一种碳量子点纳米材料及其制备方法和应用与流程

本发明属于具生物学功能的有机碳量子点合成技术领域，涉及微波可控辅热促进巯基乙胺调谐柠檬酸与聚乙烯亚胺合成荧光聚合物或碳点的制备方法，具体涉及一种碳量子点纳米材料及其制备方法和应用。

背景技术：

随着基因组高通量测序技术的迅速发展，研究人员积累了许多物种的基因组序列，这些物种的研究也随之进入了功能基因组时代。其中，生物信息学预测出的许多基因需要进行功能鉴定及功能互作的研究，因此，多种新颖的，精准的基因功能研究技术不断涌现，如基因编辑技术，RNA干扰，基因定点突变，基因定点插入。这些技术都需要将构建的外源核酸分子递送进相应细胞内才能发挥作用，而且更重要的是能获得转基因植株。目前，植物转基因受体系统中，体细胞胚胎再生体系可以实现再生植株的目标，而且已在多种植物中成功构建，一些已经进行工厂化生产，并且获得的转基因植株的表型也能通过植物表型组学高通量性状分型及表型-基因组数据关联分析技术进行有效的收集分析。因此，高载荷量，稳定，高效甚至多种大片段核酸共转染的基因转染技术成为各个植物物种基因工程迫切需求的关键技术。但是传统的病毒，农杆菌介导的将外源遗传物质引入植物细胞内表达的技术，具有受体材料易污染，转染物种范围窄，转染质粒长短有限等局限性，而基因枪，显微注射，电击法，等常规物理方法存在转化成本高，效率低，难以转化具有细胞壁的植物细胞，细胞易损伤等问题，难以满足日趋迫切的植物完整细胞高效转基因的需求。表面能够修饰功能基团，具有多功能的纳米材料作为核酸运载工具在动物中已广泛开展研究，所研究出的材料具有吸附、压缩DNA，保护DNA不被酶切降解，转基因效率高等优点；而且纳米材料以其较小的粒径、表面活性，能够被植物细胞吸收至胞质内，由其结构与表面电荷的不同，能够特异性定位到不同的亚细胞结构中，甚至通过植株内运输系统，特异性地在分生组织中富集。一些纳米材料能够具有发射波长范围窄，荧光发射强度高等优异的荧光性能。因此，以纳米材料开发应用于植物的高载荷，高效率纳米基因递送载体势在必行。

聚乙烯亚胺(PEI)，是一种含有丰富氮原子的聚阳离子高分子聚合物，其具有1KDa到1000KDa的宽分子量范围，它分为线状和分枝状两种分子结构，结构骨架(-CHI-CHZ-NH-)中每3个原子就存在一个氨基，其可以在生理条件下发生质子化，使得PEI具有较高的正电荷密度，通过静电吸附作用和带负电荷磷酸基团的核酸发生电性中和，能够有效地吸附，压缩带负电荷的核酸分子，形成稳定的纳米-核酸复合物，表面电荷呈中性或弱阳性，与表面带负电荷的细胞膜相互作用而进入细胞内，而且能够保护核酸分子免受细胞溶酶体中降解酶的降解，在酸性内涵体中发生质子化，吸附内涵体中离子，改变内外水势，导致外部离子内流，使内涵体膨胀破裂，即产生“质子海绵效应”，从而释放出从PEI游离出来的核酸分子或PEI与核酸分子的复合物，促进核酸转运至细胞核，实现基因稳定转染。经过进一步与其他功能性分子修饰，能够获得较高的靶向性和转染效率。所以聚乙烯亚胺是应用于动物细胞的一种具有较高转染效率的体外转染阳离子聚合物，被广泛用作核酸类基因药物的阳离子聚合物载体系统。但是PEI潜在的细胞毒性会随着分子量的增加，而明显增大，尤其是平均分子量为25000的PEI。其次PEI表面过多的具正电荷的基团以及分散的结构，在应用于外层具有细胞壁的植物完整细胞的核酸递送时，常常仅吸附在细胞壁表面。由于这些缺点的存在，限制了PEI的应用。但据文献报道，使用柠檬酸与低分子量的PEI水热反应合成高/超分子聚合物，在单个分子上富集PEI的带正电的基团，提高质粒吸附量，提高了转染效率；将亲水性的多聚物如PEG修饰在PEI上，降低了表面正电荷，同时也降低了毒性。目前，已有研究表明，利用分子量（MW）为25,000的PEI作为高效原生质体瞬时表达质粒递送载体，在pH为7.0的条件下50μL溶液中结合质粒DNA，TEM负染色检测其形成了100-200nm的纳米尺寸的复合物，在N/P比为5时转染拟南芥原生质体平均效率达到65%。而高正电荷基团的聚酰胺-胺型树枝状高分子（PAMAM）能够递送质粒进入具有细胞壁的植物细胞中，实现转基因。

碳量子点（C-dots）作为具有独特物理化学性质，特别其具有良好的生物相容性的第四主族为原料合成的纳米材料，目前已被广泛应用到生物传感、药物载体和荧光成像等不同生物医学研究领域。相对于其他纳米材料而言，C-dots作为一种新型的具有荧光性质的零维碳纳米材料，具有以下优势：①C-dots的相对分子质量和粒径都小，直径一般在1~10 nm；碳是自然界分布最普遍的元素之一，也是构成地球上一切生命体最重要的元素。例如，生命体的基本结构单元氨基酸、蛋白质、核苷酸等的骨架都是由碳元素组成的，因此，C-dots通常对生命体是无毒的或低毒性的，具有良好的生物相容性和环境友好性；③具有一元激发多元发射的荧光性质，同时还具有优异的宽吸收窄发射特性。在C-dots具有生物学和材料学多个优点的基础上，以细胞自身存在的有机物结合已有的功能性大分子，或直接以特殊细胞内含物如硅藻等合成小粒径的碳量子点等纳米材料已有研究报道。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的第一个目的是提供一种碳量子点纳米材料，具有转基因效率高，可降解，毒性低等特点。本发明的第二个目的是提供一种上述碳量子点纳米材料的制备方法。本发明第三个目的是提供上述碳量子点纳米材料的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种碳量子点纳米材料的制备方法：取柠檬酸、巯基乙胺、聚乙烯亚胺，溶于超纯水中，搅拌混匀，超声处理，在120 – 170 ℃，微波加热处理，将反应合成完的混合物经透析袋在超纯水中透析，完成后真空旋转干燥仪干燥，收集材料即可。

所述的碳量子点纳米材料的制备方法，柠檬酸与巯基乙胺质量比不小于1，聚乙烯亚胺与巯基乙胺的质量比为1-5。

所述的碳量子点纳米材料的制备方法，超声功率为200 W、频率为28 KHz，超声3 min。

所述的碳量子点纳米材料的制备方法，其特征在于：微波功率是500 W，加热10 min。

所述的碳量子点纳米材料的制备方法，在45 ℃的超纯水中透析36 h，10 h换一次超纯水。

所述的碳量子点纳米材料的制备方法所获得的碳量子点纳米材料。带正电荷，粒径小，具有高亮度荧光的碳量子点，其能吸附带负电荷的物质，如核酸分子，以适合的配比结合形成的复合物能够亲和细胞壁，并且与细胞膜互作，激活细胞内吞作用，进入细胞内，实现外源物质的递送。

所述的碳量子点纳米材料作为细胞壁荧光标记物的应用。

所述的碳量子点纳米材料作为促进动植物细胞内吞及高效吸收外界溶液的材料的应用。

所述的碳量子点纳米材料作为实现递送核酸转染具细胞壁的植物完整细胞的材料的应用。

有益效果：针对现有技术中存在的不足，本发明其有以下优势：

一、合成方法简单高效：本发明所使用的反应底物都能够在水中溶解，因此采用水分散体系，溶解无苛刻条件，使用微波合成仪，可方便的调节参数实现巯基乙胺的调谐合成功能。

二、产物性能可调谐：本发明合成的聚合物或碳量子点有在紫外光照下可以发出高亮度的蓝白色荧光，也有不具荧光的材料，但其在其他方面如正电性等性能会相对更加优异。具有高亮度荧光的材料可应用于荧光可视化分析，而高正电性的材料可以作为吸附载体，吸附装载核酸，药物或营养物等货物。

三、屏蔽表面活性基团，利于细胞壁扩散，激活细胞内吞：与仅使用柠檬酸和巯基乙胺合成的高分子聚合物相比，本发明获得的材料具高亮度的荧光发光，粒径小而均匀，水相分散度很高，不形成团聚物。而且不粘附在细胞壁外表面，能够进入细胞壁中弥散，可应用为细胞壁活性荧光染料。碳量子点在超纯水中保存两年后，荧光特性不发生改变。

四、实现生物学功能多：本发明合成的材料基于带有高正电荷的阳离子聚合物，以及具有潜在生物活性的巯基乙胺，以及生物糖代谢中间产物柠檬酸，经微波可控辅热合成的复合物的毒性可调整的非常低，而且能够将反应底物的各自的功能进行整合，如PEI吸附质粒等带负电的物质等，并且获得更多性能如高亮度的荧光发光。所以本发明所诉的调谐合成方法可优化合成适合多个应用场景的材料，如适用于细胞壁生物成像的高亮度碳量子点；以正电荷基团吸附并递送质粒的核酸递送载体，刺激细胞内吞的材料等。

附图说明

图1是实施例1在白光、紫外光照射下的合成材料图；

图2是实施例1合成材料的DLS粒径图；

图3是实施例1合成材料的Zeta电位图；

图4是实施例1合成材料的紫外吸收光谱图；

图5是实施例1合成材料的荧光光谱图；

图6是实施例1合成材料在蔡司显微镜不同荧光通道下的荧光发光图；

图7是实施例1合成材料与鹅掌楸悬浮系细胞共孵育24h后低倍镜下（100×）检测细胞中荧光分布图；

图8是实施例1合成材料在超纯水中处理鹅掌楸悬浮系单细胞后的细胞荧光分布图；

图9是实施例1合成材料在PBS中处理鹅掌楸悬浮系单细胞后的细胞荧光分布图；

图10是实施例1合成材料与鹅掌楸悬浮系细胞共孵育48h后的细胞紫外吸收与荧光光谱图；a，紫外吸收光谱；b，超纯水空白对照组荧光光谱；c，PBS与合成材料处理组荧光光谱；d，超纯水与合成材料处理组荧光光谱；

图11是实施例1合成材料与鹅掌楸细胞吸附36h后细胞的流式荧光检测图谱图；a为经合成材料处理的细胞图谱，b为未处理的细胞图谱；a-1，b-1：λ_ex = 355 nm， λ_em = 410 – 510 nm通道检测荧光强度与细胞粒度（SSC）的细胞分布图谱；a-2，b-2： λ_ex = 355 nm、λ_em = 410 - 510和λ_ex = 488 nm、λ_em = 490 - 570 nm通道检测荧光强度的细胞分布图谱；

图12是实施例2使用实施例一合成材料吸附质粒后的与鹅掌楸悬浮细胞共孵育24h后介导细胞转染图；实现瞬时表达；

图13是实施例3优选反应物配比与反应条件合成的荧光碳点在超纯水中激活细胞内吞作用图；红色箭头所示结构为内吞泡膜，绿色箭头所示结构为内吞泡内部。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的具体范围。

实施例1

将0.15 g 柠檬酸，0.13 g 巯基乙胺，0.1 g 聚乙烯亚胺（Mw = 800），溶于3 mL 超纯水，搅拌混匀，超声（功率200 W，频率28 KHz）3 min，170 ℃，单模微波合成仪（功率500 W）加热10 min，将反应合成完的混合物经透析袋（Mwco: 1000）在45 ℃的超纯水中透析36 h，10 h换一次超纯水，真空旋转干燥仪干燥后收集材料，用紫外灯（305 nm，365 nm）检测荧光发光，如图1所示，合成材料在白光下呈透明的棕黄色，在紫外灯（305 nm，365 nm）下具有高亮度的荧光发光。马尔文粒径仪检测合成材料的DLS粒径和Zeta电位值，其粒径约0.7 nm，相对较小；所带为正电荷，约+8.18 mV，因此其能够吸附带负电的质粒，以及亲和吸附带负电荷的细胞壁，见图2和图3。如图4所示使用紫外/可见分光光度计紫外吸收光谱可发现其紫外吸收波长范围为300 - 400 nm，最大紫外吸收峰在350 nm左右。荧光分光光度计检测其荧光光谱。发现其荧光发射波长范围在400-525 nm之间，最大荧光发射波长在450 nm左右，见图5。将材料用1 μL的移液枪，滴加在载玻片上，在60 ℃烘箱中烘干，于蔡司荧光显微镜荧光检测通道下检测荧光发光。其能在多个荧光检测通道如FITC（λex = 455-495 nm，λem = 505-555 nm），CFP（λex = 426-446 nm，λem = 460-500 nm）中被检测到，见图6。将制备的材料与悬浮系单细胞共孵育，在蔡司荧光显微镜中，使用低倍物镜，其视野里的所有细胞的细胞壁都具有合成材料特异性荧光，表明其荧光强度高，如图7所示。

用300目细胞筛取悬浮培养的鹅掌楸单细胞，平分后3000 rpm离心8 min，吸去上清，分别加入细胞培养PBS（pH = 7.4）溶液和超纯水，吹打悬浮细胞后，取两种细胞悬浮液各2 mL，分别加入100 μL 合成材料，混匀，分别以未加纳米材料的细胞悬浮液作对照组。23 ℃，暗培养，24h后取500 μL清洗两次后蔡司荧光显微镜检测合成材料吸附细胞结果；对比图8与图9发现使用透明的棕黄色合成材料处理用超纯水或PBS悬浮的细胞，在共孵育中，溶液由透明的黄色，变的无色透明，细胞清洗后，超纯水体系下结合合成材料的细胞呈棕黄色，而PBS体系下结合合成材料的细胞的棕黄色较浅，合成材料可能被细胞吸收降解。分析超纯水对照及PBS环境下细胞的荧光分布，合成材料与鹅掌楸细胞共孵育24 h后，都能够在整个细胞壁中分布，特别是未直接接触溶液分裂后期细胞的细胞板中也检测到荧光信号（图9橙色箭头所示），表明荧光碳点在细胞壁的分布不具有特异性，而且可能在细胞壁中能够扩散的。在48 h后使用紫外/可见分光光度计，荧光分光光度计测量清洗两次后的细胞的紫外吸收光谱和荧光光谱。由图10所示，经过合成材料分别在超纯水与PBS中共孵育处理的悬浮系单细胞的紫外吸收光谱与荧光光谱，在超纯水中经合成材料处理后的紫外吸收光谱与未处理的较为相似的图谱，而细胞在PBS中经合成材料处理后的紫外吸收光谱与前两者明显不同，随检测波长的增加吸收强度呈逐渐下降趋势；比较这三个处理组的荧光光谱，可知，在PBS中经合成材料处理的细胞具有的材料特异性荧光波峰与超纯水中经合成材料处理的细胞的材料特异性荧光发射波峰相比更为显著；合成材料仍然需要外界溶液中特异性离子在共孵育48h后使细胞产生质壁分离，并激活内吞，在与壁分离的细胞膜内侧形成圆形较明显的具有合成材料特异性荧光的内吞泡。

对每隔7天继代2次悬浮培养的悬浮细胞在第三次培养的第三天进行300目细胞筛多次过筛，获得大小适合流式细胞仪检测或筛选的细胞，与荧光碳点合成材料共孵育36 h后，用PBS清洗3次后，再次悬浮进行流式细胞仪相应荧光通道检测。

在利用合成材料的荧光对与悬浮细胞相互作用的可视化研究基础上，通过过筛获得大小适合流式细胞仪检测分选的悬浮系单细胞，将其在PBS中经合成材料处理后，用流式细胞仪检测，处理后细胞粒度（SSC）更加集中，比空白对照形成明显的峰型，λex = 355 nm，λem = 410-510 nm的检测通道适合检测合成材料的荧光，共孵育后的细胞与对照相比，在此通道下检测发现具有更高荧光强度的细胞个数相对增多，表明合成材料对细胞亲和吸附的能力较好，有较多细胞具有合成材料的特异性高强度的荧光，见图11。

实施例2

将20 μL实施例1合成的材料在水体系分散的，与10 μg质粒加入超纯水中，补足总量为50 μL，在超声波清洗仪中冰浴超声震荡3min，置于暗处静置结合30 min后，加入经300目细胞筛过筛鹅掌楸悬浮系单细胞中，混匀，然后转移到细胞培养板，添加1 mL超纯水，24 h后观察荧光碳点在鹅掌楸悬浮系细胞中的分布。由实施例1可知合成材料具有一定的正电荷基团，能够通过静电作用吸附质粒，与细胞共孵育能够吸附细胞壁，如图12所示，吸附GFP绿色荧光蛋白表达质粒能够递送进入细胞中表达，使整个细胞质都存在高亮度的绿色荧光，这与单独使用合成材料与细胞相互作用后荧光分布是明显不同的，合成材料能够递送质粒进入具有细胞壁的完整植物细胞内表达。

实施例3

使用反应底物的不同配比，在不同反应温度下经微波合成仪10 min反应合成材料，将0.15 g 柠檬酸，0.08 g 巯基乙胺，0.2 g 聚乙烯亚胺（Mw = 800），溶于3 mL 超纯水，搅拌混匀，超声3 min，150 ℃，微波合成仪加热10 min，将反应合成完的混合物经透析袋（Mwco: 1000）在45 ℃的超纯水中透析36 h，10 h换一次超纯水，真空旋转干燥仪干燥后收集材料，取200 μL与1 mL鹅掌楸悬浮系单细胞在3 mL超纯水中进行共孵育24 h，用荧光显微镜检测发现细胞中材料特异性荧光发现，合成的样品处理的细胞中出现了质壁分离，而且在多个细胞出现了多个分布在细胞膜内侧的具有特异性荧光的内吞泡，可能在此条件下合成的样品能够激发细胞内吞作用。如图13所示。

本发明是使用巯基乙胺调谐聚乙烯亚胺与柠檬酸，由微波辅助可控水热合成法制备出碳量子点，反应底物中聚乙烯亚胺为分子量可变的阳离子聚合物，控制不同分子量的聚乙烯亚胺和巯基乙胺用量的质量比范围为1~5之间，控制反应温度（120 - 170℃）和反应时长（6 - 10 min），有利于设置不同条件，辅助巯基乙胺调谐聚乙烯亚胺与柠檬酸的水热合成产物的性能变化，可优选出具有高水相分散性，低细胞毒性的植物活细胞的细胞壁荧光标记物，或促进动植物细胞内吞及高效吸收外界溶液的材料，或实现递送核酸转染具细胞壁的植物完整细胞的材料。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围内。