一个检测水溶液pH的比率型荧光探针的制作方法

本发明提供了一个基于激发态质子转移机理的可用于检测水溶液pH的比率型荧光探针。该探针中连接在萘酰亚胺4位上的酚羟基可以发生酸碱反应从而显著改变分子的光学性能。在pH范围4.39-7.97内，荧光比率与水溶液的pH具有线性关系。另外，在pH范围4.22-6.63内，该探针也可对pH进行比色检测。

背景技术：

水溶液的pH对环境、生物的生理和病理等过程具有重要意义。

荧光探针是检测pH的有效手段之一。近年来，检测pH的荧光探针已得到长足的发展(Han，J.；Burgess,K.Chem.Rev.2010,110,2709.)。一个具有应用前景的pH荧光探针应具有合成简单、灵敏、选择性好、斯托克斯位移大、可进行比率检测、信号线性响应的范围宽等优点。但是同时具备以上优点的pH荧光探针却并不多见。例如，应用广泛的荧光探针BCECF的激发光谱随pH变化，从而可以对pH进行比率检测，然而该探针斯托克斯位移很小(Rink,T.J.；Tsien,R.Y.；Pozzan,T.J.Cell Biol.1982,95,189.)；一些商业化的pH荧光探针(Life Technologies)，如Blue DND-167、Blue DND-192、Green DND-189、Green DND-153、Green DND-26等，机理是光致电子转移(PET)，不能比率检测pH,并且只能在较窄范围内检测pH；最近，Lee等人报道了一个具有信号线性响应范围宽特点的pH荧光探针，基于荧光素和罗丹明的开环反应，该探针可以在pH范围4-8内对pH进行比率检测(Lee,M.H.；Han,J.H.；Lee,J.H.；Park,N.；Kumar,R.；Kang,C.；Kim,J.S.Angew.Chem.Int.Ed.2013,52,6206)，然而该探针的斯托克斯位移相对较小。根据我们的文献调研，基于激发态质子转移机理(ESPT)的检测pH的荧光探针还未见报道。因此继续开发性能更加优异的用于检测水溶液pH的荧光探针具有重要意义。

技术实现要素：

本发明就是针对上述问题，提供了一个具有大斯托克斯位移的、线性响应范围宽的检测水溶液pH的比率型荧光探针。该探针中连接在萘酰亚胺4位上的酚羟基可以发生酸碱反应从而显著改变分子的光学性能。在pH范围4.39-7.97内，荧光比率与水溶液的pH具有线性关系。另外，在pH范围4.22-6.63内，该探针也可对pH进行比色检测。

本发明采用如下技术方案：N-吗啉乙胺基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺分子在一定pH范围内以内盐形式(结构式1)和质子化形式(结构式2)的混合物存在于水溶液中。在基态时，溶液中结构式1和结构式2的比例随pH变化而变化。利用结构式2的酚羟基中的氢原子在激发态下发生的质子转移反应生成脱质子激发态产物结构式1。从而实现激发光谱随pH变化，对pH进行比率检测。

所述荧光探针的结构式为1或2。

以上结构式应用于检测水溶液的pH，其特征是结构式1(2)表示的化合物得到(失去)氢离子后生成具有结构式2(1)结构的化合物，导致溶液吸光度、激发光谱、发射光谱变化。

理论计算表明，该荧光探针检测pH的原理是激发态质子转移。应用Gaussian09程序，DFT和TD-DFT理论，采用PCM溶剂化模型，在B3LYP/TZVP水平下，得到了结构式2与3个水分子形成的复合物的基态稳定构型和激发态稳定构型(均经过频率分析验证)。如图2所示，分子被光激发后，酚羟基氧原子a与氢原子b之间的距离由增大为而氢原子b与水中氧原子c的距离则由缩短为根据最早由Eigen(Eigen,M.；Kruse,W.；Maass,G.；de Maeyer,L.React.Kinet.1964,2,285)和Weller(Weller,A.React.Kinet.1961,1,187-214)提出的激发态质子转移模型，该体系形成了接触离子对，接触离子对在周围环境中水的作用下彼此分离，从而形成处于激发态的脱质子形式的荧光分子。这就解释了为什么结构式1和结构式2在水溶液中发射相同波段(峰值约在550nm)的光。

本发明的有益效果：在一定范围内，该化合物在不同pH下荧光和吸收光谱发生显著改变，可用于高灵敏性地比色和比率检测水溶液的pH。

附图说明

图1本发明提供的荧光探针检测pH的原理示意图；

图2结构式2在水溶液中发生激发态质子转移的计算结果(键长，单位)示意图；

图3实施例2中探针溶液的吸收光谱和在445nm处的吸光度(A⁴⁴⁵)随pH的变化示意图，分别用(a)、(b)表示；

图4实施例2中用445nm的光激发探针溶液得到的发射光谱(F₄₄₅)和550nm处的荧光强度()随pH的变化示意图，分别用(a)、(b)表示；

图5实施例2中用380nm的光激发探针溶液得到的发射光谱(F₃₈₀)和550nm处的荧光强度()随pH的变化示意图，分别用(a)、(b)表示；

图6实施例2中探针溶液在550nm处的激发光谱和荧光比率(445/405，表示用445nm激发得到的550nm处的荧光强度与405nm激发得到的550nm处的荧光强度 的比值被归一化后的数据)随pH的变化示意图，分别用(a)、(b)表示；

图7实施例3中金属离子对荧光强度的影响示意图；

具体实施方式

实施例用于进一步说明本发明，但本发明不限于实施例。

实施例1(探针的合成)：

探针的合成：向100mL单口烧瓶中加入0.50g N-吗啉乙胺基-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺，加入50ml氢碘酸(45％)，回流反应10小时。冷却至室温后，缓慢加入碳酸钾至溶液pH等于4，过滤得黄色固体，所得固体经柱层析纯化得N-吗啉乙胺基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺。¹H NMR(400MHz,d⁶-DMSO)δ(ppm):8.53(dd,1H,J＝8.2Hz),8.46(dd,1H,J＝7.2Hz),8.35(d,J＝8.4Hz,1H),7.77-7.73(m,1H),7.13(d,1H,J＝8.0Hz),4.17(t,2H,J＝7.0Hz),3.55(t,4H,J＝4.6Hz),2.60-2.50(m,6H).¹³C NMR(d⁶-DMSO,100MHz)δ(ppm):164.20,163.47,161.26,134.13,131.61,129.77,129.48,125.96,123.02,122.21,112.65,110.57,66.58,56.12,53,82,36.91.HRMS(ESI)Calcd for C₁₈H₁₉N₂O₄[MH⁺]327.1345,found 327.1358.

N-吗啉乙胺基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺经过水的溶剂化作用，即得到结构式1和2的混合物——检测pH的荧光探针。

实施例2(探针溶液的吸收、激发、发射光谱随pH的变化)：

将N-吗啉乙胺基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺溶解于DMSO得到贮备液a；在离心管中，向特定pH的4950μL PBS(浓度为50mM的磷酸盐缓冲溶液)加入50μL贮备液a，混匀，得到探针浓度为10μM的样品。测量其吸收光谱；分别用445nm和380nm的光激发样品以获得发射光谱；测量在550nm波长处样品的激发光谱。

实验结果如图3-6所示。

在pH 4.22-6.63范围内，随着pH降低，探针溶液在445nm处吸收峰降低，在380nm处吸收峰升高，所以探针可以作为一个比色型的检测pH的探针(线性相关系数R²＝0.9931)，根据探针溶液在445nm处的吸光度(A⁴⁴⁵)，可以计算出表观pKa＝5.3(图3)；用445nm的光激发探针溶液得到550nm处的荧光强度()与pH在4.39-6.63范围内存在线性关系，线性相关系数R²＝0.9978(图4)；用380nm的光激发探针溶液得到的550nm处的荧光强度()与pH在4.55-5.66范围内存在线性关系，线性相关系数R²＝0.9906，值得指出的是探针的斯托克斯位移达到了170nm(图5)；探针溶液在550nm处的激发光谱在一定范围内随pH变化，归一化的荧光比率的线性响应区间随激发波长发生移动，得到荧光比率与pH在4.39-7.97范围内存在线性关系(线性相关系数R²>0.99)，表明该探针是一个线性响应范围宽的比率型的检测pH的荧光探针(图6)。

实施例3(金属离子对荧光强度的影响)：

将N-吗啉乙胺基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺溶解于DMSO得到贮备液a；在离心管中，向特定pH的4950μL PBS(浓度为50mM的磷酸盐缓冲溶液)加入50μL贮备液a，混匀，得到探针浓度为10μM的样品。将金属盐溶液(母液为24mM或40mM) 加入到离心管中，混匀。用445nm的光激发样品，测量在550nm波长处样品的荧光强度。

实验结果如图7所示。1为对照，2：NaCl(1mM)，3：KCl(1mM)4：CaCl₂(1mM)5：MgCl₂(1mM)，6：ZnSO₄(100μM)，7：Cd(NO₃)₂(100μM)，8：Pb(NO₃)₂(100μM)，9：CoCl₂(100μM)，10：NiCl₂(100μM)，11：MnCl₂(100μM)，12：CrCl₃(100μM)，13：[Cu(CH₃CN)₄]PF₄(100μM)，14：Fe(NH₄)₂SO₄(100μM)，15：CuCl₂(100μM)，16：FeCl₃(100μM)。金属离子对探针荧光强度的影响几乎可以忽略。