基于荧光染料在支化聚醚骨架上的多聚的明亮荧色物的制作方法

本发明涉及具有提高的亮度的荧光染料及其使用方法。

背景技术：

缀合到抗体的荧光染料通常用于免疫荧光（immunofluorescence）分析。最近二十年来，业已开发了众多抗体、荧光染料、流式细胞仪、流式分选仪和荧光显微镜的变体，以确保靶细胞的特异性检测和分离。免疫荧光法技术中的一个问题为荧光发射的检测阀值，其可以例如通过较好的检测器、过滤器系统或改性的荧光染料提高。

常规小分子荧光染料分子的局限性为其受限的亮度。因此，生物分子通常用多个染料分子标记以提高荧色物缀合物的亮度。大多数上述荧光染料分子，例如若丹明或花青，包含平面的芳族发色团，其易于疏水相互作用，产生具有低荧光或不具有荧光的染料-染料二聚体。因此，经标记的生物分子的荧光强度并不与所述生物分子的荧光染料的标记程度成比例。在较高的标记程度（degree of labeling，DOLs）下，单种染料的荧光强度由于通过二聚体、三聚体或多聚体形成引起的自猝灭机理而可能甚至降低。

这些不期望的形成已经通过将提高水溶解度的取代基加到平面的芳族染料分子中降低到某些程度。文献中所述的合适取代基可以向染料分子赋予电荷，例如在美国专利号5,268,486和6,977,305、6,130,101和Panchuk-Voloshina等人，J. Histochem. Cytochem. 47（9），1179（1999）中描述的例如磺酸酯基团，或例如在WO2013056720中描述的磷酸酯基团。其他合适的减少二聚的取代基为大体积水溶性聚合物，例如在专利申请WO2009078970中描述的聚乙二醇，或例如在美国专利号6,913,743和7,655,217中描述的带电荷树状聚合物。尽管相对于未被取代的母染料这些被取代的染料的生物分子缀合物在较高的标记程度（DOLs）下获得较高的亮度，但是即使就未被取代的母染料而言在较高的DOL下仍然偏离了经标记的生物分子的荧光强度和标记程度之间的线性比例。

缀合物的亮度还受生物分子上可利用的官能化位点的数目的限制，所述生物分子可以在不损失生物分子活性的情况下官能化。结果，生物分子缀合物的DOLs仍受限制，例如对于抗体（IgG），在亲水标记的情况下，其通常在4-8范围中（R. P. Haugland，Current Protocols in Cell Biology（细胞生物中的现有方案）（2000）16.5.1-16.5.22）。因此这些缀合物的亮度仍差于例如藻胆蛋白的缀合物，藻胆蛋白例如藻红蛋白（PE）或别藻蓝蛋白（APC）。

藻胆蛋白及其生物分子缀合物的高荧光强度归因于藻胆蛋白内存在多个荧光团亚基。R-藻红蛋白例如包含34个藻胆素荧光团亚基（A. N. Glazer，J. Appl. Phycol. 6，105（1994））。因此藻胆蛋白(例如PE或APC)的生物分子缀合物例如在流式细胞法中是普遍的，尽管其缺点来源于其蛋白质性质，例如对非生理学溶剂、温度和pH值的受限的稳定性以及其受限的光稳定性及其通常受限的储存寿命。另一个缺点为不同颜色的受限的可利用性，这限制单荧光试验内的复用能力(multiplexing capability)。

已努力通过将荧光团配置到精确的超分子结构中以避免经激发的荧光团的自猝灭来构建具有藻胆蛋白样荧光性质的多发色团构造。Benvin等人，J. Am. Chem. Soc. 129（7），2025（2007）描述了插入到超分子DNA模板中的荧光染料。然而，这种方法的缺点为DNA骨架内的荧光团的非共价连接。染料分子迁移出DNA骨架会导致荧光信号的损失。在多颜色实验的情况下，标记不同的DNA骨架之间的染料交换会产生假阳性荧光信号。在采用多种颜色的多参数实验的情况下，可建议使用共价连接的荧光团。

用于生物分子标记的另一类明亮荧光染料为基于半导体聚合物的荧光聚合物，例如，譬如在美国专利号8,158,444、8,354,239和8,802,450以及8,362,193、8,455,613和8,575,303中所述的聚芴。当聚合物内的有效缀合长度限制于9-10个单体亚基时，这些聚合物还包含多个荧光团亚基。

通过在水溶性骨架上使常规荧光染料分子多聚来制备较明亮的荧光染料迄今未产生用于生物分子标记的化合物。推荐例如右旋糖苷的荧光标记为在3000MW范围中每个右旋糖苷0.3-0.7个染料分子，在10,000MW范围中0.5-2个染料分子，在40,000MW范围中2-4个染料分子和在70,000MW范围中3-6个染料分子。由于其大尺寸和大体积，这些染料多聚体在生物分子标记中不提供益处且不适用于制备具有藻胆蛋白样荧光强度的生物分子缀合物。具有较高的标记程度的荧光标记的右旋糖苷由于染料-染料相互作用表现出猝灭。这发现用于美国专利号5,719,031中，其中右旋糖苷-荧光染料-缀合物的标记程度足够高以提供荧光猝灭。右旋糖苷-荧光染料-缀合物的酶降解伴随着荧光发射信号的增强，这用于定量酶消化过程。

对用于标记生物分子的改进的荧光染料仍存在相当大的需要，其提供藻胆蛋白样荧光强度，而没有藻胆蛋白和荧光聚合物的限制。

技术实现要素：

因此本发明的一个目的在于提供具有高荧光强度、低非特异性背景染色和对固定的稳定性的荧光染料标记。

意料不到地，发现在支化聚醚骨架（例如多臂聚乙二醇）上多聚的荧光染料具有高荧光性而不具有可注意到的猝灭。另外，聚醚骨架似乎降低荧光染料非特异性连接的趋势。

本发明的一方面允许定制荧光染料标记在光稳定性和对不同环境条件例如温度、pH和溶剂的稳定性方面的性质。在本发明的另一方面，提供了宽范围的不同激发和发射波长。在本发明的另一方面，保持生物分子活性，尽管高数目的荧光团亚基存在于生物分子-荧光染料缀合物中。

在本发明中，可能将高程度的荧光团标记引入到生物分子中而不具有活性损失或提高的非特异性连接，例如，在抗体的情况下，获得大于10、优选等于或大于15的荧光团DOL，产生具有藻胆蛋白-缀合物状荧光强度和低的非特异性的背景染色的抗体荧色物缀合物。

因此，本发明的一个目的为根据通式I的荧光染料：

其中

C为包含20-200个原子的核部分；

S为相同或不同的包含1-10个碳原子的醚残基；

n为2-500范围的整数；

m为0-500范围的整数；

x为2-50范围的整数；

y为1-50范围的整数；

R为相同或不同的残基，其包含能够与生物分子形成共价键的反应性基团；

F为相同或不同的共价连接到（S）_n的荧光团。

所述核部分C提供用于聚醚残基（S）_n和（S）_m的多个（x+y）连接点。R包含能够与识别细胞结构如抗原的生物分子形成共价键的反应性基团。

附图说明

参考下图描述各种例示性细节，其中：

图1a-1e表示通过流式细胞法测量的用与以下物质缀合的CD4抗体（克隆Vit4）染色的外周血单核细胞（PBMC）的点状图的对比：图1a，异硫氰酸荧光素（FITC）；图1b，与支化PEG多聚的荧光素（PEG-FAM）；图1c，Alexa Fluor 488（AF488）；图1d，与支化PEG多聚的Alexa Fluor 488（PEG-AF488），或（1e）R-藻红蛋白（PE）。

图2表示通过流式细胞法测量的用与以下物质缀合的CD4抗体（克隆Vit4）染色的五种不同供体的T协助细胞（CD4明亮阳性）的中值荧光强度（MFI）和染色指数（SI）：FITC、在支化PEG上多聚的荧光素（PEG-FAM）、Alexa Fluor 488（AF488）、在支化PEG上多聚的Alexa Fluor 488（PEG-AF488）或PE。

图3表示，与用缀合到常规异硫氰酸荧光素（FITC）的所述CD4抗体染色相比，针对在缀合到人CD4抗体（克隆Vit4）的在8-支链聚乙二醇上多聚的荧光素（PEG-FAM）而言，提高的DOL对T协助细胞的染色的作用。在所有情况下，抗体染色浓度为3µg/mL。

图4a表示CD4-PEG-FAM染色的未固定的和甲醇固定的T协助细胞的直方图；图4b表示CD4-PE染色的未固定的和甲醇固定的T协助细胞的直方图。

在所有图中，具有PEG亚基的荧光染料为根据本发明的。

具体实施方式

根据本发明的荧光染料可以通过本领域技术人员已知并进一步在本专利申请的实施例中公开的标准化学方法制备。

例如，根据本发明的优选荧光染料在以下通式II和III中表示：

。

在式（II）和（III）中，Z为F和R中的至少一个，且p为n和m中的至少一个（取决于相应的聚醚支链是否连接到F或R，条件是包含至少两个F和至少一个基团R。F、R、n和m具有如业已公开的含义。

荧光团F

用于本发明的荧光团F经由聚醚骨架连接到核部分C且可以为任何有机荧光染料分子。通常，发现这种荧光团在有机染料激光器中用作激光染料。业已发现可以缀合到生物分子的被取代形式用作流式细胞法和荧光显微镜法中的标记。

优选地，荧光团F选自吨染料、若丹明染料、香豆素染料、花青染料、芘染料、嗪染料、吡啶基唑染料和吡咯亚甲基染料。

在本发明的一个变体中，荧光团F再一次被赋予水溶性的取代基取代，所述赋予水溶性的取代基选自磺酸酯、膦酸酯、磷酸酯、聚醚、磺酰胺和碳酸酯。使用具有磺酸酯取代基的荧光染料特别有利，例如由Thermo Fisher Scientific Inc.提供的Alexa Fluor族染料。每个荧光团的磺酸酯取代程度可以为2或更多，即对于若丹明染料或花青染料。与未磺化的染料相比，使用磺化的染料产生在聚醚骨架上多聚的荧光团的甚至更明亮的缀合物，这可以在图2中发现：用在支化PEG上多聚的Alexa Fluor 488（PEG-AF488）的CD4缀合物染色的T协助细胞的亮度（平均MFI 98）几乎为用在支化PEG上多聚的荧光素（PEG-FAM）的CD4缀合物染色的T协助细胞的亮度（平均MFI 55）的两倍。

荧光团F可以通过本领域已知的方法连接到聚醚骨架，即通过使具有对氨基或巯基具有反应性的基团的荧光染料与具有氨基端基的支化聚醚骨架反应。

核部分C

核部分C可以为包含1-100个碳原子的任何结构，这允许x+y个聚醚残基（S）_n和（S）_m的连接。

用于本发明的有用的核部分为多羟基化合物、多氨基化合物和多巯基化合物。优选为多羟基化合物，例如具有四个羟基作为3-4个聚醚残基经由醚键的连接点的季戊四醇、具有六个羟基作为3-6个聚醚支链经由醚键的连接点的二季戊四醇、具有八个羟基作为3-8个聚醚支链经由醚键的连接点的三季戊四醇或六聚甘油。

三季戊四醇 六聚甘油

聚醚残基S

聚醚残基（S）_n和（S）_m由醚单体单元S组成，其每个单体亚基S各自可以包含1-10个且优选1-4个氧原子。这些聚醚支链可以为均聚的或共聚的，即交替或嵌段共聚物。聚醚残基（S）_n和（S）_m可以为直链或支链的，尤其在使用具有2个或更多个氧原子的单体单元的情况下。在本发明的一个优选实施方案中，聚醚残基包含聚乙二醇链，即S代表残基-CH₂CH₂O-且n、m独立为10-200范围的整数。

在本发明的一个特别有用的实施方案中，市售多臂聚乙二醇（支化PEGs）用作包含核部分和聚醚支链的骨架。多臂聚乙二醇例如由Nanocs Inc.或NOF Corporation商业化。

反应性基团R

根据本发明的荧光染料经由基团R连接到包含反应性基团的生物分子。基团R应当能够用官能团例如氨基和巯基经由生物分子的反应性基团形成共价键。R或（S）_m/（S）_n包含能够与相应的其他基团形成共价键的亚基。例如，具有氨基端基的聚醚基团（S）_m/（S）_n为市售的，其例如可以与包含羧基官能团的R基团反应。本领域技术人员在选择合适化学中将不具有困难。包含这种反应性基团的R的例子例如为活性酯（例如N-羟基琥珀酰亚胺酯、四氟苯基酯、五氟苯基酯、磺基二氯苯基酯、亚胺酯、异硫氰酸酯、异氰酸酯）、磺酰卤、酰基卤、酰基叠氮化物、单氯三嗪、二氯三嗪、醛、乙二醛、马来酰亚胺、碘代乙酰胺、肼、叠氮硝基苯基、亚磷酰胺、炔、烷基叠氮化物、二烯或烯丙基。

还可能经由反应性基团R形成共价键，所述反应性基团R为能够与带有合适的反应性基团的反应底物反应的官能团。适用于连接反应的官能团可以例如由氨基、巯基、羟基或羧基构成。

还可想到在聚醚支链上使用具有低反应性的另外的反应性基团R’，目的是保持荧光团分开以避免染料-染料相互作用。这些低反应性基团R’可以为氢原子、烷基、三氟烷基、芳基、卤素基团、磺酰基、磺酸酯基团、膦酸酯基团、磺酰胺基团或其组合。上述反应性基团R中至少一种对根据本发明的荧光染料的性能来说是必要的。

荧光生物分子缀合物

本发明的另一个目的为包含经由基团R缀合到至少一个生物分子的如已公开的一个或多个荧光染料的荧光生物分子缀合物，所述至少一个生物分子选自各自为天然的或重组体的免疫球蛋白、抗体、抗体片段、Fab、Fab'、F（ab'）₂、sdAb、scFv、di-scFv。

本发明的生物分子缀合物通过使生物分子与荧光染料的反应性基团R反应或通过使活化的生物分子与荧光染料的合适官能团R反应制备。

适用于与本发明的荧光染料缀合的生物分子可以为蛋白质、肽、糖、核酸、脂质及其组合。这些生物分子能够连接到连接配偶体，例如分析物、细胞表面标识物、抗原等，以便标记、检测和定量所述分析物、细胞表面标识物、抗原等。

抗体片段可以通过重组程序合成，所述重组程序包括包含这些类型的分子的共价和非共价缀合物。

在本发明的一个实施方案中，生物分子选自肽/MHC-复合物、用于细胞黏附的受体或共刺激分子、受体配体、抗原、半抗原结合剂、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、适体、引物和连接酶底物。优选地，受体例如为用于细胞黏附的部分或共刺激分子且半抗原结合剂为抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白。核酸可以例如为适体、引物或连接酶底物。

用荧光团标记的支化聚醚骨架标记的生物素结合剂（例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白）使得能够经由生物素化的主要检测分子进行敏感度检测，原因是所述主要检测分子的多种生物素化的乘法效应。

在本发明的一个实施方案中，生物分子为具有各自带有4-6个荧光团基团的2-7个荧光聚醚标记的IgG抗体，导致每个抗体分子8-40个染料分子的荧光团DOLs，优选超过10个荧光团单元的荧光团DOL，最优选15或更多个荧光团单元的DOL。

在本发明的又一个实施方案中，生物分子缀合物包含一个或多个荧光染料，其中至少一个生物分子与各自包含1-10个(包含和10个)荧光团F的2-20个荧光染料缀合。优选超过一个荧光染料存在于生物分子缀合物中。

工业适用性

本发明的生物分子缀合物和/或荧光染料特别可用于利用通过生物分子缀合物识别的某些抗原组的细胞检测、计数或分离。

因此，本发明的另一个目的为通过流式细胞法和/或通过荧光显微镜法分析用根据本发明的荧光生物分子缀合物标记的细胞或组织的方法。因此，所述方法可以包括用所述荧光生物分子缀合物标记，并进行流式细胞法和荧光显微镜法中的至少一种。

在本发明的另一个实施方案中，一个或多个标记的细胞落从样品检出并作为靶细胞分离。通过缀合物检出的细胞优选通过静电力、压电力、机械分离或光声装置从样品分离。适用于这种分离的尤其为流式分选仪，例如，基于FACS或MEMS的细胞分选仪系统，例如在EP14187215.0或EP14187214.3中所公开。

在本发明的另一个实施方案中，细胞或组织样品上的生物分子缀合物的连接靶标的位置通过荧光显微镜法测定。荧光显微镜法的合适方法包括表面荧光显微镜法(epifluorescence microscopy)、共焦激光扫描显微镜法、多光子显微镜法、全内反射荧光（TIRF）显微镜法、单平面照明显微镜法（SPIM）和超分辨率显微镜法，例如，受激发射耗散（STED）显微镜法、随机光学重建显微镜法（STORM）、光活化定位显微镜法（PALM）或空间调制照明（SMI）显微镜法。

实施例

实施例1

步骤A：在8-臂PEG上多聚的AF488（PEG-AF488）的制备

将氨基-PEG（8-臂）在pH 7下以10mg/mL的浓度溶解在0.5M PBS缓冲液中。将溶解在DMSO中的AF488, NHS酯（2mg/mL）以20倍摩尔过量加入并在室温下在黑暗中孵育30分钟。通过SEC在标准条件下除去游离的染料。所得的PEG-AF488具有5.7的DOL。

通过相同程序使用NHS-荧光素（NHS-FAM）获得PEG-FAM。

步骤B：CD4抗体与PEG-AF488连接

步骤A中获得的PEG-AF488（2.5mg/mL，在磷酸盐缓冲盐水中）通过加入10倍摩尔过量的SMCC并在室温下孵育1小时来活化。并行地，CD4抗体（克隆Vit 4）通过与10mmol/L二硫苏糖醇反应1小时还原。马来酰亚胺活化的PEG-AF488和还原的抗体的两者在Sephadex G25上用磷酸盐缓冲盐水（pH 7.2，包含2mM EDTA）进行缓冲液交换。将马来酰亚胺活化的PEG-AF488以15倍过量加到还原的抗体中并在室温下在黑暗中孵育1小时。反应产物通过SEC纯化。所得的CD4-PEG-AF488具有13.2的DOL。

使用相同的方案将CD4连接到PEG-FAM。

步骤C：用缀合到在8-臂PEG上多聚的荧色物的CD4抗体对PBMC染色。

对于染色实验，10⁶个外周血单核细胞（PBMC）各自再悬浮在100µl包含2mM EDTA和0.5% BSA的磷酸盐缓冲盐水中。细胞用以3µg/mL在步骤B中所获得的相应的CD4抗体缀合物染色并在室温下孵育10分钟。复染用CD3-APC和碘化丙啶进行以排除死细胞。

与R-藻红蛋白（PE）或非多聚的荧色物FITC或AF488缀合的市售CD4抗体用于对照。

细胞在室温下在黑暗中孵育10分钟。洗涤通过离心和再悬浮在1mL包含2mM EDTA和0.5% BSA的磷酸盐缓冲盐水中进行。染色细胞在MACSQuant 10分析仪上分析。图1显示使用以下物质的荧光强度相对于侧向散射（SSC）的点状图例子：图1a，异硫氰酸荧光素（FITC）；图1b，与支化PEG多聚的荧光素（PEG-FAM）；图1c，Alexa Fluor 488（AF488）；图1d，与支化PEG多聚的Alexa Fluor 488（PEG-AF488），或（1e），R-藻红蛋白（PE）并通过流式细胞法测量。

图2表示5种供体的PBMC的中值荧光强度（MFI）和染色指数（SI）结果。

用根据本发明的荧色物标记的抗体染色的细胞的亮度至少为用母荧色物标记的抗体染色的细胞的亮度的两倍且为用藻胆蛋白标记的抗体（CD4-PE）标记的细胞的同等水平。图3表示，与用缀合到常规异硫氰酸荧光素（FITC）的所述CD4抗体染色相比，对于缀合到人CD4抗体（克隆Vit4）的在8-支链聚乙二醇上多聚的荧光素（PEG-FAM），提高的DOL对T协助细胞的染色的作用。在所有情况下，抗体染色浓度为3µg/mL。

荧色物是否还被磺化成AF488（Alexa Fluor）尤其有利。用在8-臂PEG上多聚的AF488（PEG-AF488）标记的所得的抗体缀合物的亮度约为由在8-臂PEG上多聚的荧光素制得的相应缀合物的亮度的两倍。

实施例2：甲醇固定对染色强度的影响。

外周血单核细胞根据实施例1所述进行染色，排除碘化丙啶作为复染剂。对于甲醇固定，将1mL甲醇加到100µL细胞悬浮液中并在冰上孵育30分钟。细胞用1mL包含2mM EDTA和0.5% BSA的磷酸盐缓冲盐水洗涤两次并在其中再悬浮。在MACSQuant 10分析仪上分析染色并固定的细胞并与未固定细胞对比。图4a和4b表示CD4-PEG-FAM染色的未固定和甲醇固定的T协助细胞（图4a）和CD4-PE染色的未固定和甲醇固定的T协助细胞（图4b）的直方图。CD4-PEG-FAM的荧光强度相对于甲醇固定是稳定的，而CD4-PE的荧光强度表明降低了5倍。

因此，本发明的荧光生物分子缀合物和/或荧光染料显示对环境影响(例如固定)表现出改进的稳定性。

虽然结合上文概述的例示性性实施描述了各种细节，在回顾以上公开内容之后，各种备选方案、修改、改变、改进和/或实质等效物，不管已知的或当前无法预料或可能当前无法预料的，可以变得显而易见。因此，上述例示性性实施旨在说明而非限制。