南瓜皮多糖及其制备方法、应用

南瓜皮多糖及其制备方法、应用
【专利摘要】本发明涉及植物药南瓜皮，具体涉及南瓜皮多糖及其制备方法、应用；南瓜皮多糖，其特征在于其多糖含量在90%以上，数均分子量2000~3000KDa；单糖组成包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖。本发明在制备南瓜皮多糖过程中，分别采用氯仿?正丁醇溶液法和离子交换树脂进行纯化的方法，去除蛋白更完全，然后再经分子筛凝胶柱进一步精制，所得的南瓜皮多糖，杂质少，纯度高；并对南瓜皮多糖和南瓜皮提取物的降血糖活性，为南瓜皮多糖的应用提供新的思路。南瓜皮作为废弃物，可以变废为宝，拥有广阔的应用前景，具有良好的社会效益和经济效益。
【专利说明】
南瓜皮多糖及其制备方法、应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及植物药南瓜皮，确切地说是南瓜皮多糖及其南瓜皮提取物治疗糖尿病 药物中的应用。
【背景技术】
[0002]糖尿病是一种非常普遍的内分泌代谢紊乱疾病，是胰岛素分泌和利用障碍引起的 以高血糖为特征的慢性疾病。糖尿病发病率逐年增长，已成为全世界的突出问题。I型糖尿 病，原名胰岛素依赖型糖尿病，多发生在儿童和青少年，也可发生于各种年龄。起病比较急 剧，体内胰岛素绝对不足，容易发生酮症酸中毒，必须用胰岛素治疗才能获得满意疗效，否 则将危及生命。
[0003]南瓜（Cucurbita moschata(Duch · ex Lam. )Duch · ex Poiret)萌芦科南瓜属的一 个种，一年生蔓生草本植物。原产墨西哥到中美洲一带，世界各地普遍栽培。明代传入中国， 现南北各地广泛种植。南瓜的果实可作肴馔，亦可代粮食。全株各部又供药用，且作用广泛， 中国民间还流传着"吃南瓜降血糖"的说法。有研究表明南瓜肉中南瓜多糖可治疗I型糖尿 病，但南瓜皮作为废弃物不被人利用。本发明采用以STZ诱导方法的I型糖尿病小鼠模型为 研究对象，从南瓜皮中提取南瓜多糖并考察其对I型糖尿病小鼠的降糖功效，为南瓜皮应用 提出新的思路，从而变废为宝。

【发明内容】

[0004] 本发明目的提供一种南瓜皮多糖和南瓜皮提取物在制备治疗糖尿病药物中的应 用。
[0005] 技术方案
[0006] 南瓜皮多糖，其特征在于其多糖含量在90 %以上，数均分子量2000~3000KDa;单 糖组成包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖;糖苷键键型有α或β键；
[0007] 所述的南瓜皮多糖的制备方法，其特征是由下列步骤组成：
[0008] Α、获得粗提液:将取来的南瓜皮烘干，粉碎，加入1-10倍体积蒸馏水，45摄氏度水 浴3-5小时，过滤，浓缩；
[0009] Β、去除蛋白：所述的浓缩液与氯仿-正丁醇按体积比4:1混合，经离心机离心lmin， 转速为5000rpm/min，去除蛋白，保留下层溶液，其中所述的氯仿-正丁醇溶液为氯仿与正丁 醇按体积比为4:1混合形成的溶液;重复上述过程三次，浓缩，冻干，获得的南瓜皮提取物； [0010] C、获得南瓜皮多糖粗品：取南瓜皮提取物溶于20-50倍重量的水，加入D301-G大孔 树脂，室温下间歇搅拌1-3小时，浓缩后4000r. p .m离心去沉淀，向上清液中加入1-6倍体积 的无水乙醇，4°C放置24小时，离心除去上清液，用无水乙醇洗涤沉淀三次，干燥后得南瓜皮 多糖粗品；
[0011] D、获得南瓜皮多糖:所述的南瓜皮多糖粗品，溶解于水，上DEAE-52阴离子交换柱， 去离子水洗脱后用lmol/L NaCl溶液洗脱，以硫酸苯酚法检测，收集NaCl溶液洗脱峰，减压 浓缩，流水透析24小时，浓缩后经4倍乙醇沉淀，4°C放置，离心去上清，以无水乙醇洗涤三 次，真空干燥;将真空干燥后的样品溶于去离子水，上已平衡好的Sephacryl S-400分子筛 凝胶柱，用去离子水洗脱，分部收集，以硫酸苯酚法检测，收集洗脱峰，浓缩后经冻干，获得 南瓜皮多糖。
[0012] 所述的南瓜皮多糖在制备治疗糖尿病药物中的用途。
[0013] -种南瓜皮提取物在制备治疗糖尿病药物中的用途，其特征在于所述的南瓜皮提 取物为权利要求1中步骤B制备获得。
[0014] 有益效果
[0015] 本发明在制备南瓜皮多糖过程中，分别采用氯仿-正丁醇溶液法和离子交换树脂 进行纯化的方法，去除蛋白更完全，然后再经分子筛凝胶柱进一步精制，所得的南瓜皮多 糖，杂质少，纯度高;通过对南瓜皮多糖的分子量、纯度、单糖组成、糖苷键链接方式等进行 结构表征，获得了南瓜皮多糖的详细结构信息；并对南瓜皮多糖和南瓜皮提取物的降血糖 活性，为南瓜皮多糖的应用提供新的思路。南瓜皮作为废弃物，可以变废为宝，拥有广阔的 应用前景，具有良好的社会效益和经济效益。
【具体实施方式】
[0016] 实施例1:
[0017] 本发明所述南瓜皮多糖的具体制备方法如下：
[0018] 1、将取来的南瓜皮烘干，称得烘干后其重量为117.6克，然后将其捣碎，加入蒸馏 水，45摄氏度水浴3小时。用纱布过滤得滤液。用旋转蒸发仪对其蒸发浓缩。
[0019] 2、对浓缩液进行severge法去蛋白；具体过程为:粗多糖溶液与氯仿一正丁醇（预 先配制成体积比为4:1混合液)按体积比4:1的比例，置于具塞试管中，充分振摇30min后，经 离心机离心lmin，转速为5000r/min，然后将水相与氯仿相分开。将水相再加入相当于其体 积1/4的氯仿一正丁醇溶液，重复上述过程，共计重复三次，浓缩，冻干，获得的南瓜皮提取；
[0020] 3、取南瓜皮水提物2g于容器中，充分溶解于100mL去离子水，加入D301-G大孔树脂 脱色和除蛋白质，间或搅拌3小时，溶液过滤后浓缩至10mL，加入60mL无水乙醇沉淀，4°C放 置24小时。离心除去上清。以无水乙醇洗涤3次，真空干燥得到南瓜皮多糖脱色产物；
[0021] 4、取南瓜皮多糖脱色产物200mg，充分溶解于去离子水，用平衡好的DEAE-52离子 交换柱分离，规格为（2.6 X 30cm)，平衡液为去离子水，上样体积为10mL，先以300mL去离子 水洗脱，再以lmol/L的NaCl溶液洗脱，分部收集，硫酸苯酚法跟踪检测，合并相同组分。 [0022] (4)离子交换柱分离所得NaCl溶液洗脱组分进行Sephacryl S-400分子筛柱层析， 以去离子水洗脱。柱规格为（l.ox 100cm)，分部收集，硫酸苯酚法跟踪检测，合并相同组分。 冷冻干燥，得到南瓜皮多糖。
[0023] 南瓜皮多糖的纯度和分子量通过高效分子排阻色谱法测S:WSh〇deXSUGARKS-805(8mmIDX 300mm)为高效液相色谱柱，采用示差折光检测器;色谱条件为:H20为流动相， 流速lmL/min，样品浓度为lmg/mL，每次进样20yL，检测时间20min。得到南瓜皮多糖的平均 分子量为2880KDa。
[0024] 南瓜皮多糖的红外光谱，波数3442CHT1的强吸收峰是0-H的伸缩振动，2933CHT1吸 收峰是糖环C-H伸缩振动，lOOO-UOOcnf 1间的一系列吸收峰是由糖环上C-0的伸缩振动， 1743cnf1,1425(31^1和1257CHT1的吸收峰分别是醛酸基团的C = 0伸缩振动，C-0伸缩振动和0-H伸缩振动，855CHT1和895CHT1的吸收峰表明既有α构型又有β构型的糖单位。
[0025]南瓜皮多糖精品的单糖组成通过柱前衍生高效液相色谱法测定：以2mol/L三氟乙 酸水解，甲醇洗涤后蒸干，以去离子水溶解，水解液经PMP衍生化后进行高效液相检测;色谱 条件：色谱柱为waters synmetry C18(150mmX4.6mm)，流动相为乙酸铵(ρΗ5·5)/乙腈(70/ 30)，检测波长为250nm。结果所示，根据保留时间和峰面积进行计算，并与单糖标准品进行 对照，可知南瓜皮多糖含有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖。
[0026] 实施例2
[0027] 1、动物：由南京青龙山动物养殖场提供实验用昆明小鼠，适应性喂养两周，分组编 号。
[0028] STZ试剂（美国Sigma公司）（因 STZ易升华，整个配制过程应在冰盒上操作，通常现 用现配，配好后30min内用完）。血糖试纸(美国强生公司稳豪倍易型试纸）（因 STZ易升华，整 个配制过程应在冰盒上操作，通常现用现配，配好后30min内用完）。
[0029] 血糖仪(美国强生公司稳豪倍益型血糖仪）
[0030] 2、方法：
[0031] (1)随机抽取5只小鼠为正常对照组（只注射等体积的生理盐水），其余小鼠禁食不 禁水12小时后采用STZ方法诱导I型糖尿病模型，用150mg/kg剂量给小鼠腹腔注射，然后恢 复进食，三天后测其空腹血糖，血糖值大于11.6mmol/L则造模成功。后随机取出5只为阴性 对照组（只注射等体积生理盐水），再将剩余小鼠每组5只，分组；分别为南瓜皮提取物 300mg/kg、600mg/kg、900mg/kg、南瓜皮多糖 50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg 以及阳性对照组 (0 · 5U/ml胰岛素，以0 · 054ml/10g剂量给药），结果如下：
[0032]表1南瓜皮中南瓜多糖和胰岛素药物对糖尿病小鼠血糖的影响
[0034] 注：与糖尿病模型比较P<0.05，"#"与糖尿病模型比较P<0.01
[0035]说明：本发明南瓜皮多糖或南瓜皮提取物与阴性对照组（即模型组)相比，具有剂 量依赖关系，同时通过数据可知，高剂量与阳性对照组(胰岛素相当）。从上述数据看出，南 瓜皮多糖为南瓜皮提取物的主要活性成分。同时，作为口服来说，其剂量很小，适合于开发 保健品或药品。
【主权项】
1. 南瓜皮多糖，其特征在于其多糖含量在90%以上，数均分子量2000~3000KDa;单糖组 成包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖。2. 根据权利要求1所述的南瓜皮多糖的制备方法，其特征是由下列步骤组成： A、 获得粗提液:将取来的南瓜皮烘干，粉碎，加入1-10倍体积蒸馏水，45摄氏度水浴3-5 小时，过滤，浓缩； B、 去除蛋白：所述的浓缩液与氯仿-正丁醇按体积比4:1混合，经离心机离心Imin，转速 为5000rpm/min，去除蛋白，保留下层溶液，其中所述的氯仿-正丁醇溶液为氯仿与正丁醇按 体积比为4:1混合形成的溶液;重复上述过程三次，浓缩，冻干，获得的南瓜皮提取物； C、 获得南瓜皮多糖粗品：取南瓜皮提取物溶于20-50倍重量的水，加入D301-G大孔树 月旨，室温下间歇搅拌1 -3小时，浓缩后4000r. p. m离心去沉淀，向上清液中加入1 -6倍体积的 无水乙醇，4°C放置24小时，离心除去上清液，用无水乙醇洗涤沉淀三次，干燥后得南瓜皮多 糖粗品； D、 获得南瓜皮多糖:所述的南瓜皮多糖粗品，溶解于水，上DEAE-52阴离子交换柱，去离 子水洗脱后用lmol/L NaCl溶液洗脱，以硫酸苯酚法检测，收集NaCl溶液洗脱峰，减压浓缩， 流水透析24小时，浓缩后经4倍乙醇沉淀，4°C放置，离心去上清，以无水乙醇洗涤三次，真空 干燥;将真空干燥后的样品溶于去离子水，上已平衡好的Sephacryl S-400分子筛凝胶柱， 用去离子水洗脱，分部收集，以硫酸苯酚法检测，收集洗脱峰，浓缩后经冻干，获得南瓜皮多 糖。3. 根据权利要求1所述的南瓜皮多糖在制备治疗糖尿病药物中的用途。4. 一种南瓜皮提取物在制备治疗糖尿病药物中的用途，其特征在于所述的南瓜皮提取 物为权利要求1中步骤B制备获得。
【文档编号】C08B37/00GK105884925SQ201610259947
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月25日
【发明人】李伟光, 冯昇, 钱景怡, 王诗豪, 田欣, 魏怡超, 王森怡
【申请人】中国药科大学