专利名称：产生物表面活性剂的解淀粉芽孢杆菌bz6-1菌株及其在油泥洗脱中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于污染土壤修复技术领域，尤其涉及一种产生物表面活性剂的解淀粉芽 孢杆菌BZ6-1菌株及其在油泥洗脱中的应用。
背景技术：
生物表面活性剂是微生物合成的具有双亲性(分子结构中同时具有亲水性和亲 油性基团)的一类化合物。微生物产生的生物表面活性剂包括许多不同的种类，如糖脂、脂 肽、多糖-脂类复合物、磷脂、脂肪酸和中性脂等。与化学表面活性剂相比，生物表面活性剂 具有降低表面张力、稳定乳化液、无毒、能生物降解等特点。含油污泥(简称油泥)是在石油开采、运输、炼制及含油污水处理过程中产生的含 油固体废物。油泥中一般含油率在10 50%，含水率在40 90%。我国石油化学行业中， 平均每年约产生80万吨罐底泥、池底泥。油泥中含有数百种有毒有害化合物，其中的有些 化合物具有致畸、致癌以及致突变效应。因此，美国环保署将其中的某些物质列为优先污染 物，并且对这些物质的排放有严格的限制，我国也将油泥列入国家危险废物名录。因此对沉 积于污泥中的原油进行回收并减少油泥危害具有重大的经济与社会价值。
发明内容
发明目的本发明提供一种产生物表面活性剂的解淀粉芽孢杆菌BZ6-1菌株及其 在油泥洗脱中的应用。利用分离得到的一株微生物产生的生物表面活性来处理含油污泥， 实现回收沉积于污泥中的原油与减少油泥危害的目的。技术方案一株产生物表面活性剂的解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens) BZ6-1菌株，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2009年01月 22日，保藏单位名称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号=CGMCC No.2892。上述菌株在油泥洗脱中的应用，步骤包括微生物培养将解淀粉芽孢杆菌BZ6-1 菌株接种到发酵培养基中培养，20 25 °C下150 300rpm培养15 20h ；生物表面活性 剂的制备上述发酵液4°C下离心去菌体，上清液调pH至2.0，出现絮状沉淀，4°C静置过夜， 再离心收集沉淀，用PH 2. 0的酸水洗涤一次，随后将沉淀溶于NaOH溶液，使终pH值为7. 0， 冷冻干燥，得浅褐色疏松状固体的生物表面活性剂粗品；提纯将粗品置CH2Cl2中抽提，后 减压蒸干，NaOH溶液溶解，形成多泡液体，滤纸过滤，滤液再次加HCl调pH至2. 0，将得到的 沉淀离心，得米黄色沉淀物，真空干燥去除残留水分后即为表面活性剂纯品；油泥洗脱向 油泥中加入占油泥质量的表面活性剂和占油泥质量1 2%的氯化钠振荡，静置分层， 完成洗脱。上述发酵培养基配方为柠檬酸钠10g，MgSO4O. 2g，K2HPO4L 0g, KH2PO4L 0g, NH4NO3L 0g, FeSO4O. 05g, CaCl2O. 02g，蒸馏水 lOOOmL，pH 7. 2。
有益效果使用从该微生物中提取的生物表面活性剂洗脱含油污泥，油的回收率 平均为87.7%，下层泥中残留的油含量为4. 1%。而以水作为对照处理中，油的回收率平均 为13.9%，下层泥中残留的油含量为80.6%。除此之外，经过表面活性剂处理后油泥颜色 也明显变白。
四
图1BZ6-1菌株革兰氏染色的显微照片(X1000)；图2BZ6-1菌株透射电镜；图3m/z 1034离子峰的MS/MS/CID碎片质谱图；图4m/z 1048离子峰的MS/MS/CID碎片质谱图；图5m/z 1468离子峰的MS/MS/CID碎片质谱图；图6m/z 1482离子峰的MS/MS/CID碎片质谱图；图7m/z 1509. 96离子峰的MS/MS/CID碎片质谱图。
五具体实施例方式以下结合实例对本发明作进一步的描述实施例1:1.菌株产生物表面活性剂菌株BZ6-1为本实验室分离得到(已在中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No. 2892)。实验室保存于VGPA固体培养 基斜面。2. BZ6-1菌株的鉴定培养特征及菌体形态观察革兰氏阳性(G+)(图1)，短杆状，大小为(0.6-0.7) μ Χ (2. 0-2. 5) μ (图 2)，产芽孢。16S rDNA基因序列测定与分析以BZ6-1菌株基因组DNA为模板，用细菌的通用 引物进行PCR扩增，扩增产物经上海博亚测序，测得16S rDNA扩增片段长度为1458bp (具 体序列见下文)，这与PCR的产物的大小基本一致。在National Center Biotechnology Information(NCBI)使用BLASTN程序进行比对和对16S rDNA基因序列相似性进一步 分析，表明BZ6-1菌株与Bacillus spp.聚为一类，且与登陆号为NC009725的Bacillus amyloliquefaciens菌株亲缘关系最近，同源性超过99%。结合BZ6-1菌株的形态特征，将BZ6-1菌株初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌 (B. amyloliquefaciens)。CGACTTCACCCCAATCATCTGTCCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCATAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACAT
4
CTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGtCAaGGTGCCGCCCTATTTGAACGGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTCTGAACCATGCGGTTCAGACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATAGC3.培养基VGPA固体培养基葡萄糖10g，蛋白胨5g，酵母膏5g，琼脂20g，蒸馏水lOOOmL，pH 7. 2。发酵培养基柠檬酸钠10g, MgSO4O. 2g，K2HPO4L Og, KH2PO4L Og, NH4NO3L Og, FeSO4O. 05g, CaCl2O. 02g，蒸溜水 lOOOmL，pH 7. 2。以上培养基均在121°C灭菌20min。4.生物表面活性剂的发酵生产从一支保存解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)的斜面试管挑取一环接种 到发酵培养基，100mL/250mL三角瓶，22°C下200rpm培养18h。此时的发酵液即含有生物表 面活性剂。5.生物表面活性剂的提取、纯化与鉴定发酵液4°C下IOOOOr mirT1离心IOmin去菌体，上清液用浓HCl调pH至2. 0，出现 絮状沉淀，4°C静置过夜，IOOOOr mirT1离心IOmin收集沉淀，用pH 2. 0的酸水洗涤一次、随 后将沉淀溶于NaOH溶液，使终pH值为7.0，冷冻干燥，得浅褐色疏松状固体的生物表面活性 剂粗品。纯化时，将粗品置CH2Cl2中抽提，后减压蒸干，稀NaOH溶液溶解，形成多泡液体，用 WhatmanNo. 4滤纸过滤，滤液再次加HCl调pH至2. 0，将得到的沉淀离心，得米黄色沉淀物， 真空干燥去除残留水分后即为表面活性剂纯品。该物质经过HPLC-MS鉴定包含表面活性素 (surfactin)和芬荠素(fengycin)的脂肽类物质。鉴定材料Surfactin是一种脂肽类抗菌物质，它是由β _羟基脂肪酸和7个氨基酸残基的小肽组成，肽链的第7位氨基酸上的羧基和脂肪酸的羟基缩合形成环状结构(Peypoux 等，1994)。根据文献(孙力军，2006)研究表明肽链上7位氨基酸为Leu时，CID谱图中有 m/z707的特征碎片离子峰，它可以解释为[LeuLeuValAspLeuLeu+H20+Na]+，可以以此判定 surfactin[7Leu]同系物的特征离子峰。本研究中m/zl034 (图3)和1048 (图4)，与脂肽类 物质Surfactin较相似，通过MS/CID谱进行分析，在二级质谱中，两种物质均存在m/z 707 特征碎片离子峰。除此之外，还有m/z 463和m/z 594特征碎片离子峰，由此可以推断1034 和1048为肽链上7位氨基酸为Leu的Surfactin。
权利要求
一株产生物表面活性剂的解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)BZ6 1菌株，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2009年01月22日，保藏单位名称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.2892。
2.权利要求1所述菌株在油泥洗脱中的应用，其特征在于步骤包括a.微生物培养将解淀粉芽孢杆菌BZ6-1菌株接种到发酵培养基中培养，20 25°C下 150 300rpm 培养 15 20h ；b.生物表面活性剂的制备上述发酵液4°C下离心去菌体，上清液调pH至2.0，出现絮 状沉淀，4°C静置过夜，再离心收集沉淀，用pH 2. 0的酸水洗涤一次，随后将沉淀溶于NaOH 溶液，使终PH值为7. 0，冷冻干燥，得浅褐色疏松状固体的生物表面活性剂粗品；c.提纯将粗品置CH2Cl2中抽提，后减压蒸干，NaOH溶液溶解，形成多泡液体，滤纸过 滤，滤液再次加HCl调pH至2. 0，将得到的沉淀离心，得米黄色沉淀物，真空干燥去除残留水 分后即为生物表面活性剂纯品；d.油泥洗脱向油泥中加入占油泥质量的生物表面活性剂纯品和占油泥质量1 2 %的氯化钠振荡，静置分层，完成洗脱。
3.根据权利要求2所述的菌株在油泥洗脱中的应用，其特征在于所述发酵培养基配方 为柠檬酸钠 10g, MgSO4O. 2g, K2HPO4L 0g, KH2PO4L 0g, NH4NO3L 0g, FeSO4O. 05g, CaCl2O. 02g, 蒸馏水 IOOOmL, pH 7. 2。
全文摘要
本发明提供一种产生物表面活性剂的解淀粉芽孢杆菌BZ6-1菌株及其在油泥洗脱中的应用。利用分离得到的一株微生物产生的生物表面活性来处理含油污泥，实现回收沉积于污泥中的原油与减少油泥危害的目的。该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2009年01月22日，保藏单位名称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.2892。使用从该微生物中提取的生物表面活性剂洗脱含油污泥，油的回收率平均为87.7％，下层泥中残留的油含量为4.1％。而以水作为对照处理中，油的回收率平均为13.9％，下层泥中残留的油含量为80.6％。除此之外，经过表面活性剂处理后油泥颜色也明显变白。
文档编号C02F11/02GK101935633SQ20101021780
公开日2011年1月5日 申请日期2010年7月6日 优先权日2010年7月6日
发明者刘五星, 王小兵, 王殿玺, 骆永明 申请人:中国科学院南京土壤研究所