长下测量吸光值，绘制标准曲线(图7)，得到回归方程为y = 0.00736+0.02267*x。根据标准曲线求得样品中的结晶纤维素含量，结果见图8，由结果可知，拟南芥黏液层结晶纤维素含量大约为3.71mg/g。
[0080]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种高效提取拟南芥黏液层的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)获得干燥的拟南芥种子； (2)提取拟南芥种子的外层黏液层； (3)取步骤(2)中去除外层黏液层的种子，利用超声波进行超声处理，获得内层黏液层。2.根据权利要求1所述的高效提取拟南芥黏液层的方法，其特征在于还包括如下步骤: (4)对步骤(2)得到的外层黏液层和步骤(3)得到的内层黏液层分别进行三氟乙酸水解； (5)对步骤(4)得到的水解液进行高速离心，分别取上清和沉淀； (6)对步骤(5)得到的沉淀用蒽酮法测定结晶纤维素含量； (7)利用硫酸苯酚法测定步骤(4)得到的水解液中的糖含量，对照标准曲线，计算得到黏液层中的糖含量； (8)对步骤(2)、(3)处理后的种子进行钌红染色。3.根据权利要求1或2所述的高效提取拟南芥黏液层的方法，其特征在于: 步骤(2)中所述的外层黏液层的提取溶剂为水。4.根据权利要求1或2所述的高效提取拟南芥黏液层的方法，其特征在于: 步骤(2)中所述的提取的条件为置于150rpm的摇床上震荡5?lOmin。5.根据权利要求1或2所述的高效提取拟南芥黏液层的方法，其特征在于: 步骤(3)中所述的内层黏液层的提取溶剂为水。6.根据权利要求1或2所述的高效提取拟南芥黏液层的方法，其特征在于: 步骤(3)中所述的超声波的振幅为20?80 %。7.根据权利要求1或2所述的高效提取拟南芥黏液层的方法，其特征在于: 所述的超声处理的时间为1 S?2min。8.根据权利要求1或2所述的高效提取拟南芥黏液层的方法，其特征在于: 所述的超声处理的时间为20S?60S。9.根据权利要求2所述的高效提取拟南芥黏液层的方法，其特征在于: 步骤(4)中所述的水解的条件为121°C条件下水解0.5?lh。10.根据权利要求2所述的高效提取拟南芥黏液层的方法，其特征在于: 步骤(5)中所述的高速离心的条件为12000rpm离心5?1min。
【文档编号】C08B37/00GK105820266SQ201610253398
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月20日
【发明人】吴蔼民, 赵先海, 乔立君, 陈晓阳
【申请人】华南农业大学