核酸检测方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】提供了用于检测靶标核酸的方法和试剂盒，其中扩增的核酸与例如顺磁性珠的颗粒结合形成絮凝型复合物，所述絮凝型复合物可以通过视觉观察检测。可以被检测的核酸样本的体积低至几微升。该方法可以应用于实地或照护点诊断，用于快速确定靶标核酸的存在或不存在。还可以确定靶标核酸的甲基化状态。所述方法和试剂盒具有在植物和动物中检测疾病、环境检测以及食品和其它可食用产品污染检测的普遍适用性。
【专利说明】
核酸检测方法和试剂盒
技术领域
[0001] 本发明设及核酸检测。更具体地，本发明设及使用相对小体积的核酸样本快速检 测核酸，其中通过视觉观察检测核酸。
【背景技术】
[0002] 高度需求在现场或照护点（p〇int-〇f-care，POC)W最低限度的设备进行的、快速 且低成本的核酸生物测定。虽然为实现运一目标进行了很多尝试，目前在实践中没有实现。 已知用于检测疾病DNA生物标记物的技术和方法，包括聚合酶链式反应(PCR)和连接酶链式 反应化CR)i。然而，运些方法需要在热循环仪上进行热循环W实现快速指数DNA扩增，且因 此不适合用于实地(field)或现场应用。但是，最近已经出现多种用W克服运种限制的等溫 的DNA扩增方法2'3。例如，为实现P0C应用，通过重组酶聚合酶扩增(RPA)4或依赖解旋酶扩增 化DA)5扩增的病原体DNA已被调整而用于在横向流条和便携式巧光针上进行检测6又然而， 运种读取方法虽然方便，但仍然依赖于使用相对复杂的设备，W及可能对于全世界的操作 者仍然存在资金障碍。此外，在实地进行采样，即使有的话，也极少被讨论。具体的，使用最 少的人操作和现场设施始终产生固定量的样本DNA用于下游应用。运个重要问题对任何测 定的性能具有显著的影响。因此，用于现场的核酸检测应用的实地即用(field-ready)综合 测定仍然是难W实现的愿望。
[0003] -个可W受益于低成本现场测定的领域是在农业中。农业产业是世界经济主要的 贡献者(估计每年1.5万亿美元）。然而，农作物疾病爆发是在依赖农业的经济中的主要问 题，特别是在发展中国家中，估计每年农作物损失2200亿美元W。目前，一旦疾病爆发传播超 过某个阔值，则没有办法挽救受害的农作物。控制疾病爆发的理想的方法是通过在其传播 之前在实地早期检测。农作物疾病管理的有效性高度依赖于诊断方法的快捷性、敏感性和 特异性。传统上疾病鉴定是通过视觉检查受影响的植物组织的疾病表型而进行的。然而，运 需要有经验的植物病理学家并且是相对主观的11。许多敏感的用W提高疾病鉴定诊断的方 法，例如已经开发了酶联免疫吸附测定化LISA)i2'i\免疫印迹M'ls、免疫巧光测试W和基于 PCR测定的多种迭代（iterations)i7'"用W促进疾病诊断。然而，所有运些检测方法需要昂 贵且复杂的设备，并且仅能在实验室中通过训练有素的技术人员进行。此外，缺乏快速的现 场检测导致部署疾病控制措施的延迟，反过来导致农作物进一步损失。因此，有必要开发新 的可在实地的应用的疾病诊断技术，不需要使用专业的实验室设备。此外，运些技术应该是 廉价的、敏感的、可重复的，并且不需要专业人员，其最终目标是允许每个农民检测他或她 自己的农作物。相似地，早期检测农场动物病原体对避免疾病的传播是至关重要的，尤其是 在使用密集生产方法的现代农场中。此外，早期诊断和检测人疾病，W及不依赖于复杂的技 术需求的可用的P0C方法，在发达W及发展中国家中，特别是在自然灾害情况(例如台风、海 啸或地震)后，可W挽救无数生命。
【发明内容】
[0004] 发明人意识到对简单的、可靠的、快速的和廉价的核酸检测方法的需求。因此，本 发明广泛的提供了一种用于W相对小的样本大小快速检测核酸的方法和试剂盒，其中核酸 的存在和/或不存在可W通过视觉检测到。本方法的优势在于，W优选的形式，其排除了对 设备的需求，例如离屯、机、热循环仪和分光光度计，所有运些需要利用主电力（main electricity)或电池形式的能。在具体的实施方案中，所述方法或试剂盒可W用于检测植 物、人和非人动物的一种或多种非致病性或致病性生物。
[0005] 在第一方面，本发明提供了一种检测核酸的方法，所述方法包括使分离的核酸与 颗粒结合的步骤，其中所述分离的核酸与所述颗粒能够形成可W通过视觉观察而被检测的 复合物。
[0006] 合适地，与在没有或相对低的量或浓度的核酸中观察到的相比，通过存在或相对 增加水平的可视觉检测的复合物指示核酸的存在或相对量。
[0007] 在一个实施方案中，所述颗粒是顺磁性颗粒。在一个优选的实施方案中，所述颗粒 是SPRI颗粒。优选地，所述颗粒在pH<7中与分离的核酸形成复合物。在一个优选的实施方案 中，抑在约3.6-5.5的范围，或者更优选地约抑4.4。根据本实施方案，通过核酸-颗粒复合 物的絮凝形成复合物。
[0008] 在另一个实施方案中，所述方法可W包括使用着色剂W促进、帮助或提高核酸-颗 粒复合物的视觉检测。合适地，所述着色剂结合核酸，并且提供在视觉范围的波长（即约 390nm至约700nm)的光学特征（signature)。光学特征可W包括在视觉范围内的波长的光 (包括憐光和/或巧光)的吸收或发射。
[0009] 合适地，分离的核酸是通过在核酸样本中存在的模板核酸的核酸序列扩增获得 的。典型地，模板核酸的核酸序列扩增包括一种或多种引物，其至少部分特异于模板核酸。 在优选的形式中，通过等溫核酸序列扩增获得分离的核酸。
[0010] 在一个实施方案中，等溫核酸序列扩增是重组酶聚合酶扩增(RPA)。
[0011] 在另一个实施方案中，等溫核酸序列扩增是滚环扩增(RCA)。
[0012] 合适地，模板核酸存在于核酸样本，所述核酸样本可从任何生物或其他来源的核 酸获得。在优选的形式中，模板核酸通过W下一个或多个步骤获得，包括：（a)包含祀标核酸 的核酸样本的重力过滤；（b)使祀标核酸与颗粒结合;和(C)从颗粒洗脱祀标核酸。
[0013] 在典型实施方案中，在步骤(b)和/或步骤(C)中祀标核酸的体积是约10化。
[0014] 在另一方面，本发明提供了一种用于检测核酸的试剂盒，所述试剂盒包含能够与 分离的核酸形成复合物的颗粒，所述复合物能够通过视觉观察检测。所述试剂盒可进一步 包含W下的一种或多种：用于核酸序列扩增的核酸聚合酶;一种或多种用于核酸序列扩增 的引物;磁体;用于核酸提取的试剂;过滤器;着色剂;和/或一种或多种反应容器。
[0015] 所述方法和/或试剂盒可W用于检测任何来源的核酸，包括人和其它动物、植物、 致病性和非致病性生物，包括原生生物、古菌、细菌、病毒、酵母、真菌、蠕虫和其它无脊椎动 物，但不限于此。
[0016] 在具体的实施方案中，所述方法和试剂盒可W用于检测核酸，所述核酸与人、非人 动物和植物的疾病和病症有关，与环境检测有关，与食物、饮料和其它消费品的检测有关， W及与法医分析有关，但不限于此。
[0017]在本说明书中，除非另有指示，所使用的"包含(comprise)"、"包括(comprises)" 和"含有（comprising)"是包含地而不是排他地，所W，阐述的整数或整数的组可W包括一 个或多个其它未阐述的整数或整数的组。
【附图说明】
[0018] 此处，参考W下附图描述本发明的非限制性的实施方案。
[0019] 图1:单滴基因组学测定的示意图。在现场通过简单的核酸提取方法将感兴趣的样 本加工至窄的浓度范围。然后检测病原体核酸，并通过重组酶聚合酶扩增等溫地进行扩增。 最后通过新的絮凝测定可视化测定结果。
[0020] 图2:精确的核酸提取过程。（A)提取过程的图示。图片显示用于提取的可能的样 本，使用一次性研鉢和巧手工浸溃(maceration)样本，并且使用普通的过滤移液器头清除 裂解物的细胞碎片。（B)四个独立提取的DNA样本的凝胶电泳。高分子量表明提取的DNA的良 好的完整性。（C)提取的核酸的光谱分析。上面:DNA，下面:RNA。
[0021] 图3:絮凝测定。(A)DNA介导的SPRI颗粒的絮凝的概念表征。（B)过量的引物不介导 絮凝。（C)仅10%或更高的扩增导致絮凝。(D)扩增的DNA的截断浓度依赖于抑。
[0022] 图4:单滴基因组学在检测S种植物病原体中的性能。（A)镶刀霉菌（Fusarium 0巧sporum f. sp. conglutinans)，（B)灰葡萄抱菌（Botiytis cinerea)，（C)下香假单胞菌 (Pseudomonas syringae)，（D)模拟的S重感染。上排:在不同感染阶段SI至S5的叶的照片。 H:健康样本。Pos:阳性对照。NoT:无模板对照。中间排:对相同的叶进行相应的RPA反应的凝 胶电泳图。下排:对应于RPA反应的絮凝测定的照片。
[0023] 图5: W提取自不同感染阶段的叶的5ng的DNA中，qPCR定量镶刀霉菌(F0C)。用图4 中用于RPA的相同引物，从阶段3感染W后可检测到病原体DNA。
[0024] 图6:单滴基因组学用于检测来自交叉多种宿主界的多种病原体。（A)香蕉茎中的 香蕉枯萎菌(F.oxysporum cubense；L(B)水中的大肠杆菌，使用下香假单胞菌作为无关阴 性对照。（C)在培养细胞中的HIV前病毒DNAd(D)血培养的镶状追原虫（Plasmodium Falciparum)。化）在番茄叶中的黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus) oRT:逆转录酶。 (F)在牛细胞中的牛瘤疹病毒1型(Bovine Herpesvirus 1)，使用祀向酪氨酸激酶1、TK1基 因和糖蛋白B基因的引物。(G)培养的结核分枝杆菌(Tuberculosis mycobacteria)，使用革己 向CFP10和ESAT-6基因的引物。大肠杆菌用作阴性对照。化)在培养介质中的流感病毒H1N1。 上排:RPA反应的凝胶电泳图。下排:对应于RPA反应的絮凝测定的照片。Pos:阳性(感染的） 样本。Neg:阴性(未感染的)样本。NoT:没有模板的对照。RT:逆转录酶。
[0025] 图7:测定的示意图。1)基因组DNA是酶促片段化为与甲基结合域(MBD)富集相匹配 的大小。2)在冰上(4°C)进行快速高严格度甲基化DNA的富集。3)通过等溫方法扩增感兴趣 的区域。4)存在的长的扩增的DNA诱导桥接絮凝，其指示存在感兴趣的高差异甲基化区域 (HDMR)o
[0026] 图8: (A)使用ESR1引物的RPA产物的凝胶电泳图，其证实与在室溫(RT)进行的测定 相比，在低溫(4°C )时没有失去性能的提高MDB富集的严格度。M:甲基化对照，U:未甲基化的 对照。（B)上排:对于W不同甲基化水平的DNA投入(input),使用ESR1引物的RPA反应的凝胶 电泳图。下排:照片显示来自低至10%的甲基化样本发生的絮凝。
[0027] 图9:7种人癌症细胞系对于(A化SR1、（B)GSTP1和(C)NPY的甲基化谱。列入未甲基 化的对照(U-Ctrl)W验证测定的严格度。（D)来自两例前列腺癌样本(PCI和PC2)W及汇集 来自25例女性供体的正常血液(NB) DNA的ESR1、GSTP1和NYP的全血甲基化谱。上:RPA反应的 凝胶电泳图。下:显示絮凝代表甲基化状态的照片。
[0028] 图10:在RT-RPA后Du化P RNA扩增子的DNA测序。使用SPRI磁性珠纯化提取的Du化P RNA的RT-RPA扩增子，并且测序W验证祀标TMPRSS2: ERG区域的扩增。
[0029] 图11:从患者尿液标本中提取的RNA的RT-PCR。使用RT-PCR对从10例转移性去势 (cas trate )抵抗性前列腺癌患者和健康患者的尿液标本提取的RNA进行扩增W检测 TMPRSS2:ERG区域。RT-PCR扩增子在琼脂糖凝胶上可视化，并且用于验证对同样的患者群进 行我们的测定的筛选结果(图11c)。
[0030] 图12:比较在全尿和尿沉渣中RNA的稳定性。在标本收集后0、2和12小时之时提取 患者全尿和尿沉渣RNA的RT-RPA。
[0031] 图13:对于使用总投入5ng的DNA，在拟南芥(Arabidopsis thaliana)DNA中的不同 百分比的下香假单胞菌DNA(0 %-10 % )的RCA-SDG检测极限。NoT:无模板的对照。上排:对应 于进行的RCA反应的凝胶电泳图。下排:对应于RCA反应的絮凝测定图片。
[0032] 图14:通过RCA检测下香假单胞菌中单滴基因组学的性能。上排:在感染后不同时 间的叶的照片，S1至S5"H:健康样本。NoT:无模板的对照。中间排:对相同的叶进行相应的 RCA反应的凝胶电泳图。下排:对应于RCA反应的絮凝测定的照片。
【具体实施方式】
[0033] 本发明设及一种快速的、在现场90分钟内检测DNA的方法和试剂盒。根据本发明使 用的DNA样本大小可W低至10化(即单滴）。在优选的形式中，使用固相可逆固定化(SPRI)颗 粒用于核酸的精确取样，所述核酸被纯化至精确地浓度范围，因此避免了进一步定量的需 要，此外确保下游加工的最佳性能。然后将纯化的核酸提交至任何合适的核酸序列扩增系 统，例如等溫核酸序列扩增，然后使用SPRI颗粒的DNA絮凝试验进行可视化，所述SPRI颗粒 在合适的抑条件下使DNA絮凝。本发明人证实了该方法可W准确地检测在不同感染阶段的 拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的不同的植物病原体。我们还能够在感染有经济重要的 病原体的商业香蕉样本中区分健康的和感染的组织。最后，为证实该方法的多功能性，所述 方法被用于检测在感染的组织中的植物RNA病毒、渗有大肠杆菌的水样本、感染HIV的细胞、 感染追疾的血液、感染细胞中的流感病毒、在牛细胞中的牛瘤疹病毒1型（Bovine herpesvirus 1) W及结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)细菌。因此，本发明提 供了一种方法和试剂盒，其可W用于W快速的方式与最低限度的设备检测来自任何来源的 DNA，因此理想地适于照护点(P0C)或其它现场应用，包括提供一种用于检测在人和非人类、 动物和植物中出现的新爆发的新兴疾病的快速响应系统。
[0034] 在一个方面，本发明提供了一种检测核酸的方法，所述方法包括使分离的核酸与 颗粒结合的步骤，其中所述分离的核酸与所述颗粒能够形成可W通过视觉观察而被检测的 复合物。
[0035] 在另一方面，本发明提供了一种用于检测核酸的试剂盒，所述试剂盒包含能够与 分离的核酸形成复合物的颗粒，所述复合物能够通过视觉观察检测。所述试剂盒可W进一 步包含W下的一种或多种：用于核酸序列扩增的核酸聚合酶;一种或多种用于核酸序列扩 增的引物;磁体;用于核酸提取的试剂;过滤器;和/或一种或多种反应容器。
[0036] 合适地，所述试剂盒可用于根据在上文中描述的方法。因此，如本文公开的，所述 试剂盒提供了方便制备和视觉检测核酸的一种或多种聚合酶、颗粒、缓冲液、容器和其它成 分。
[0037] 对于本发明的目的，"分离的"意指已经从其天然状态移除，或经历了人的操作的 物质。分离的物质实质上或基本上不含在其天然状态中通常伴有的成分，或者可能被操作 从而与在其天然状态中通常伴有的成分一起存在于人工状态中。分离的物质可W是天然 的、化学的、合成的或重组的形式。
[003引如文中使用的术语"核酸"指单和双链的DNA和RNA，包括cDNA、基因组DNA、mRNA、 3麻、01?魁、11111?魁、*1?魁，但不限于此。核酸包含核巧酸序列，所述核巧酸序列典型地包括包 含A、G、C、T或师咸基的核巧酸。然而，核巧酸序列可W包括其他碱基，例如肌巧、甲基胞喀晚、 径甲基胞喀晚、甲基肌巧、甲基腺巧和/或硫尿核巧，但不限于此。
[0039] 如本文中所使用的，"多核巧酸"是具有八十（80)个或更多个相邻的核巧酸的核 酸，然而"寡核巧酸"具有少于八十(80)个相邻的核巧酸。"探针"是单或双链寡核巧酸或多 核巧酸，合适地，其被标记用于例如在Nodhern或Southern印记中检测互补序列的目的。 "引物'通常是单链寡核巧酸，优选具有15-50个连续核巧酸，其能够退火至互补的核酸"模 板'，并且通过DNA聚合酶(例如化q聚合酶、依赖RNA的DNA聚合酶或Sequenase?)的作用，W 依赖模板的方式延伸。"模板核酸"是经核酸扩增的核酸。
[0040] 根据本发明，核酸样本可W从任何来源获得或提取，包括动物和植物，动物和植物 的细胞、组织、流体和子细胞细胞器，细菌，古菌，原生生物，真菌，病毒，W及环境样本，例如 饮用水、污水、游泳池水、河水或溪水、海水等，W及获自食物(例如肉、乳制品等)和其它消 费品的样本。运些来源可W是W病理样本的形式，包括体液(例如脑脊液、血液、血清、血浆、 精液、尿液、淋己液等）、肿瘤、组织或器官活检、宫颈样本和PAP涂片，但不限于此。其它来源 包括疑似含有可检测的核酸的法医样本。植物样本可W取自叶、茎、皮、种子、果实、花或花 成分(例如花瓣、花药、花粉、雄蕊等）、根W及任何其它植物细胞或组织。植物可W是植物界 的任何成员，包括可收获花、果仁、种子、油、木材或果实的农作物植物，例如谷物、豆科植 物、甘薦植物，用于生物量生长的植物，例如藻、柳枝稷、大麻和亚麻，W及任何农艺的、美学 的、生态或商业价值的其它植物。动物可W是任何脊椎或无脊椎动物，包括鱼、鸟和哺乳动 物。在具体的应用中，动物可W是人、非人哺乳动物或其它有商业价值的动物，例如禽、鱼和 甲壳纲动物。非人哺乳动物包括家畜（例如牛、羊、猪、马）、家庭宠物(例如猫和狗）W及表演 动物(例如赛马、骆驼），但不限于此。细菌、古菌、原生生物、真菌和病毒可W是致病性的或 非致病性的生物。"致病性"意指与植物或动物疾病或病症有关，或导致植物或动物疾病或 病症的生物。病原体非限制性的实例可包括:包括RNA和DNA病毒的病毒、原生动物、真菌、蠕 虫包括肠虫化elminth)、咖虫(roundworm) W及环节动物和细菌包括革兰氏阳性和革兰氏 阴性细菌。
[0041] 核酸提取可W通过任何现有技术中已知的方法进行。典型地，通过提取缓冲液促 进核酸提取，所述提取缓冲液典型地包含非离子型洗涂剂、盐、pH缓冲液W及离液剂。后文 更详细的提供了提取缓冲液的非限制性实例。如此获得的或提取的核酸在本文中被称为 "核酸样本"。典型地，核酸样本通过提取自例如前文中描述的来源获得，提取的核酸没有经 受离屯、或其它很大g的力，或者施加非大气压力（例如真空）w促进移除不期望的颗粒物质 或碎片。优选地，提取的核酸在重力或人工产生的压力下过滤，W促进移除不期望的颗粒物 质或碎片。在特别优选的实施方案中，使用颗粒至少部分纯化核酸样本，所述颗粒可逆地结 合在核酸样本中的祀标核酸，如将在后文中更详细描述的。合适地，随后可W通过核酸扩增 技术扩增祀标核酸。
[0042] 熟练的技术人员（addressee)熟知核酸扩增技术，并且包含但不限于聚合酶链式 反应(PCR);链置换扩增(SDA);滚环扩增(RCA);核酸序列依赖性扩增(NASBA)，Q-e复制酶扩 增；依赖解旋酶扩增化AD);环介导等溫扩增(LAMP);切日酶扩增反应(肥AR似及重组酶聚 合酶扩增(RPA)，但不限于此。如本文通常所使用的"扩增产物"指通过核酸扩增技术产生的 核酸产物。
[0043] 很多核酸扩增技术通过每一轮扩增期间不同的溫度(例如95°C变性，72°C引物退 火W及42°C模板延伸），使核酸序列扩增程序循环，从而该技术需要热循环仪。然而，一些核 酸扩增技术可W是等溫的，例如SDA、LAMP、肥AR、HAD、RCA和RPA，从而无需热循环仪。因此， 在优选的实施方案中，所述方法和试剂盒使用等溫核酸序列扩增。等溫核酸序列扩增的具 体的实施方案是例如通过TwistDX?系统提供的RPA，但不限于此。表1提供了用于通过RPA的 等溫核酸扩增的引物的非限制性实例。等溫核酸序列扩增的另一个具体的实施方案是RCA， 其在W下实施例中将更详细的描述。
[0044] 然而，还应理解在次优选的实施方案中，核酸扩增可W使用热循环仪进行，或者通 过包括在扩增的每一个循环期间W不同溫度的核酸序列扩增的重复循环的方法进行。
[0045] 合适地，随后固定扩增产物，并且然后通过与颗粒形成复合物而可视化。在另一个 实施方案中，可W使用着色剂W促进、帮助或提高核酸-颗粒复合物的视觉检测。合适地，所 述着色剂结合核酸，并且提供优选在视觉范围的波长（即约390nm至约700nm)的光学特征。 光学特征可W包括在视觉范围内的波长的光(包括憐光和/或巧光)的吸收或发射。
[0046] 从前述可W理解，所述方法和试剂盒使用能够结合核酸例如DNA、优选双链DNA (dsDNA)的颗粒。颗粒能够结合在核酸样本制备之后的模板核酸，和/或能够与分离的核酸 形成复合物，而被视觉观察所检测。
[0047] 在本发明的一般情况中，"颗粒"可W是任何能够结合分离的核酸的基质、珠或底 物。在优选的形式中，颗粒选择性结合具有至少100个连续核巧酸的分离的核酸。运种性质 促进了从核酸序列扩增引物(典型地比100个连续的核巧酸短得多）W及更短的、不完整的、 非特异性的或缩短的扩增产物中选择具有至少100个连续核巧酸的扩增产物。合适地，颗粒 包含带电的表面，其能够促进与分离的核酸的结合或相互作用。优选地，带电的表面包含正 电，其促进与带负电的分离核酸的结合或相互作用。
[0048] 在一些实施方案中，颗粒可W是顺磁性珠。典型地，顺磁性珠包含聚合物核屯、（例 如聚苯乙締），顺磁性壳(例如磁铁矿或其它含铁的顺磁性物质，例如包括蒙脱石和绿脱石、 黑云母、菱铁矿、黄铁矿的黏±)W及包含一种或多种化学基团的涂层，其在合适的条件下 结合核酸(例如含有簇基的基团）。非限制性的实例包括SRPI颗粒W及AMPureXP?颗粒。优选 的顺磁性颗粒是SRPI颗粒。
[0049] 在其他实施方案中，颗粒可W包括金属颗粒例如金(例如DNAdel?金载体颗粒）、金 属氨氧化物例如水滑石化T)和径憐灰石(HA)、娃酸盐例如娃藻±，但不限于此。
[0050] 在核酸样本制备之后的结合模板核酸的情况中，合适地，颗粒能够可逆地结合核 酸。因此，在合适的条件下颗粒结合核酸，然后所述核酸可W在促进洗脱或核酸释放的条件 下从颗粒洗脱或释放。优选地，通过提供一致的颗粒的量或浓度，而结合和洗脱可重复的量 或浓度的核酸。
[0051] 如上文所描述的，能够可逆地结合模板核酸的颗粒的一个非限制性的实例是SPRI 颗粒。
[0052] 在颗粒结合核酸的情况中，例如核酸序列扩增之后的dsDNA扩增产物，合适地，形 成核酸:颗粒复合物可W通过视觉观察被检测、观察或测量。运意味着具有实质上裸眼视力 (unaided vision)的人观察者至少能够看见颗粒和核酸之间形成的复合物的存在或不存 在。视觉检测可W提供核酸:颗粒复合物定性的、半定量的或定量的测量。通过视觉观察半 定量或定量确定或测量可W至少提供颗粒和核酸之间形成的复合物的近似的量或浓度。作 为实例，定量可W通过参考滴定参考标准而确定，所述滴定参考标准包含不同量或浓度的 核酸:颗粒复合物。通过视觉观察检测的能够与dsDNA形成复合物的颗粒的一个非限制性实 例是SPRI颗粒，如前所述。根据本实例，核酸:SPRI颗粒复合物是作为絮凝复合物而可视的。 典型地，使用磁体处理时形成相对澄清或无色的溶液，是絮凝复合物容易被磁体吸附的结 果。运与不存在核酸:SPRI颗粒复合物相反，核酸:SPRI颗粒复合物导致着色或浑浊的溶液。 例如当对比已知量或浓度的核酸滴定时，运种相对澄清或无色可W测量核酸的量或浓度。 一种优选的方法可W是滴定pH直至絮凝减少或不存在，并且添加的碱的量是核酸量的近似 或估计。
[0053] 然而，还应该理解所述方法不排除使用帮助检测、观察或测量核酸:颗粒复合物形 成的仪器、装置或设备。仪器、装置或设备的非限制性实例包括悬液计、浊度计和分光光度 计，但不限于此。
[0054] 在一些实施方案中，W非核巧酸序列特异性的方式使颗粒结合核酸。重要地，颗粒 通过与核酸的物理化学相互作用结合核酸(例如核酸扩增产物）。作为实例，运可能包括带 负电的核酸与带负电的颗粒之间的静电或电荷相互作用，例如通过涂布在SPRI颗粒上的含 簇基基团的方式协助。还可W使用带正电的颗粒，例如但不限于含有胺的基团所包被的颗 粒。
[0055] 在其它实施方案中，W核巧酸序列特异性的方式使颗粒结合核酸。作为实例，颗粒 可W偶联至寡核巧酸探针，所述探针包含能够与核酸扩增产物杂交的核巧酸序列。运种核 巧酸序列特异性检测可W识别核巧酸序列多态性，例如不同的等位基因形式、SNP和其它感 兴趣的核巧酸序列变体，例如与特定的植物或动物疾病有关的那些。
[0056] 在前述一般的实施方案的情况中，所述方法的具体的实施方案包括W下步骤：
[0057] (a)获得核酸样本；
[0058] (b)使核酸样本进行等溫核酸序列扩增，如果核酸样本中存在，从而从模板核酸产 生核酸扩增产物;和
[0059] (C)使核酸扩增产物与顺磁性颗粒结合，其中分离的核酸和颗粒能够形成通过视 觉观察能够被检测到的复合物。
[0060] 在步骤(a)中，优选是通过从例如上文所描述的来源提取而获得核酸样本，没有使 核酸样本进行离屯、或其它很大g的力、真空或高压下（样本可W经受低压，例如通过人工操 作的注射器的方式）w促进移除不期望的颗粒物质或碎片。合适地，核酸样本在重力下过 滤，从而移除不期望的颗粒物质或碎片。在一些实施方案中，过滤器是微量移液器头或其它 的至少部分填充有过滤材料(例如脱脂棉（cotton wool))的管（例如玻璃吸管、套管或导 管）。随后，在合适的缓冲液中，使核酸样本与例如SPRI颗粒的顺磁性颗粒结合，从而形成核 酸和顺磁性颗粒间的复合物。典型地，尽管不是排他地，所述缓冲液包含聚乙二醇、盐和pH 缓冲液。典型地，结合顺磁性颗粒的核酸样本的体积实质上低于通过从来源提取获得的核 酸样本的体积。结合有顺磁性颗粒的核酸样本的体积可W是从来源提取获得的核酸样本的 体积的至多20 %、至多10%、至多5%或至多4%、3 %、2 %或1 %。合适地，所述体积可能至多 约50化、至多约40化、至多约30化、至多约20化或至多约5-10化，包括扣L、化L、化L、祉L和化 L。
[0061] 合适地，随后通过磁体固定复合物，移除缓冲液，并且从颗粒洗脱核酸。可W使用 洗脱液例如水实现洗脱，但不限于此。合适地，洗脱体积可W是少的，但至多约50化、至多约 2化L、或者至多约5-10化，包括扣L、化L、化L、祉L和化L。确定最佳的结合核酸样本的顺磁性 颗粒的量、浓度、比例或相对比例，从而从顺磁性颗粒洗脱期望的量或浓度的核酸。例如在 10化洗脱中期望产出3-5ng/化的高分子重量的DNA。
[0062] 在步骤(b)中，优选通过RPA进行等溫核酸序列扩增，优选地，在约37°C进行，但不 限于此。在步骤(b)中使用引物，其提供了对在核酸样本中的祀标核酸的特异性，借此如果 在核酸样本中存在则祀标核酸被优先扩增。引物非限制性的实例在表1中描述。
[0063] 在步骤(C)中，在步骤(b)产生的扩增产物与顺磁性颗粒结合，例如SPRI颗粒。典型 地，在絮凝缓冲液中使扩增产物与顺磁性颗粒结合，所述絮凝缓冲液促进可W被视觉检测 到的顺磁性颗粒和扩增产物的复合物的形成。合适地，絮凝缓冲液具有低于7的pH。优选地， pH在3-6的范围，或者更优选地在约pH3.6-5.5的范围，包括pH3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、 4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3和5.4，或者在运些所述的抑值之间 的任何范围。如后文中所描述的，非限制性的实例是pH 4.4。作为实例，絮凝缓冲液可W是 或可W包含一种或多种醋酸盐、巧樣酸盐、憐酸盐或憐酸二氨盐，但不限于此。如后文中更 详细地描述的，絮凝缓冲液的非限制性实例是pH 4.4的醋酸钢缓冲液。
[0064] 尽管不希望被任何特定的理论束缚，建议核酸:颗粒絮凝可W通过提高絮凝缓冲 液抑而可逆，运与絮凝是胶体的可逆非共价聚集相一致。因此，在更高的抑，例如DNA的核酸 带更多的负电，并且因此越可能排斥来自涂布簇酸的颗粒(例如SPRI颗粒)表面的其它带负 电的核酸。可W利用运种抑依赖性，根据核酸的浓度精细地调整方法的敏感性。絮凝后滴定 pH也可W用作核酸浓度的近似或估计。
[0065] 如W前描述的，可W使用着色剂促进、帮助或提高核酸-颗粒复合物的视觉检测。 合适地，所述着色剂结合核酸，并且提供在视觉范围的波长（即约390皿至约7(K)nm)的光学 特征。光学特征可W包括或产生在视觉范围内的波长的光(包括憐光和/或巧光）的吸收或 发射。
[0066] 典型地已知的运种着色剂可W为"DNA染料"，非限制性的实例是结晶紫、结晶紫/ 甲基澄混合物、亚甲蓝或Visual Violet?。
[0067] 本发明的方法和试剂盒提供了 "平台"技术，其在核酸检测领域可W具有大量的应 用。更具体的，本发明的方法和试剂盒提供了在实地或在"照护点"中敏感且成本有效的用 于检测核酸的方式。在优选的形式中，本发明至少最大程度地减少或完全消除了对设备的 需要，例如热循环仪、离屯、机、分光光度计等。作为实例，本发明可用于植物和动物疾病病原 体的检测、检测植物或动物对特定的遗传性状或疾病的遗传易感性、分析食物和其它消费 品被真菌或细菌污染的损害检测、水质监测、法医样本的分析、植入前基因分析、性别确定 和DNA指纹，但不限于此。
[0068] 本发明的具体的实施方案设及检测植物或动物疾病病原体。
[0069] 在运种情况中，所述方法的具体实施方案包括W下步骤：
[0070] (I)从植物或动物来源获得核酸样本；
[0071 ] (II)使核酸样本经受等溫核酸序列扩增，如果样本中存在，从模板核酸产生核酸 扩增产物，其中所述模板核酸包含病原体的核巧酸序列，所述病原体导致植物或动物的疾 病或病症，或者与植物或动物的疾病或病症有关;和
[0072] (III)如果存在，使核酸扩增产物与顺磁性颗粒结合，其中核酸扩增产物和颗粒能 够形成通过视觉观察能够被检测到的复合物，其中核酸扩增产物的存在指示病原体的存 在。
[0073] 因此，在一些实施方案中，本发明可W用于医学或兽医学诊断，用W确定与动物的 疾病或病症有关、或导致动物疾病或病症的病原体的存在或不存在。在运种情况中，动物可 W包括人和非人哺乳动物（例如家畜和宠物）、鱼、甲壳纲动物和鸟（例如家禽），但不限于 此。病原体可W包括病毒包括RNA和DNA病毒、原生动物、蠕虫包括肠虫、咖虫和环节生物、真 菌、原生生物、古菌和细菌。如将在实施例中更详细描述的，所述方法检测由病毒(例如HIV 和流感）、原生动物（例如镶状追原虫Plasmodium falciparum)和细菌（例如大肠杆菌 E.coli和结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis)引起的人疾病的病原体的核酸。
[0074] 根据本发明，还预期检测真菌、病毒和/或细菌植物病原体。植物可W包括单子叶 的和双子叶的植物、农作物、谷物、水果、稻科植物(grasses)、树和藤本植物，但不限于此。 如在实施例中更详细的描述的，植物病原体的非限制性实例包括DNA和RNA病毒，比如RNA病 毒黄瓜花叶病毒、细菌例如下香假单胞菌(Pseudomonas syringae)和真菌例如镶刀霉菌 (F.oxysporum f.sp.conglutinans)和灰葡萄抱菌（Botrytis cinerea)。
[0075] 然而，应理解本发明可W广泛地实践用于获得自任何生物的核酸样本，无论是人 和非人动物或植物的非致病性生物，还是病原体。
[0076] 本发明的一个具体的应用设及在人或动物群或在植物群例如农作物中的新的疾 病的爆发。正如近期发生的禽流感和其它流感W及SARS，出现的新的病原体株或变体是基 因上可区别的。运种新的病原体株或变体的基因组可W被快速地测序并且产生适合用于根 据本发明的核酸序列扩增引物。使用核酸序列扩增引物，本发明的方法和试剂盒因此立即 适合用于提供快速的和简单的新的病原体株或变体的检测。
[0077] 本发明的其它具体实施方案设及检测与特定的疾病或病症有关的生物标记物。
[0078] 在运种情况中，所述方法的具体的实施方案包括W下步骤：
[0079] (I)从人或非人动物获得核酸样本；
[0080] (II)使核酸样本进行等溫核酸序列扩增，如果模板核酸存在于样本中，从模板核 酸产生核酸扩增产物，其中所述模板核酸包含与疾病或病症有关的生物标记物的核巧酸序 列，或编码与疾病或病症有关的生物标记物的核巧酸序列;和
[0081 ] (III)如果存在，使核酸扩增产物与顺磁性颗粒结合，其中核酸扩增产物和颗粒能 够形成通过视觉观察能够被检测到的复合物，其中核酸扩增产物的存在指示生物标记物的 存在。
[0082] 生物标记物可与人或非人动物的任何疾病或病症有关，包括癌症、肿瘤、淋己瘤、 白血病和其它恶性肿瘤，感染性疾病，炎症性疾病，自体免疫性疾病，呼吸道疾病，胃肠疾 病，神经疾病，生殖系统疾病和精神疾病，但不限于此。例如，生物标记物可W是或者包括肿 瘤抗原、抑制基因或标记物和/或遗传或表观遗传核巧酸序列多态性、突变修饰或改变例如 体细胞突变、单核巧酸多态性(SNP)和其它遗传多态性、核巧酸序列插入、缺失、重排、DNA甲 基化和/或DNA径甲基化事件，但不限于此。在实施例中更详细描述的一个具体的实施方案 中，本文公开的方法和/或试剂盒适合用于检测DNA甲基化。在实施例中更详细描述的另一 个具体的实施方案中，本文公开的方法和/或试剂盒适合用于检测前列腺癌的DNA标记物。
[0083] 本发明的另外的具体的实施方案设及检测环境样本中的病原体。
[0084] 在运种情况中，所述方法的具体的实施方案包括W下步骤：
[0085] (1)从环境来源获得核酸样本；
[0086] (2)使核酸样本进行等溫核酸序列扩增，如果模板核酸存在于样本中，从模板核酸 产生核酸扩增产物，其中所述模板核酸包含病原体的核巧酸序列;和
[0087] (3)如果存在，使核酸扩增产物与顺磁性颗粒结合，其中核酸扩增产物和颗粒能够 形成通过视觉观察能够被检测到的复合物，其中核酸扩增产物的存在指示病原体的存在。
[0088] 环境来源或样本可W是水，包括废水和污水（例如排水、雨水、矿业和/或工业废 水）、饮用水、游泳池水W及河水、溪水、湖水、池水或海水、空气样本和±壤样本，但不限于 此。
[0089] 参考W下非限制性的实施例，W便更容易实践本发明并且产生实际效果。
[0090] 实施例
[0091] 实施例1
[0092] 单滴基因组学 [009引材料和方法
[0094] 对于植物应用，使用优化的裂解缓冲液巧OmM Tris-HCl pH 8.0，1.5M盐酸脈，2% w/v PVP40和1 % v/v Tr i ton-X)从单叶（300mg)提取基因组DNA。对于DNA应用，将400ng/化 RNA酶A添加至裂解缓冲液，但对于RNA应用不添加。在环境条件解育10分钟后，使用低成本 的自制过滤装置使裂解物澄清，所述自制过滤装置由普通的过滤移液器头制造。对于非植 物应用，使用不含有PVP40的裂解缓冲液。然后使用改进的SPRI过程纯化核酸w'w。简要地， 在结合缓冲液中（10mM化is-肥lpH8.0,20%阳G8000,2.5M化Cl)，单滴（10化)澄清的裂 解物与1.8倍体积的涂布有簇酸的磁珠 (Thermo Fisher)解育5分钟。然后使用磁体，将DNA 结合珠从裂解物中分离，并且使用100%异丙醇洗涂两次，然后通过两次80%乙醇洗涂，并 且WlOiiL的水洗脱。
[00M] 如制造商推荐的进行一些改进，使用TwistAmp基础RPA试剂盒(TwistDX)。简要地， 使用化1的核酸提取物和480-600碰的每种引物(表1)，在37°(：进行12.5化的反应持续30-40 分钟。对于RNA应用，50个单位的MMuLV逆转录酶添加至RPA反应。扩增之后，5化的RPA反应物 在凝胶上进行电泳W验证扩增。在絮凝测定中使用另外的扣L与1.8倍体积磁性SPRI珠溶液 解育5分钟。使用磁体将珠分离后，并且使用80%乙醇洗涂，3化L的絮凝缓冲液（lOOmM醋酸 钢，pH 4.4)添加到珠中。
[0096]
[0097] 单滴基因组学概念
[0098] 设想单滴基因组学是使用最低限度的设备，在现场敏感且快速的检测致病性核酸 的综合整合解决方案。图1简要地描述了 SDG概念，其由=个主要阶段组成。第一阶段是精确 采样，其中使用最低限度的设备，从感兴趣的来源将DNA和/或RNA提取至窄的浓度范围，所 述来源例如单滴未加工的叶提取物。第二阶段是使用RPA进行致病性核酸的敏感、快速的等 溫扩增。第S且最后的阶段是使用SPRI特异性捕获扩增的DNA，然后实质上无需设备的视觉 观察在诱导絮凝的缓冲液中相同的SPRI颗粒。
[0099] 精确DNA采样
[0100] 实地采样即便有，也极少被讨论。始终产生固定量的样本的重要任务对任何测定 的性能具有意义。运里我们描述了一种使用普通的过滤移液器头结合SPRI技术W的低成本 DNA纯化，W始终提取DNA至精确的浓度，运能够立即用于下游RPA扩增（图2A)。基于磁性 SPRI珠的DNA提取理想地用于P0C应用，因为其实质上无需设备;仅需要磁体。此外，DNA产量 可W通过简单地调整对固定的样本投入给予的SPRI颗粒的量而被精确的控制。运种方法的 另一个优势是其相对低的成本(每次提取大约10澳分）。使用塑料研鉢，在2(K)化的裂解缓冲 液中，手工浸溃单叶（大约300mg或四个6mm直径的盘），通过简单地使裂解物通过过滤移液 器头，清除植物裂解物的细胞碎片。然后使用SPRI从单滴（1化L)裂解物中纯化DNA，其导致 在10化的洗脱中，始终典型的产出3-5ngAiL的高分子量DNA。由于DNA产量接近光谱测定评 估(化no化op)的检测极限，DNA产量和完整性通过漠化乙锭染色（图1B)估算，并且使用巧光 (Qubil某测定)验证。尽管光谱测定对DNA评估是不可能的，在230nm基线附近的吸光度指示 最小量的污染物（图2C)。对于RNA提取，典型的产量是在10化的洗脱中30-40ngAiL，260/280 和260/230的比分别是1.9-2.2和1.8-2.3(图2C)，指示良好的纯度。
[0101] DNA絮凝测定
[0102] 聚集(aggregation)测定具有多个好处，例如无需标记和无需设备的生物分子检 测，并且最近已经使用金纳米颗粒进行了证实2^3。本文中，根据我们所知，我们首次证实了 使用涂布有簇酸磁性颗粒SPRI的絮凝测定用于DNA检测（图3A)。使用磁性SPRI颗粒具有S 个好处：（1)结合RPA扩增的DNA，（2)移除过量的dNTP、引物和引物二聚物，（3)促进絮凝的缓 冲液的变化。W目前的SPRI条件排除了小于l(K)bp"的DNA，多达600nM的过量引物(推荐用于 RPA的最大引物浓度)不导致凝集（图3B)。然而凝集（阳性反应)仅在存在扩增的DNA时发生 (图3C)。此外，需要低至10%的扩增效率W产生（illicit)视觉上有差异的阳性反应。通过 假设在反应中扩增产物的最大量与初始引物量(480nM)相当而估算。W不同的产物比引物 的比例混合，W确定诱导絮凝所需要的最小扩增。另一个感兴趣的测定的特征是其对pH改 变的敏感性（图3D)。在pH 4.4时，可W检测低至0.5ngAiL(5化体积）的扩增产物。然而在 抑5.4,凝集的截断浓度提高100倍达SOngAiL (扣L体积）。因此，运种特征可W提供某种水平 的"调整(tuning)"，并且可能有利于某些应用。考虑到运些观察，我们认为导致凝集的机制 可能是DNA介导的SPRI颗粒的絮凝。24
[0103]使用单滴基因组学检测在不同感染阶段的植物病原体
[0104] 我们选择通过检测植物病原体证实SDG的可行性，因为由于晚期疾病的诊断导致 的农作物损失是重要的问题W。此外，目前缺乏用于农业应用的实地测定。使用我们的精确 采样程序，基于拟南芥的症状发展，在不同的感染阶段，从接种病原体的拟南芥收集DNA。使 用SDG早在第一阶段感染可W检测到下香假单胞菌接种的植物，甚至在症状显现之前（图 4C)。此外，从症状开始变得明显的感染的第二阶段，SDG检测到在接种的植物中镶刀霉菌和 灰葡萄抱菌（图4A和图4B)。我们还尝试使用qPC閲金证我们对于镶刀霉菌的SDG结果，然而， 使用与RPA方法相同量的初始材料，仅在阶段3至5可W检测到（图5)。为证实=重检测测定， 来自接种有不同病原体的=种植物的叶子，在它们各自的感染阶段汇集到一起，用于模拟 S重感染。在第一阶段，SDG可W检测到病原体的存在（图4D)。运些结果不仅证实了 SDG测定 的可行性，还证实了在植物感染的早期检测中的敏感性，即当表型症状刚开始显现时。
[0105] 虽然SDG在拟南芥植物模型系统中表现良好，我们想知道该测定是否对其它宿主 植物系统适用。为此，我们对香蕉茎切断物（来自商业上重要的品种)应用SDG，W检测香蕉 枯萎菌(F. 0巧sporum cubense)。SDG能够很容易区分健康与患病样本，进一步支持SDG作为 用于农业应用可行的现场实地测试的潜能（图6A)。
[0106] 单滴基因组学:多类应用
[0107] 虽然我们成功地检测了植物病原体DNA，但对于RNA病毒检测RNA也是有用的。为 此，改进SDG采样过程，用W提取RNA而非DNA，用于植物病原体黄瓜花叶病毒(CMV)。然后将 匪LV逆转录酶(RT)添加到RPA混合物中，W允许等溫、单步骤的病毒RNA的RT-RPA扩增25'26。 然后使用絮凝测定确定成功扩增，并通过凝胶电泳验证。正如所预期的，当RPA反应中包括 RT酶时，仅病毒感染的样本产出阳性结果，而健康植物没有(图6E)。
[0108] 为证实其他的可能的农业应用，我们将注意力转移到养牛业。养牛场趋于坐落于 地理位置偏远地区。因此用于牛疾病例如牛瘤疹病毒1型的现场诊断对产业有益。感染的与 未感染的牛细胞经SDG，并且使用针对病毒酪氨酸激酶1和糖蛋白B基因的引物，我们成功地 区分了健康与疾病样本(图6F)。
[0109] 接下来，SDG用于检测在水中的大肠杆菌DNA。培养普通的实验室大肠杆菌株 One化ot Machl至00 = 0.5。然就将其稀释10倍，并且10化用于0臟提取。然后将提取的0魁的 化L用于使用祀向uidA基因中的大肠杆菌特异性序列的引物27的扩增步骤。使用下香假单胞 菌(P. syr ingae)曲NA作为非特异性对照W及缺少DNA模板的对照(NoT)证明扩增的特异性。 仅对于运种应用，即使在采取了用W避免污染的很多预防措施之后，在NoT对照中总是观察 到RPA产物。此外，在无关的DNA模板中观察到相似水平的扩增，因此，我们认为RPA试剂盒具 有低水平的污染大肠杆菌DNA，并且在NoT对照中的扩增水平可W被认为是基线。然而，因为 即使大肠杆菌阴性样本产生扩增子，将导致絮凝试验中的假阳性。为克服运个缺点，我们通 过将絮凝缓冲液的抑从4.5提高至5而"调整"测定。在运个条件下，我们可W解释(account for)背景扩增，并且成功地检测大肠杆菌阳性样本，在对照样本中没有错误检测（图6B)。
[0110] 最后，将SDG延伸至导致人疾病的病原体，例如HIV、追疾、结核病和流感。为此，使 用相同SDG过程，我们从健康细胞中成功地区分了HIV感染的细胞(前病毒DNA)(图6C)。在感 染的血液样本中也成功地检测到追原虫DNA的存在，而在未感染的对照中没有检测到（图 4D)。使用两种不同的祀标基因，清楚地检测到在培养样本中的结核分枝杆菌的存在，并且 可W与大肠杆菌区别（图6G)。最后，在感染的培养介质中检测到甲型流感H1N1病毒，然而未 感染的介质没有提供任何阳性信号（图細)。综上，证实SDG其本身作为通用的综合方法能够 在实地使用，不需要实验室加工样本或复杂的设备，并且适合于很多应用。
[0111]
[0112] 实地即用P0C基因组测定的特征在于，始终提取固定量核酸的取样过程，快速且敏 感的等溫扩增方法W及无需设备读出。在本文中，我们描述了单滴基因组学（图1)测定，其 整合了所有W上特征，是用于检测来自不同界的多种致病性和非致病性物种的DNA和RNA的 通用的、实质上无需设备的、低成本的方法。
[0113] 提供了始终W固定量取样核酸解决方案是意义重大的事件，因为投入材料的量能 够显著影响下游加工的性能。为实现运一点，我们使用裂解缓冲液改进了已经建立的方法， 所述裂解缓冲液由促溶盐(chaotropic salt)例如盐酸脈组成。脈盐使蛋白质变性，并且灭 活核酸酶，因此保存核酸的完整性。连同洗涂剂，例如化iton-X，破坏细胞膜W提高裂解。运 之后移除不溶的细胞碎片，并且最后提取和纯化核酸。在实验室设置中，使用离屯、分离很容 易移除细胞碎片。不幸地，在实地离屯、机是不容易获得的。最便宜且最简单的解决方案是过 滤未加工的裂解物。我们还试图使用最低限度的设备实现运一目标，我们决定使用普通的 过滤移液器头作为工具用W清除未加工的裂解物(图2)。
[0114] 然后使用SPRI技术提取核酸i9，SPRI技术是最适于用于P0C应用，因为其实质上无 需设备；仅需要磁体。此外，DNA产量可W通过简单地调整对固定的样本投入给予的SPRI颗 粒的量而被精确的控制。本方法另外的优势是其相对低的成本。对于所使用的SPRI珠的量， 我们的方法仅花费几分，并且对整体测定成本的贡献是无关紧要的。使用我们独特组合的 裂解缓冲液和SPRI技术，我们始终实现了来自植物叶组织的DNA 3-5ngAiL和RNA 30-4化g/ yL的产量（图2B和C)。运种精确的水平是重要的，因为在实地情况中，没有简单的无需设备 的定量核酸的方式。对于实践目的，运个浓度的DNA对于下游RPA扩增也是最优的，并且不干 扰读出测定。
[0115] RPA是相对新的等溫核酸扩增方法4。其从TwistDX商业可获得，具有可能地单细胞 水平检测和高达5重RPA反应。相比其他等溫方法选择RPA的另一个重要因素是其试剂盒是 W冷冻干燥的颗粒销售的，并且在室溫稳定，对于在地理位置偏远的地区中应用是十分有 用的特征。我们开发的RPA测定已经被设计用于敏感的和快速的（30-40分钟)检测植物、动 物和人样本中的致病性或非致病性DNA。
[0116] RPA试剂盒的唯一供应商TwistDX，目前销售一种便携式装置，其具有加热器和巧 光计的功能。虽然，运可能提供一种可能的P0C解决方案，但用W购买装置和具有特殊化学 修饰的引物的初始投资可能对实际实施构成限制。此外，用于实际情况中的任何种类的设 备将暴露于不利气候条件，其将严重限制仪器的使用寿命，包括极热和极冷、湿度、灰尘、雨 等。为解决运个问题，我们开发了一种读出方法，其能够在几乎没有成本且没有设备下快速 评估RPA扩增。我们的读出方法是絮凝测定，其利用高度DNA结合能力的SPRI珠（图3)。据我 们所知，运是首次使用已经描述的磁性SPRI颗粒作为读出方法。絮凝测定对P0C应用是首要 有利的，因为它是简单的，并且不需要复杂的仪器，并且在试验需要简单的离散(是/否）结 果的应用中是有用的。最近，已经描述了使用用于比色生物传感的纳米金颗粒的多种示 例2^3。虽然显示是十分敏感的，但除非W高浓度使用，颜色的转变是相对微小的，并且许多 组使用光谱测定验证聚集。相反的，我们的絮凝测定具有更好的视觉对比。运可能由于对比 纳米尺寸的金颗粒，颗粒（1皿)的尺寸更大。如具有增加的DM负载的颗粒絮凝物，它们形成 更大的实体，迅速的沉淀至管底，因此导致溶液的澄清。另一方面，游离的颗粒缓慢地沉淀， 导致浑浊的溶液。
[0117] 通过提高缓冲液pH，颗粒凝集还是可逆的（图3D)，因此进一步支持DNA介导的絮 凝，因为按照定义，絮凝是胶体的一种可逆的非共价聚集24。在更高的抑，DNA带更多的负电， 因此越可能排斥其他DNAW及来自颗粒的表面涂布的簇酸。还可W利用运种抑依赖性，调整 测定对DNA浓度的敏感性。在运个报告中，我们利用运个特征区别外源的大肠杆菌DNA和存 在于RPA酶溶液中的污染物大肠杆菌DNA，其可能由于商业可获得的酶是使用重组技术从大 肠杆菌培养中生产的（图6B)。通过调整抑W控制絮凝，我们能够解释(account for)背景扩 增的水平，并且因此检测由外源的大肠杆菌DM引起的额外的扩增。虽然运是一种简单的解 决方案，运种方法的缺点是缺乏敏感性和视觉对比。由于絮凝的可能性依赖于高分子量DNA 的存在量，使用过量投入的DNA的测定过载能够导致假的聚集或假阳性。然而，由于我们提 取过程的精确，我们有效地避免了运种情况(图2)。
[0118] 最后，通过成功检测直接来自多种宿主标本的多种病原体，证实了 SDG的应用的广 泛范围（图6)。例如，我们检测了植物中的真菌、细菌和病毒;在牛细胞中的瘤疹病毒DNA; HIV前病毒DNA、人组织中的追原虫，甲型流感H1N1病毒W及渗有大肠杆菌的水。本文显示的 多类实例证实在偏远地区用于其他在实地测试应用的广泛的可能性和多功能性。
[0119] 综上，单滴基因组学测定是综合的、实地即用的、通用的、无需设备、多类的DNA和 RNA检测策略，具有在农业、人健康和一般的生物安全的多种应用。
[0120] 在其目前的形式中，SDG准备好用于实地评估。
[0121] 夫1
[0122]
[0123] 实施例2
[0124] 使用DM介导的桥接絮凝进行基因座特异性的DM甲基化快速的、低资源评估
[0125] 将DNA甲基化生物标记物引入临床的挑战在于缺乏简单的方法，由于大多数已经 开发的测定用于研究目的。本文中我们描述了一种高度改进的，与DNA介导的絮凝测定相结 合的甲基蛋白结构域(MBD)富集过程，其用于W纳克量的投入，快速而高度严格的、裸眼二 元评估高度甲基化基因座特异性区域。我们的方法的低资源需求使得在临床基于DNA甲基 化的诊断的广泛适用，并且可W用于小规模研究。
[01%] 材料和方法
[0127] DNA样本制备
[0128] 使用RE化I-g叫tra化St迷你型试剂盒（Qiagen)产生全基因组扩增(WGA)DNA，并 且使用DNeasy血液和组织试剂盒（Qiagen)纯化。然后使用SssI甲基转移酶处理一份WGA DNA过夜，并且纯化W产生高度甲基化的基因组DNA。细胞系衍生DNA也使用DNeasy血液和组 织试剂盒纯化。细胞系购自ATCC并且根据制造商的推荐培养。
[0129] 使用改进的SPRI过程28纯化来自前列腺癌患者的全血DNA。简要地，使用抓TA保存 的全血60化与10化的蛋白酶K溶液(New England Biolabs，肥B)、60化的裂解缓冲液（3M盐 酸脈，2%化iton X)和化L的RNA酶A溶液(4mg/mL)在室溫解育10分钟。然后10化的涂布簇基 的磁珠 （Thermo Fisher)和240化结合缓冲液（lOOmM Tris-HC1，2.5M NaCl，20%w/v PEG8000，pH 8.0)添加到裂解的血液中。在室溫解育10分钟后，使用磁体收集DNA结合磁珠， 并且使用洗涂溶液(400mM盐酸脈，70 %乙醇)洗涂一次，使用70 %乙醇洗涂两次，最后W30y L的水洗脱。两种血液样本均在收集的24小时内加工。人类血液样本经当地伦理委员会授予 批准使用。
[0130] 为产生与MDB富集相匹配的DNA片段大小，使用Msel和MluCI限制性酶(肥B)。简要 地，在37°C，在10化的反应中，使用1个单位的每种酶消化50ng的DNA 30分钟。在消化之后， 使用化L的反应物用于各M抓富集。
[0131] M抓富集
[0132] 使用化imark甲基化DNA富集试剂盒(肥B)，对推荐的说明书进行主要的改进。简要 地，MDB2a-Fc蛋白与10化的蛋白质A磁珠在室溫解育15分钟。然后在化C1改进为300mM 浓度的lx M抓缓冲液中，每个50化的富集反应使用0.扣L的MBD/磁珠混合物。在冰上使DNA 与MBD/磁珠反应15分钟。然后使用化Cl改进为300mM的lx M抓缓冲液洗涂S次，每次5分钟， 用W移除过量的弱结合的DNA。然后使用化L的2.5M NaCl溶液将富集的DNA洗脱。最后，根据 制造商推荐，使用Agencourt AMPure XP SPRI磁珠 (Beckman Coulter)纯化富集的DNA，并 且W化L的水洗脱。然后将化L纯化的DNA用于每个RPA反应。
[0133] RPA 扩增
[0134] 使用具有对推荐的方法进行一些改进的TwistAmp基础试剂盒(TwistDx)进行RPA 反应。简要地，在添加有7mM MgOAc的每个12.5化的反应中使用500nM的引物。在快速的20分 钟的RPA扩增之后，3化在凝胶上进行电泳用W验证扩增。剩下的经SPRI清除，进行去除RPA 反应成分，RPA反应成分能够干扰下游絮凝测定。然后将纯化的扩增子W9.化L的水洗脱。
[0135] 絮凝测定
[0136] 为进行絮凝测定，3化纯化的RPA扩增子与化L Agencoud AMPure XP SPRI磁珠在 室溫解育5分钟。然后使用磁体捕获珠，并且移除上清液。然后立即添加20化的絮凝缓冲液 (200mM醋酸缓冲液抑4.4)，并且允许在磁体上解育额外的分钟。最后，从磁体上移除管，并 且通过轻弹管的侧壁揽拌。阳性测试导致DNA/珠的絮凝沉淀，然而阴性测试中珠很容易再 分散至溶液中。
[0137] DNA的表观遗传改变是可能的疾病生物标记物28dDNA表观遗传改变的一种形式是 胞喀晚/鸟嚷岭二核巧酸(CpG)中的胞喀晚的甲基化(5mC)，特别是在调节细胞过程功能的 启动区的CpG岛（CGI)。然而，大多数方法通过DNA的亚硫酸氨盐转化之后一些形式的测 序3^4检测DNA的甲基化。为避免有关亚硫酸氨盐转化方法的难题，在很多最近的DNA甲基化 研究中，已经采纳使用针对5-甲基胞喀晚产生的甲基结合结构域(MDB)蛋白或抗体的亲和 捕获方法，其通常结合二代测序(NGS)35'36。虽然运些方法用于研究是杰出的，但仍然缺乏用 于常规诊断的检测基因特异性甲基化的更简单并且更方便的方法。尽管已经开发了使用基 于亲和性的方法的多种策略34^*^^满足临床需求，同时避免亚硫酸氨盐处理，但所有方法仍 然需要一些形式的光学读出方法W评估差异甲基化区域(DMR)。
[0138] M抓富集方法的有用特征是在合适的盐浓度下酶接近(almost)二元的特异性35'36， 即，MDB捕获甲基化的DNA或者不捕获。运种二元特征在显著变化的情况中是有用的，例如， 在临床中预测疾病结果的高差异甲基化区域化DMR)。因此，反应运些数字型是/不是的生物 标记物的读出方法是有用的。一种可能的二元读出方法是DNA聚合物介导的桥接絮凝测定。 典型地，絮凝在不同的相之间突然地发生4i^7，MDB富集测定与基于絮凝的读出结合可W产 生用W评估HDMR的快速、低资源的方法。
[0139] 桥接絮凝过程的关键特征是区别长的和短的DNA聚合物片段，运是实现测定的关 键所在。因为桥接絮凝裸眼很容易看见，相比传统的方法，其是十分吸引人的低资源评估系 统，并且更适合于低成本常规临床使用。与其它基于纳米颗粒的方法21^4不同，基于纳米颗 粒的方法颜色转变通常是微小的，并且需要光谱测定验证，在絮凝测定中溶液从浑浊到澄 清的转变具有更好的视觉对比，并且很容易通过裸眼评估，而不需要额外的设备。
[0140] 结果和讨论
[0141] 本文中，我们描述了一种使用MBDW选择性富集甲基化DNA的新的方法（图7)，随后 通过粗略的等溫重组酶聚合酶扩增（RPA)4产生大量的皿MR特异性DNA聚合物。最后，通过 DNA介导的桥接絮凝测定，W裸眼评估扩增的HDMR的存在。仅需要纳克量的初始基因组材 料，并且在目前的条件下，测定对10%的甲基化变化是敏感的。测定在两小时内完成，并且 仅需要最低限度的设备：移液器、加热器和磁体。最后，对一组细胞和全血衍生DNA应用测 定，用W测试S种可能的癌症相关的HDMR的存在。我们相信方法的速度、简易、和低资源需 求可W拓宽在临床中基于DNA甲基化的应用。
[0142] 为了解所述方法（图7)，我们首先酶促片段化50ng的基因组DNA(曲NA)，用于M抓富 集。我们选择酶促片段化投入DNA，因为其是已经建立的且粗略的分子技术，仅需要加热器， 不同于通过声波降解法的物理剪切，所述声波降解法耗时且需要专用设备。选择Msel和 MluCI限制性酶(分别识别序列:TTAA和AATT)的组合，因为它们在人基因组中频繁地剪切产 生与M抓富集相匹配的片段(平均12加 P)，同时避免了CGI的过度片段化，典型地在CGI中发 现HDMR。接下来，使MBD偶联磁珠，随后并入相对高的盐(300mM)缓冲液中选择HDMR36，在进行 结合和洗涂步骤时，在冰上(4°C)进行W便于快速且高严格度富集。使用针对与ESR1基因启 动子有关的GGI(在乳腺癌中已知的HDMR)的引物27,我们首先使用5ng的全基因组扩增(WGA) DM作为未甲基化对照，对比在体外甲基化的5ng WGA DNA作为甲基化对照，测试了M抓富集 步骤。如随后的富集DNA的RPA扩增所指示，在冰上进行全部MBD测定(结合和洗涂），其仅导 致甲基化DNA的高度特异性富集，在约30分钟内性能损失最低（图8A)。运在速度和特异性方 面均显著的提高，超过W前描述的过程36'38，W前描述的过程需要不同的MDB酶的组合和/或 在4°C过夜解育W使用低的投入实现高度严格度。此外，运里使用粗略和快速的等溫扩增进 一步简化和加速了测定。
[0143] 由于裸眼评估可W用于二元诊断结果，例如MBD富集的HDMR，我们使用絮凝测定评 估扩增。由于仅需要最低限度的设备用于评估，絮凝测定也可W适于低资源的环境。在RPA 扩增感兴趣的HDMR后，如概念所证明的，我们使用涂布簇基的固相可逆固定化(SPRI)28磁珠 用于DNA纯化，W使DNA沉淀在珠的表面。然后替代洗脱结合的DNA，引入低抑缓冲液，只有在 大量具有足够长度的RPA扩增子存在时才触发絮凝，其反过来代表M抓富集的HDMR的存在。 如果扩增没有发生，表明缺乏甲基化，1皿的珠很容易分散在溶液中。据我们所知，运是首次 将桥接絮凝测定用于基于MBD/RPA的方法。
[0144] 相信我们现在可高严格度快速地检测HDMR，我们将注意转移到测定的检测极 限，特别是（1)需要产生足够的RPA扩增子W触发絮凝的最低投入和(2)甲基化DNA的最低可 检测的量。为此，我们加工了5ng的gDNA滴定至不同水平的甲基化（100 %、50 %、10 %和 0%)。我们通过凝胶电泳可视化和使用絮凝测定，从低至10%的总DNA投入被甲基化，能够 粗略地检测到存在的甲基化DNA(图2B)。运也表明了可检测到的信号需要最低0.5ng(l〇% 甲基化样本）的初始甲基化DM。考虑到运些数据，我们相信我们的方法对于W纳克范围 (regime)的高度甲基化DNA是特异的且敏感的。
[0145] 最近描述了在磁共振中，使用DNA诱导转变的忍片上MBD/RPA方法W。虽然快速且有 用，但所述方法需要辅助设备W评估RPA扩增子的存在。相反，在相似的时间段和使用更少 的初始材料，通过我们的方法使用裸眼很容易进行结果的评估。此外，我们还证实了我们的 方法从纳克量的DNA投入当中检测低水平(10%)甲基化的能力，虽然运种方法是定性的。
[0146] 最后，为证实对更复杂的生物样本的应用，除了对一组人癌症细胞系的ESR1W外， 我们延伸我们的测定用W评估两种额外的可能的生物标记物GSTP149-5哺NPY52^ 54的甲基化 状态（图9A-C)。为控制严格度，同时还测定了未甲基化的WGA DNA与细胞系衍生的DNA。正如 所预期的，对于所有S种生物标记物测定，在未甲基化的对照中检测到可忽略的RPA扩增， 因此验证了测定的严格度。正如所预期的，我们成功地描述了全部巧巾细胞系样本ESRUNPY 和GSTP1的甲基化状态。此外，本文显示的数据与文献55'56-致，因此强调了我们的方法的准 确度。最后，我们对获得自患有高转移性前列腺癌的男性的全血衍生曲NA的两个样本、W及 一个来自25例正常女性的样本的集合应用测定（图3D)。对于两个前列腺癌样本（PC1和 PC2)，基于存在絮凝，检测到高度甲基化的GSTP1，但是没有检测到ESR1和NPY。对于正常DNA 样本的集合(NB)，如絮凝测定所指示的，所有S种生物标记物是甲基化的。虽然正常DNA样 本的甲基化谱是意料之外的，进一步的研究超出了本报告的范围。然而该数据强调了选择 合适的样本来源对于特异性甲基化生物标记物的重要性。尽管如此，本文的结果证实了我 们的测定使用典型地体液(例如全血)用于常规诊断中的可行性。
[0147] 综上，我们首次描述了基于M抓的快速方法，其用于从纳克量的投入严格富集甲基 化DM。将其与RPA结合，我们能够实现从至少10%甲基化的样本敏感的检测。然后使用简单 的絮凝测定，通过裸眼评估阳性MBD/RPA结果，并且还首次证实了甲基化检测的经典胶体化 学现象。运种方法还延伸到细胞系和全血衍生的样本，W证实其作为诊断工具的可行性。最 后，使用絮凝测定评估阳性MBD/RPA结果使得无标记方法用于低资源应用成为可能，运可W 使常规诊断和小规模DNA甲基化研究受益。
[014引实施例3
[0149] 在前列腺癌中检测尿TMPRSS2:ERG融合
[0150] TMPRSS2-ERG基因融合是前列腺癌主要的分子亚型。大量证据表明TMPRSS2-ERG融 合介导了肿瘤侵袭，与前列腺上皮内瘤(PIN)、前列腺癌的前期病变和前列腺癌本身之间的 组织学区别定义相一致。因此，确定本文公开的"单滴"核酸检测系统是否能够W适用于照 护点诊断的方式检测TMPRSS2-ERG基因融合是有价值的。
[0151] 使用列于表2中的引物，基本上W上述的条件下进行等溫重组酶聚合酶扩增。随后 在基本上W上述的条件下，在包括缓冲液的絮凝中，使用SPRI颗粒检测扩增子。
[0152] 如在图10中所示的，RT-RPA之后对Du化P RNA扩增子进行DNA测序。使用SPRI磁珠 纯化提取的Du化P RNA的RT-RPA扩增子，并测序，其验证了祀标TMPRSS2:ERG区域的扩增。图 11显示从10例转移性去势抵抗性前列腺癌患者和健康患者的尿液标本提取的RNA进行的 RT-PCR。通过琼脂糖凝胶电泳可视化RT-PCR扩增子验证了絮凝测定对相同患者群的筛选结 果（图11c)。在图12中，比较在全尿和尿沉渣中RNA的稳定性，证实了在标本收集后0、2和12 小时之时提取患者全尿和尿沉渣RNA的RT-RPA。
[0153] 综上，运些数据显示本文公开的"单滴基因组学"概念是理想地适合于快速且有效 检测包含TMPRSS2-ERG基因融合的核酸，所述TMPRSS2-ERG基因融合作为可能存在前列腺癌 细胞的诊断指标。
[0154] 表2:寡核巧酸序列
[0155]
[0156] 实施例4
[0157] 滚环扩增产生的扩增子用于单滴基因组学
[0158] 滚环扩增(RCA)是一种快速的等溫核酸扩增，该方法已经被广泛地用于检测疾病 生物标记物5^9。由于RCA产生长的（千碱基）的DNA聚合物，其可能用于需要足够的合适长度 的DNA的DNA介导的桥接絮凝读出。DNA介导的桥接絮凝读出测定的优势在于结果可W在现 场使用裸眼评估，并且因此对于低资源设置的应用是有用的。在本研究中，我们证实了RCA 扩增和桥接絮凝读出的组合用于快速、低资源检测农业上重要的病原体下香假单胞菌 (PSY)的可行性。
[0159] 材料和方法
[0160] 环探针设计
[0161] 从国家生物技术信息中屯、(NCBI)GenBank获得下香假单胞菌(Psy)基因组序列。进 行生物信息学分析，并且鉴定候选祀标Psy序列。候选序列经BLAST捜索鉴定在其他生物中 同源的DNA片段。应特别注意寻找在Psy基因组中存在但在其他生物不存在的序列。选择在 数据库中任何可提供的序列中显示不具有同源性的片段。基于单一序列，鉴定CViPII切口 位点，并设计了单链环探针，其是具有6 4 n t的序列5 ' - TGGTCTTAAAAACTCTTTCGTTGTCATTGGGATAGGCGATTCTAAATTTCTCAACGAAATCTGG-3 ' r切日 PSr;SEQ ID N0:28)。
[0162] 在含有IX CircLigase II反应缓冲液（33mM Tris-乙酸盐(pH 7.5)，66mM乙酸钟 和0.5mM DTT)、2.5mM MnCl2和IM甜菜碱的20山反应中，通过使lOpmol的单链环探针与抓的 CircLigase iKEpicen化e)混合而制备环探针。反应物在60°C解育16小时，随后在80°C进 行 10分钟W失活CircLigase II。
[0163] 消化基因组DM
[0164] 在含有IX CutSmad缓冲液(50mM乙酸钟，20mM Tris-乙酸盐，10mM乙酸儀aOOiig/ ml BSA)的20山反应中，使用抓的CViPII切口酶(肥B)消化50ng的Psy基因组DNA和植物基因 组DNA。消化首先在37 °C解育90分钟，随后在65 °C进行20分钟的变性步骤。
[01化]滚环扩增(RCA)
[0166] 在含有在IX Phi29缓冲液(50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM(NH4)2S〇4,4mM DTT) 中的抓Klenow片段（3'一5'exo)(肥B)、抓的曲i29DNA聚合酶(肥B)和125nM的每种dNTP的 20山反应中，使lOOnM的环探针与25化g的切口酶消化的基因组DNA混合。反应混合物在37°C 解育30分钟。在棚酸钢缓冲液中，使用1.5%的琼脂糖凝胶通过凝胶电泳分析产物。由于线 性RCA的性质，如通过凝胶电泳所指示的，预期的产物大小范围从少至25个碱基至超出10个 碱基。
[0167] 絮凝测定
[016引在室溫下，5化的RCA反应与10化的Agencourt Ampure XP SPRI珠解育5分钟，W使 RCA产物结合到磁珠表面。然后使用磁体分离负载DNA的珠，并且使用70%乙醇洗涂1次，然 后允许风干1分钟。在珠中添加30化的絮凝缓冲液（lOOmM醋酸缓冲液，pH 4.4)，解育另外1 分钟之后通过轻弹管的侧壁揽拌。
[01~]结果和讨论
[0170] 为了解应用，我们首先将PSY基因组DNA(曲NA)渗入到5ng的宿主植物曲NA背景中 (拟南芥，图13)。正如所预期的，通过梯度/拖尾谱（laddering/smearing profile)所指示 的，仅在存在PSY(1-10%)中产生高分子量产物，但是在植物DNA(0%)中没有，运指示RCA测 定的特异性。因此，仅当RCA成功时，出现DNA介导的絮凝(1-10%渗入样本），因此证实RCA产 生的产物的絮凝读出的可行性。
[0171] 最后，为模拟实际农业应用，我们收集了表现不同程度感染表型的宿主植物叶 (S1-5,图14)。使用RCA和絮凝读出，我们在早至S1检测到PSY的存在，S1代表感染的症状前 水平。健康的化)和没有模板的(NoT)对照没有扩增，且因此没有看见絮凝，运指示方法的特 异性。
[0172] 综上，DNA介导的桥接絮凝读出与RCA产生产物相匹配，并且可用于快速的、敏感 的、化资源检测病原体序列。将絮凝测定用于RCA产生的产物的应用被证实成功地检测了感 染的宿主植物叶中的PSY。
[0173] 贯穿本说明书，目的在于描述本发明优选的实施方案，不在于将本发明限制在任 一个实施方案或具体的特征的集合。在不背离本发明的情况下，可W对描述和示例的实施 方案进行各种改变和修改。
[0174] 本说明书中所提及的每个公开的专利和科学文献、计算机程序和算法通过引用^ 其整体并入。
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【主权项】
1. 一种检测核酸的方法，所述方法包括使分离的核酸与颗粒结合的步骤，其中所述分 离的核酸与所述颗粒能够形成可以通过视觉观察检测的复合物。2. -种用于检测核酸的试剂盒，所述试剂盒包含能够与分离的核酸形成复合物的颗 粒，所述复合物能够通过视觉观察被检测到。3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其进一步包含以下的一种或多种：用于核酸序列扩增 的酶;一种或多种用于核酸序列扩增的引物;磁体;一种或多种用于核酸提取的试剂;过滤 器;和/或一种或多种反应容器。4. 根据权利要求1所述的方法或者权利要求2或权利要求3所述的试剂盒，其中所述复 合物是通过核酸与颗粒絮凝形成的。5. 根据前述权利要求任一项所述的方法或试剂盒，其中与在没有或相对低的量或浓度 的核酸中观察到的絮凝相比，通过没有或相对减少的絮凝指示核酸的存在或相对量。6. 根据前述权利要求任一项所述的方法或试剂盒，其中所述颗粒是顺磁性颗粒。7. 根据权利要求6所述的方法或试剂盒，其中所述顺磁性颗粒是SPRI颗粒。8. 根据权利要求7所述的方法或试剂盒，其中在絮凝缓冲液中发生絮凝。9. 根据权利要求8所述的方法或试剂盒，其中所述絮凝缓冲液是pH(i)低于7; (ii)约pH 3·6-5·5;或者（iii)约pH 4.4。10. 根据权利要求8所述的方法或试剂盒，其中所述絮凝缓冲液的pH是絮凝后半定量滴 定的。11. 根据前述权利要求任一项所述的方法或试剂盒，其进一步包含着色剂，用以促进、 帮助或提高核酸:颗粒复合物的视觉检测。12. 根据前述权利要求任一项所述的方法或试剂盒，其中所述核酸是靶标核酸通过核 酸序列扩增产生的扩增产物。13. 根据权利要求12所述的方法或试剂盒，其中通过聚合酶链式反应(PCR)进行核酸序 列扩增。14. 根据权利要求12所述的方法或试剂盒，其中通过等温核酸序列扩增进行核酸序列 扩增。15. 根据权利要求14所述的方法或试剂盒，其中等温核酸序列扩增是重组酶聚合酶扩 增(RPA)或滚环扩增(RCA)。16. 根据权利要求12至15任一项所述的方法或试剂盒，其中所述扩增产物扩增自靶标 核酸，所述靶标核酸通过以下连续步骤获得：（a)包含靶标核酸的核酸样本的重力过滤；（b) 使靶标核酸与颗粒结合;和(c)从颗粒洗脱靶标核酸。17. 根据权利要求16所述的方法或试剂盒，其中在步骤(b)和步骤(c)中靶标核酸的体 积是约5至10yL。18. 根据前述权利要求任一项所述的方法或试剂盒，其用于检测致病性或非致病性生 物。19. 根据权利要求18所述的方法或试剂盒，其中所述致病性生物是植物病原体。20. 根据权利要求18所述的方法或试剂盒，其中所述致病性生物是人或其它动物的病 原体。21. 根据权利要求1至20任一项所述的方法或试剂盒，其用于检测一种或多种与疾病或 病症有关的生物标记物。22. 根据权利要求21所述的方法或试剂盒，其中所述一种或多种生物标记物包含肿瘤 抗原或标记物和/或肿瘤抑制基因。23. 根据权利要求21所述的方法，其中所述一种或多种生物标记物包括核苷酸序列多 态性。24. 根据权利要求23所述的方法，其中所述一种或多种生物标记物包括一种或体细胞 突变和/或单核苷酸多态性(SNP)。25. 根据权利要求21所述的方法，其中所述一种或多种生物标记物是表观遗传事件或 与表观遗传事件有关。26. 根据权利要求25所述的方法，其中所述表观遗传事件包括DNA甲基化和/或DNA羟甲 基化事件。27. 根据权利要求21或权利要求22所述的方法或试剂盒，其中所述疾病或病症包括癌 症、肿瘤、淋巴瘤、白血病和其它恶性肿瘤，感染性疾病，炎症性疾病，自体免疫性疾病，呼吸 道疾病，胃肠疾病，神经疾病，生殖系统疾病和/或精神疾病。28. 根据权利要求1至20任一项所述的方法或试剂盒，其中所述方法用于检测环境样本 或来源中的核酸。29. 根据权利要求28所述的方法或试剂盒，其中所述环境样本或来源是水、空气和/或 土壤样本。30. 根据权利要求29所述的方法或试剂盒，其中所述水样本是废水和/或污水。31. 根据权利要求30所述的方法或试剂盒，其中所述废水或污水是排水、雨水、矿业或 工业废水。32. 根据权利要求29所述的方法或试剂盒，其中所述水样本是饮用水、游泳池水、河水、 溪水、湖水、池水或海水。33. 根据权利要求1至20任一项所述的方法，其中所述方法用于检测食品、饮料或其它 消费品样本中的核酸。
【文档编号】C12Q1/68GK106062210SQ201480070522
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2014年12月23日
【发明人】M·特劳, E·威, J·R·博泰拉
【申请人】昆士兰大学