专利名称：一株高效降解有机污染物的细菌及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种具有降解土壤持久性有机污 染物苯并芘功能的细菌。
背景技术：
研究表明，工业生产中燃料的不完全燃烧、石油开釆、污水灌溉、焦炭 生产、金属冶炼、汽车尾气等都能产生有机污染物多环芳烃。多环芳烃对人体的毒性表现在强致癌、致突变及致畸性。人类及动物癌症病变有70%~90% 是环境中化学物质引起的，而多环芳烃则是环境致癌物中最大的一类。吸入 大气中吸附在微粒上的多环芳烃而导致的肺癌占总肺癌病变的85%以上，长 期暴露在含高浓度多环芳香烃的烟气、石油分馏、莉青及煤产品等环境中， 皮肤癌即肺癌发病率很高。苯并[a]芘(BaP)是多环芳烃中最具代表性且具有强致癌性的物质，它 是含5个环的稠环芳烃，已经被许多国家和组织的环保和卫生机构确认为应重 点监测和关注的致癌危险物。空气中苯并[a]芘污染的主要来源有下列几个方面(1)工业锅炉和家用 炉灶燃煤研究表明我国主要为燃煤型污染，大同巿作为我国主要的产煤基 地之一，其能源结构以耗煤为主，燃煤占全巿的总耗能的99%以上，据分析， 全巿苯并[a]芘的日均值达到330ng/i^[马西林,丁中华，刘瑞莲等.大同巿空 气中多环芳烃与人尿中1-羟基芘的分析.环境化学,1994,13(6):536 542]。唐书 彦等研究了包头巿大气中BaP在9年中的含量，表明巿区内BaP的含量为 0.90ug/100m3—2.77ug/100m3，且冬春(釆暖期)大气中苯并[a]芘的含量高于 夏秋(非釆暖期)，工业区附近的大气BaP含量高于非工业区[唐书彦，侯莉 英.包头巿城区大气中BaP浓度十年监测浅析[J].内蒙古环境保护，1995, 7 (1): 31~34]。 (2)工业生产lkg燃料在燃烧过程中产生的苯并[a]芘量为: 煤67mg 136mg;木材40mg ~ 68mg;汽油12mg ~ 50.4mg。某些工厂周围lkm 内大气中的苯并[a]芘浓度为焦化厂0.13吗/100mS 57.8pg/100m3,炼油厂0.03ng/100m3 ~ 5.04ng/100m3，冶炼厂0.87吗/100m3 ~ 3.06pg/100m3。焦化和石油化工的兴起大大增加苯并[a]芘对环境的污染，焦化厂附近500米处的浓度 比一般工业城巿高出500- 1000倍。在半敞开的焦炉沥青加热附近4m处的苯 并[a]芘浓度高达78ug/m3 [蹇兴超.多环芳烃(PAH)的污染.环境保护，1995, 10: 31 33]。 (3)交通据报道汽车每行驶lkm排出的BaP量为8 10mg。随着机 动车数量的增加，路面交通堵塞的升高，在一些公路交通路口苯并[a]芘污染 也曰趋严重。此外，在公路隧道中，由于空气污染扩散。致癌性苯并[a]芘浓 度相当高。(4)垃圾焚烧和森林失火；(5)烹调动物蛋白烹炸过程中可以 产生苯并[a]芘，散发到厨房中，从而进入人体，这可能是导致炊事人员呼吸 道肺癌发病率增加的主要原因。烤鸭车间空气样品中含有苯并[a]芘，某三处 酒家厨房油烟中苯并[a]芘含量为0.373pg/100m3 1.483|ig/100m3 [袁彥华,孙 连军，郭秀兰等.多环芳烃化合物环境污染研究.环境与健康杂志，1999, 16(3): 182~185]。 6)烟草烟气吸烟严重的家庭室内空气中苯并[a]芘浓度比不吸 烟的家庭高10倍以上[朱利中，刘勇建，松下秀鹤等.室内空气中多环芳烃的 污染特征、来源及影响因素分析.环境科学学报,2001, 21(1): 64 68]。 一些国 家和组织对肺癌产生的可能因素进行了调查研究，初步认为吸烟比大气污染 对肺癌的增长具有更直接的关系。每天吸烟20支的人可吸入0.6pg 0.8^ig苯并 [a]芘，吸烟者比不吸烟者肺癌的危险性高2倍。土壤中苯并[a]芘的主要来源是工业渗漏，固体废物和大气沉降。不同区 域的土壤中苯并[a]芘的含量不同。自然区土壤中苯并[a]芘的含量为1.5-28.0 pg/kg，石油污染灌溉10余年的土壤苯并[a]芘含量为50 15(Hig/kg,工业区特 别是老工业区的土壤的含量一般为350 56(^g/kg，老的炼油厂区的土壤高达 12000 |ig/kg，飞机场附近的植被和土壤中多环芳烃含量比其它控制污染区高 8 ~ 9倍[王连生.多环芳烃分析技术.南京大学出版社，1988]。我国食品受苯并[a]芘污染的主要途径有以下几个方面(1 )烟尘污染 煤炭、石油、木材等的不完全燃烧，产生的苯并[a]芘附着在不完全燃烧的颗 粒上进入空气，经过沉降作用附着于植物表面或土壤中，被叶和根吸收。据 调查，工业区生产的菜籽，苯并[a]芘的含量为215.5pg/kg，而农业区同类作 物仅含有2.69ng/kg。 (2)废水、废气污染生产炭黑、炼油、炼焦、合成橡胶、沥青等行业的废水、废气中含有大量苯并[a]芘。废水排入江河湖海中， 通过食物链将苯并[a]芘浓缩于鱼、虾、贝、海菜等水产品中。某地调查鳗鱼 中苯并[a]芘含量为lng/kg 2.7pg/kg,远高于海水中的含量。沥青中苯并[a] 芘的含量高达2.5%~3.5%，喷烧沥青时苯并[a]芘散发在空气中，对环境和空 气造成极大污染。汽车排放的废气是环境和食物中苯并[a]芘增加的一个重要 来源，燃烧lkg汽油可排放12pg 50吗的苯并[a]芘。(3)食品加工过程中的 污染生鱼、生猪肉、生羊肉等一般检出苯并[a]芘的量极少，但烧烤后含量 明显增加。烤制食品常用的燃料有煤、木炭、焦炭、煤气和电热等，其食品 与燃烧产物直接接触，除烟尘中的苯并[a]芘可使食品遭受污染外，烘烤时有 机物受热分解，亦经环化，聚合形成苯并[a]芘，从而使食品中的苯并[a]芘含 量增加。苯并[a]芘对人体的致癌剂量为13.3mg。由于苯并[a]芘的五个苯环的排列 是非对称的，而使得各结合键上的电子密度有明显的差异。苯并[a]芘的4,5-键(菲环双键)具有高电子密度(被称之谓"K区")。易与细胞内的大分子(如DNA, RNA等)发生共价结合，有可能破坏DNA和RNA的正常功能，主要是使DNA 的遗传信息发生改变，引起细胞致突变，从而引发癌变。大量动物试验已证 实苯并[a]芘能够引发肺癌、皮肤癌、胃癌等癌变[朱雨辰，曹晓煜.浅谈苯并 [a]芘[J].江苏环境科学，1999， 12(4): 43~44]。其代谢产物的毒性作用通 常是经过氧化代谢过程产生的中间体与大分子反映导致靶细胞结构和功能的 改变，终代谢产物二氢二醇环氧苯并芘(BPDE)不仅能和DNA形成加合物， 而且代谢过程中产生的大量活性氧簇(ROS)也会造成DNA损伤。DNA损伤 后如果得不到及时修复，就会在复制过程中产生突变，最终致癌。微生物降解苯并[a]芘有两种途径:一种是作为微生物的唯一碳源和能源,另 一种是共代谢或共氧化作用。虽然多环芳烃的去除途径主要靠微生物降解,但 苯并[a]芘因其分子结构内苯环的高度密集,以及其高的辛醇水分配系数,而具 有很强的难降解性。共代谢是指微生物在有可利用的唯一碳源时，对它原来不 能利用的物质也能分解代谢的现象[程国玲,李培军,王凤友等.多环芳烃污染 土壤的植物与微生物修复研究进展[J].环境污染治理技术与设备,2003， 4(6): 30-36]。当一级基质存在时,一级基质的代谢能提供足够的碳源和能源,供微生物生长，并诱导产生相应的降解酶,从而降解二级基质,共代谢被认为是降解难降解有机物的主要方式。苯并[a]芘被细菌降解时，在双加氧酶的进攻下,一 般先在碳4，5 、 9，10 、 11，12位置上生成顺式二氢二醇2苯并[a]芘,然后相应 的二氢二醇2苯并[a]芘之间的化学键分别断裂，生成开环化合物，该类化合物 进一步被降解[巩宗强，李培军,王新等.真菌对土壤中苯并(a)芘的共代谢降解 [J].环境科学研究，2001, 14 (6): 36 ~ 39]。本发明是从长期受到有机污染的农田土壤中分离、筛选到一株具有高效 降解苯并[a]芘功能的细菌。该菌株可以用于降解环境中的有机污染物苯并[a] 芘，在修复菜地和农田有机污染方面具有广阔的应用前景。 .发明内容(一) 要解决的技术问题本发明的目的是提供一株高效降解有机污染物的细菌，本发明的又一目 的是公开该细菌的应用。(二) 技术方案本发明所述的短波单孢菌CB vww/^o"a5 sp.),该菌株已于2008年11月 17曰被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称 CGMCC,保藏编号为CGMCCNo. 。该菌经形态、生理生化特征分析和16srDNA基因序列同源性分析，鉴定 为变型细菌a亚群柄杆菌科短波单孢菌属CBwvM"Amw7^sp.)。该菌最适生长 温度为3(TC，最适生长pH为7 8。该菌形态特征菌落形态圆形凸起，表面光滑湿润，乳白色，边缘规则； 菌体形态菌体细杆状，G-,长2um，宽0.3um。 生理生化特性 接触酶反应阳性； 氧化酶反应阳性；生长温度4"不生长，28"生长，37。C不生长；耐盐性试验2。/。NaCl生长，5。/。NaCl生长，7。/。NaCl不生长；苯丙氨酸脱氨酶试验阳性；利用柠檬酸盐阴性；水解淀粉阴性； 卵黄卵磷脂酶阴性； 甲基红试验阳性； V. P试验阴性； PH5.7生长阴性；糖醇发酵产酸葡萄糖阳性，甘露醇阳性，乳糖阴性，蔗糖阴性。 该菌能高效降解苯并[a]芘，可应用于修复菜地和农田有机污染。 (三)有益效果本发明所述的短波单孢菌(^^w/"&wo"w sp.)在实验室条件下培养30天 对土壤中的苯并[a]芘降解率达到80%,在修复菜地和农田有机污染方面具有 很好的应用前景。本发明所述的短波单孢菌(5^vw"^mo"必sp.),该菌株已于2008年11月17 曰被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC, 保藏编号为CGMCC No.。
图1是本发明所述短波单孢菌CS^vww^mo"as sp.)在液体培养条件下的生 长曲线；图2是本发明所述短波单孢菌CBwvw"Amw20s sp.)在液体培养条件下对苯 并[a]芘的降解曲线；图3是本发明所述短波单孢菌(5^vw"Amo/ms sp.)对土壤中苯并[a]芘的降解曲线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。 实施例1 本发明所述短波单孢菌08 ^ ^//附0 05 sp.)的分离称取10g沉积物样到90ml无菌水中，加入一定量的玻璃珠，摇床中振荡 3h。静置30min后，移取5ml上清液到45ml含有苯并[a]芘终浓度为5mg/1 的无机盐培养基中，25°C, 150r/min避光培养。以后每隔8d移取适量菌液至 新的无机盐-苯并[a]芘液体培养基中富集培养，连续富集培养32d后，移取混 合菌液稀释至l(T6，涂布于2216E培养基平板上分离、纯化，记录单菌落形 态并斜面保存菌种。2216E培养基(1000ml): pH7.6-7.8，蛋白胨5g,酵母浸膏lg,轔酸高 铁0.01g，陈海水1000ml。无机盐培养基(NH4)2S04 0.5g/l， NaNO30.5g/l, CaCl2 0.02g/l， KH2P04 1.0g/l， NaH2PO41.0g/l, MgSO40.2g/l， pH7.5。实施例2本发明所述短波单孢菌(^"^" ^> 0"^5口.)的对苯并[3]芘的降解降解实验在装液量为250ml的三角瓶中进行。溶液中苯并[a]芘的浓度为 5mg/l。接入本发明所述短波单孢菌(^^vw"&mowwsp.)的菌悬液，使培养液中 初始细胞浓度达到2.0x 107个/ml，同时设不接菌对照，各3个重复，在28'C 下振荡培养l、 2、 4、 6、 8、 10d后，取样分析培养液中苯并[a]芘的含量及活 菌数。实验结果为活菌数量在第6天的数量达到了3.5xl()Scfu/m1,随着时间的延长，活菌体 数量逐渐减少，10天时活菌数量为9xl0"cfii/ml，如附图1所示。无苯并[a]芘的降解率随着时间的延长而逐渐增加，至第10天增到40%, 如附图2所示。实施例3 本发明所述短波单孢菌CB"vM"Awo"os sp.)对土壤中苯并[a]芘的 降解取中国农业科学院东门外实验田土壤，将土壤过2mm筛，在三角瓶中加 入30g 土壤，湿热灭菌30min，向瓶中加入苯并[a]芘-丙酮母液(5mg/ml )300ul， 使苯并[a]芘的终浓度达到50mg/kg。按10%的量向土壤中加入测试菌菌悬液， 同时以无菌水作为对照，随时补加无菌水，使土壤水分为30%，置25'C恒温培养箱中避光培养，分别在7d、 14d、 21d、 28d、 42d取样测苯并[a]芘的残留量。苯并[a]芘残留量的测定方法将培养后的土壤风干后取lg，放在50ml 离心管中，加3ml丙酮超声萃取30min后，11000r/min离心，离心10min, 取上清到新的离心管中，在65"水浴锅中将丙酮蒸发至干后加10ml环己烷， 充分混匀后在分光光度计上于296nm处测其吸光度。实验结果如附图3所示，在实验室条件下培养30天对土壤中的苯并[a] 芘降解率达到80%。
权利要求
1、一株高效降解有机污染物的短波单孢菌(Brevundimonas sp.)CGMCCNo. id="icf0001" file="A2008102261930002C1.tif" wi="22" he="8" top= "35" left = "29" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>
2、 根据权利要求1所述的菌株，其特征在于所述的有机污染物是苯并[a]芘。
3、 根据权利要求l所述的菌株在修复菜地和农田有机污染方面的应用。
全文摘要
本发明提供了一株高效降解有机污染物的短波单孢菌(Brevundimonassp.)CGMCC No.2746。该菌在实验室条件下培养30天对土壤中的苯并[a]芘降解率达到80％，在修复菜地和农田有机污染方面具有很好的应用前景。
文档编号B09C1/10GK101402931SQ20081022619
公开日2009年4月8日 申请日期2008年11月17日 优先权日2008年11月17日
发明者任天志, 孙建光, 晶 徐, 徐明岗, 杨肖娥, 胡海燕 申请人:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所