制备用于合成紫杉烷的化合物的手性分离方法

专利名称：制备用于合成紫杉烷的化合物的手性分离方法
技术领域：
本发明涉及制备用于半合成紫杉烷(taxane)的化合物。更具体的是，本发明涉及手性分离旋光异构体混合物，提供可以用作C-13侧链前体的目标手性化合物，用于制备紫杉醇和其它紫杉烷。本发明具体提供用于将目标手性化合物与其外消旋混合物中的对映体分离的色谱方法。
背景技术：
已知各种紫杉烷化合物具有抗癌活性。由于这种活性，紫杉烷已经在科学和医药领域越来越受到关注。其中，主要的是已知称为“紫杉醇”的化合物，它在文献中也称为“taxol”。已经证实，紫杉醇可以用于化疗几种不同类型的肿瘤，并且临床试验表明，紫杉醇具有广泛的抗白血病活性和抑制肿瘤的活性。
紫杉醇是天然存在的紫杉烷双萜，它在几种紫杉(紫杉属、紫杉科)中可以找到。不幸的是，这种化合物在紫杉中的浓度很低，并且常绿植物种类的生长也缓慢。即使紫杉树树皮中紫杉醇的浓度通常最高，但是生产1克紫杉醇需要大约16000磅的树皮。因此，通过分离来获得紫杉醇的长期前景并不令人鼓舞。
虽然紫杉树中存在的紫杉醇的浓度极低，但是从紫杉树皮和叶子中也可以提取各种其它紫杉烷化合物，如浆果赤霉素III、Taxol B(cephalomanine)、10-脱乙酰基浆果赤霉素III等。这些其它紫杉烷化合物中的一些更容易以更高的产率提取。实际上，从紫杉叶上可以提取浓度相对较高的10-脱乙酰基浆果赤霉素III，作为可代替的来源。
因此，我们转为尝试从前体化合物中半合成紫杉醇，其结构式为 以及其它相关紫杉烷，如多西紫杉醇(docetaxel)，其结构式为
为了成功合成紫杉醇和其它紫杉烷，要求方便地获得手性、非外消旋侧链酸，以及可用浆果赤霉素III主链充足的天然来源。已经研发了各种途径，用于酯化浆果赤霉素III或10-脱乙酰基浆果赤霉素III或其衍生物的13-羟基位的侧链酸，它们的结构式如下 浆果赤霉素III 10-脱乙酰基浆果赤霉素III然后，将所述偶合的酯产物转化成紫杉醇、多西紫杉醇或者其它紫杉烷。例如，美国专利No.4,924,011(Denis等人)说明了一种使用通式如下的(2R，3S)侧链酸制备紫杉醇的方法 式中，R2是羟基保护基。此外，美国专利No.4,924,012(Colin等)说明了制备紫杉烷如多西紫杉醇的方法，该方法使用结构式如下的酸 式中，R1是羟基保护基。在Denis等人和Colin等人所述的合成方法中，使用浆果赤霉素III或10-脱乙酰基浆果赤霉素III来酯化所述侧链酸，之后，例如通过用氢取代任意保护基，如在上述通式中分别为R2或R1，将所述偶合产物去保护。应注意到，Denis等人的C6H5CONH-和Colin等人的(CH3)3COCONH-是所得紫杉醇和多西紫杉醇产物最后需要的基团。在其中揭示的化学合成方法中，所述氮位置并没有再进行任何化学转变。
美国专利No.5,770,745(Swindell等人)描述了半合成紫杉醇的另一种早期合成途径，其中，使用保护基来保护紫杉烷主链和侧链酸的各位置，用于改进形成紫杉醇的化学方法，尤其是改进酯化步骤。具体的是，描述了通式如下的侧链酸 式中，R1可以是烷基、烯基或芳基(如PhCH2)，R3可以是氢或Ph，P′1可以是羟基保护基。
最近，人们越来越关注结构式如下的3-N-CBZ-2-O-保护的(2R，3S)-3-苯基异丝氨酸的应用 式中，P1是可以氢化的保护基，如苄氧基甲基(BOM)或苄基。在例如美国专利No.5,675,025、5,684,175、5,688,977、5,750,737、5,939,566、5,948,919、5,973,170、6,048,990、6,066,749、6,072,060、6,107,497、6,133,462、6,136,999和6,143,902中描述了使用这种侧链来制备紫杉烷如紫杉醇或多西紫杉醇的合成路线，其内容参考引用于此。
如所述的，在美国专利No.5,684,175(Sisti等人)中，由结构式如下的(2R，3S)-3-苯基异丝氨酸乙酯原料化合物可以制备3-N-CBZ-2-O-保护的(2R，3S)-3-苯基异丝氨酸 它的3’-N和2’-O位置被保护，并且被皂化成相应的酸，用于酯化步骤中。
在本领域中已知3-苯基异丝氨酸烷基酯的形成，并在美国专利No.4,924,012(Colin等人)中有述。尤其是，Colin等人描述了一种结构式如下的环氧化物 式中，R4表示包含1-4个碳原子的烷基，较好是乙基；它可以在F.W.Bachelor和R.K.Bansal，J.Org.Chem.，34，3600-04(1969)所述的条件下制得。按照在加热状态下的乙醇中使用叠氮化纳使环氧化物开环的已知方法，这种环氧化物转化成通式如下的叠氮化物 之后，所述叠氮化物还原成结构式如下的3-苯基异丝氨酸烷基酯。
但是，由于这种化合物具有两个手性中心(分别为C-2和C-3)，制备这种化合物的过程可以分别制得两种顺式(2R，3S)和(2S，3R)对映体，如结构式如下的对映体 以及它们的反式(2R，3R)和(2S，3S)非对映体，其结构式分别为 值得高兴的是，虽然可以形成Colin等人所述的其它烷基酯，但是将乙基作为上述通式中的R4，就成为上述旋光异构体。此外如普通技术人员所理解的，从上述专利可知，在得到紫杉醇侧链的过程中可以形成这些旋光异构体的其它衍生物或者同系物。
虽然浆果赤霉素III和其衍生物可以用作拆解试剂，用来选择性回收具有所需(2R，3S)构型的产物，这种途径成本太高，并且会导致所述产物的产率显著降低。因此，需要一种高效经济的方法，在合成紫杉烷化学工艺的一处或多处回收所需的(2R，3S)异构体或其衍生物。
在Srivastava和McChesney，″A Practical and Inexpensive Synthesis of theTaxol C-13 Side Chain；N-Benzoyl-(2R，3S)-3-Phenylisoserine″，Natural ProductsLetters，Vol.6，p.147(1995)中描述了一种制备紫杉醇手性(2R，3S)C-13侧链的步骤。这一步骤涉及使用D-(+)-麻黄碱作为拆解试剂来分离顺式-3-苯基缩水环氧丙酸的经典方法。具体地是，通过用丙酮进行分级结晶，从非对映异构的盐的混合物中回收结构式如下的旋光纯的顺式-(2R，3S)-3-苯基缩水环氧丙酸-(+)-麻黄碱的盐 麻黄碱盐然后，将旋光纯的中间体转化成3-苯基异丝氨酸衍生物。在美国专利No.6,025,516(Ramaswamy等人)和美国专利No.5,817,867(Li)中已经描述了分离紫杉醇合成中所用侧链衍生物的其他经典方法。
在文献中记录了其它几种制备用于部分合成紫杉醇的衍生自手性、顺式-3-苯基缩水甘油酸酯的中间体方法。一些例子包括使用Sharpless不对称二羟基化方法(Denis等人，J.Org.Chem.，55，第1957页，1990；Koskinen等人，J.Chem.Soc.Chem.Commun.，第21页，1994；以及Bonini等人，J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，第2767页，1994)以及一些使用Jacobsen不对称环氧化作用的方法(Deng等人，J.Org.Chem.，57，第4323页，1992)。其它参考文献记录了化学酶催化折分方法(Chen等人，J.Org.Chem.，58，第1287页；美国专利No.6,020,174(Chen等人；Honig等人，Tetrahedron Letters，46，第3841页，1990；美国专利No.5,773,629(Yang等人；美国专利No.5,811,292、5,567,614和5,686,298(Patel等人)。
但是，仍旧要求提供用于高效经济地制备用于半合成紫杉烷的手性化合物的改进新方法。具体地是，要求提供制备手性化合物的简单方法，该化合物用作和浆果赤霉素III主链进行C-13侧链酯化反应的前体。本发明的目的是为了满足这些要求。
发明概述本发明的目的是提供制备用于半合成紫杉烷的手性化合物的新方法。
另一个目的是提供制备3-苯基异丝氨酸的旋光纯衍生物的方法。
另一个目的是提供简单高效地色谱分离在合成紫杉烷中有用的旋光异构体如紫杉醇和多西紫杉醇的方法。
另一个目的是提供用于色谱分离3-苯基异丝氨酸衍生物的旋光异构体的色谱介质。
另一个目的是合成旋光纯形式的N-CBZ-(2R，3S)-3-苯基异丝氨酸侧链衍生物，它适于与合适的浆果赤霉素III衍生物偶合，经过各种合成转化形成紫杉醇。
本发明中，提供一种方法，用于加工具有许多旋光异构体的溶液，如外消旋溶液，由此制得结构式如下的(2R，3S)目标异构体 式中，P1选自H和羟基保护基，R1选自H、烷基、烯基、芳基；R2选自H和R3CO，其中，R3选自烷基、烯基、芳基、O-烷基、O-烯基或者O-芳基。所述方法包括如下步骤使所述溶液经过色谱的固定相，该固定相对目标异构体或其旋光异构体具有更大的亲和力，由此所述目标异构体与其旋光异构体会以不同流速流经所述固定相，之后收集一部分含有目标异构体的溶液。
所述固定相可以装填到具有第一开口和第二开口的色谱柱中，并且使溶液流经固定相的步骤可以通过将溶液注入第一开口来完成。所述包含目标异构体的溶液的一部分可以从第二开口收集。所述溶液较好包含第一比例关系的目标异构体与其旋光异构体，并且所收集的部分溶液包含第二比例关系的目标异构体与其旋光异构体，所述第二比例大于所述第一比例。
所述固定相可以包含四氢菲π体系、二硝基苯甲酰胺π体系和酰氨基-质子氢键给体，较好包含S，S Whelk-O，它可以和氧化硅共价结合。所述溶液可以包括乙醇、异丙醇、己烷等，较好包含20％异丙醇/80％己烷，每1ml异丙醇可以包含约0.025g旋光异构体。
预期存在各种旋光异构体，包括式中R1是烷基、R2是R3CO，其中R3是PhCH2O的一种，以及式中P1是氢、尤其是结构式如下的(2R，3S)-N-CBZ-3-苯基异丝氨酸乙酯 本发明尤其涉及加工(±)-N-CBZ-3-苯基异丝氨酸乙酯的外消旋混合物，由此将所述(2R，3S)异构体和其对映体分离的方法，所述方法包括使用包含S，S Whelk-O的固定相和包含乙醇、异丙醇或己烷的移动相通过HPLC色谱分离外消旋混合物。所述(2R，3S)异构体的HPLC峰较好和来自其对映体的HPLC峰的基线分辨开来。
而且，本发明广泛地包括加工通式如下的旋光异构体的方法，由此分离旋光异构体 式中，P1是H或羟基保护基，R1选自H、烷基、烯基和芳基；R2选自H和R3CO，其中，R3选自烷基、烯基、芳基、O-烷基、O-烯基或者O-芳基；所述方法包括如下步骤使用对各旋光异构体具有不同亲和力的固定相通过HPLC色谱分离所述外消旋混合物。
参考本发明和附图一起给出的示例性实施方式，将更容易理解本发明的目的。
附图简要说明

图1显示了本发明制备外消旋3-苯基异丝氨酸的化学方法。
图2显示将图1所生成的外消旋3-苯基异丝氨酸转化成外消旋3-N-CBZ乙酯的化学方法。
图3显示了由图2所生成的外消旋乙酯提供手性3-N-CBZ-(2R，3S)-乙酯的手性色谱分离方法。
图4显示了保护和皂化图3所生成的手性乙酯的化学方法。
图5显示了使用图4所生成的手性3-N-CBZ-2-O-BOM-(2R，3S)-苯基异丝氨酸化合物半合成紫杉醇的通用方法。
示例实施方式的详细说明结构式如下的N-苯甲酰-(2R，3S)-苯基异丝氨酸侧链对紫杉醇的抗癌活性来说是致关重要的 这一侧链必须能以高纯度对映异构形式获得，用于半合成紫杉醇及其同系物。这种侧链的同系物和衍生物也可以用于形成其它的紫杉烷，如多西紫杉醇，它可以用于治疗癌症。
本发明提供一种手性色谱分离对映体的外消旋混合物如(±)-N-CBZ-3-苯基异丝氨酸乙酯的方法，所述(±)-N-CBZ-3-苯基异丝氨酸乙酯可以用作半合成带有C-13侧链的紫杉醇及其同系物中使用的侧链前体。通过使用装填有包含合适色谱介质如S，S Whelk-O，10μFEC的固定相的色谱柱通过制备手性柱色谱法来完成手性分离，所述色谱介质能有效地分离所述外消旋混合物的对映体。
在示例性工艺中，按图1和2所示的顺序合成外消旋N-CBZ-3-苯基异丝氨酸乙酯，并如下所述。应理解，本发明可以手性色谱分离其它紫杉烷侧链前体化合物如具有3-酰氨基的化合物、具有3-N-保护基而不是CBZ的化合物、在2-O-位置受到保护的化合物、具有不是乙基的酯取代基如其它烷基等的化合物、或者侧链酯化合物的羧酸衍生物的混合物。
A.生成外消旋苯基异丝氨酸首先如下所述生成结构式如下的外消旋苯基异丝氨酸 应理解，本文所述工艺中使用的原料和反应试剂容易从化学供应商处获得，这对于普通技术人员来说是可以理解的。而且，从本文各种化学步骤的说明可以显而易见，可以以各种规模重复所述工艺中的特定化学步骤，积累用于随后步骤的中间产物，而其它步骤使用的比之前步骤中形成的中间产物总量少。但是应理解，可以在不背离本发明概念的条件下，调整原料的量，尤其是本文所述的单独化学步骤可以依比例决定，以符合之前步骤中形成的原料量。
首先，在甲醇钠的存在下，在甲醇中使苯甲醛和氯代乙酸甲酯进行Darzen缩合反应，形成反式-甲基-3-苯基缩水甘油酯(式1)，如下 式1在干燥的装有机械搅拌器、冷凝器、温度计、加料漏斗、氮气吹扫和冰/甲醇浴的22升3颈圆底烧瓶中，将苯甲醛(1.76kg，1.0当量)和氯代乙酸甲酯(2.70kg，1.5当量)加入甲醇(2.55L/kg苯甲醛)中。在搅拌过程中，将所述反应混合物冷却至0℃到-10℃之间，并在冷却温度下往所述反应混合物中缓慢滴加1.5当量甲醇钠(在甲醇中浓度为25％)。然后移走冷却浴，通过搅拌过夜，使烧瓶自然升至室温。反应用TLC监测，在起始物质消失时认为反应完成。通过在减压条件下，在小于等于40℃的温度下，将混合物浓缩至约起始体积的20％，由此引发所述反应。然后，用纯水(10L/kg苯甲醛)来急冷浓缩物，并在乙醚中进行提取(10L/kg苯甲醛)，所述提取物用硫酸钠(1.1kg/kg苯甲醛)进行干燥，用活性炭进行处理，过滤并浓缩成油状，形成81％产率如式1所示的反式异构体。
接着，通过在氯仿中用氯化氢气体打开环氧乙烷由此形成氯乙醇衍生物(式2)，，将式1所示反式环氧化物转化成顺式异构体(式3)，之后通过在相转移催化剂如四丁基溴化铵的存在下，在氯仿和水中用甲醇钠进行闭环，如下 式1 式2 式3此处，将溶剂，较好是氯仿(10L/kg反式环氧化物)加入装有机械搅拌器、回流冷凝器、氮气吹扫、气体分布管和温度计的三颈圆底烧瓶中。可以使用各种溶剂，包括氯仿、氯仿/己烷(10∶90)、甲苯和苯。在搅拌过程中，加入式1所示苯基环氧乙烷羧酸甲酯，在溶解之后，继续恒速搅拌，并将氯化氢气体鼓泡通入溶液中至少3小时，之后，在50℃的室温下将所述反应混合物搅拌过夜。在减压条件下，在小于等于40℃的温度下，将混合物浓缩成油状。用乙醚(1.25L/kg反式环氧化物)滴定该油状物，并冷却至0℃，迫使如式2所示产物结晶成白色固体。过滤收集所述固体，并用己烷∶乙醚(4∶1)溶液(6.25L/kg反式环氧化物)洗涤，并在24小时内将母液冷却至0℃，进一步回收产物。进一步的试验表明使用反式-3-苯基缩水甘油酸乙酯显著提高了这一步骤的产率，同时还保持了相同的纯度等级。
接着，将溶剂，较好是氯仿(8L/kg氯乙醇)和纯水(2L/kg氯乙醇)加入装有机械搅拌器、回流冷凝器、氮气吹扫、加料漏斗和温度计的三颈圆底烧瓶中。也可以使用其它溶剂，如THF或者甲醇。在搅拌过程中，加入如式2所示氯乙醇衍生物和相转移催化剂如0.1-0.3当量的四丁基-N-溴化物(Bu4NBr)。将这些反应物溶解，之后在室温下在15分钟内加入0.5-2.0当量甲醇钠(在甲醇中浓度为25％)。应理解，在这一步骤中可以使用其它碱如NaOH或Amberlite，例如与THF溶剂一起用。此外还应注意到，当使用溶解度更大的弱碱时，不必使用相转移催化剂。通过TLC监控所述反应过程，并在室温下搅拌30分钟后视为完全反应。通过相分离获得产物(式3)，并用纯水洗涤有机相两次，之后经过硫酸钠干燥，过滤并浓缩成油状。值得注意的是，发现如式3所示顺式产物在分离后即使在≤10℃下也并不稳定，要求使这一步骤的反应和操作时间最短。
通过在乙醇中用KOH进行皂化，将所得顺式-3-苯基缩水甘油酸甲酯(式3)转化成铵盐，之后在盐酸水溶液、水和醚存在下和氨气反应 式3式4此处，将溶剂，较好是乙醇(3L/kg顺式环氧化物)加入装有机械搅拌器、回流冷凝器、加入漏斗、温度计、冰-水浴和氮气吹扫的三颈圆底烧瓶中。也可以使用其它溶剂，如甲醇。在搅拌过程中加入KOH(1.3-1.8当量)，将温度保持在0-5℃，之后在15-30分钟内缓慢加入如式3所示环氧乙烷衍生物的乙醇溶液(0.33kg，溶解在2L/kg顺式环氧化物中的1.0当量)。在加入过程中，将温度保持在0-5℃之间，并移走冰-水浴，缓慢升至室温。
将所得反应混合物搅拌3小时，并通过TLC监控完成情况。将所述反应混合物冷却至0-5℃，将所述中间产物，(+)-3-苯基环氧乙烷羧酸(±)-钾-白色固体，完全沉积下来，将其过滤，用冷乙醇洗涤，并在35℃下在真空炉中干燥。
将这种钾盐加入装有机械搅拌器、回流冷凝器、加入漏斗、温度计、冰-水浴和氮气吹扫的三颈圆底烧瓶中。加入水(6L/kg钾盐)，之后冷却至≤10℃。在≤10℃下剧烈搅拌过程中，往这种溶液中加入醚(5L/kg钾盐)和1N HCl(5L/kg钾盐)。通过移走冰-水浴使温度升至室温，并继续搅拌30分钟。将有机相分离，并用醚提取水相。混合所述有机层，并转移到三颈圆底烧瓶中，在室温下，在剧烈搅拌过程中往该烧瓶中鼓泡通入氨气。将反应混合物冷却至0-5℃，并继续搅拌30分钟。过滤所得固体，用冷的醚洗涤，并干燥制得如式4所示的铵盐，得率为69％。
在甲醇中用氢氧化铵回流所得的(+)-3-苯基环氧乙烷羧酸(±)-铵-(式4)，制得所述外消旋苯基异丝氨酸(式5) 式4式5此处，在装有机械搅拌器、回流冷凝器、温度计和加热套管的三颈圆底烧瓶中，一边搅拌一边将式4所示的铵盐(0.15kg，1.0当量)加入甲醇中。在16小时内，分3批递量地加入氢氧化铵(0.26kg/kg铵盐)，用以补充损失的氨。回流所述反应24小时，并将混合物浓缩至起始体积的15％，冷却至≤10℃，形成沉淀，过滤，并用乙醚洗涤，形成如式5所示的外消旋产物，产率大于90％。
应理解，本发明可以使用本文所述方法或者其它方法制得外消旋苯基异丝氨酸，普通技术人员可以理解这一点。而且应理解，本发明可以使用除了包含其一种或多种对映体外还包含所需异构体的一种或多种(2R，3R)和(2S，3S)非对映体的外消旋苯基异丝氨酸混合物。
B.转化成N-保护的酯前体接着，在氯代甲酸苄酯、碳酸氢钠和水存在下，使用Schotten-Baumann条件将所述(±)-苯基异丝氨酸(式5)保护为N-CBZ衍生物，提供(±)-N-CBZ-3-苯基异丝氨酸(式6)，如下 式5 式6此处，在氮气掩蔽下，将式5所示外消旋3-苯基异丝氨酸(0.08kg，1.0当量)在搅拌条件下加到10％碳酸氢钠水溶液(135L/kg苯基异丝氨酸)性，搅拌直到其溶解。然后，将反应混合物冷却至0-5℃，在保持混合物温度的同时滴加约3当量氯代甲酸苄酯。在≤5℃下搅拌所得溶液6小时，或者直到经TLC测定证实外消旋3-苯基异丝氨酸反应物消失。在室温下边搅拌边滴加盐酸，使混合物pH≤4。用乙酸乙酯(200L/kg苯基异丝氨酸)提取所述混合物，经过硫酸钠干燥，过滤，并在≤45℃的减压条件下进行浓缩，制得如式6所示的粗产物，它通过在50∶50己烷/氯仿中形成淤浆来进行纯化。
虽然式6涉及本发明的优选实施方式，但是就普通技术人员所应理解的，可以使用其它酰化剂来代替氯代甲酸苄酯，提供在3-N-位具有不同化学基团的化合物，如通式如下的化合物 式6a式中，R可以是烷基、烯基、芳基如Ph、O-烷基、O-烯基或者O-芳基(如当为CBZ基团时为PhCH2O-)。或者，本发明在下述手性分离步骤过程中可以不保护3-酰氨基。
然后，通过在乙醇中进行回流，式6所示外消旋N-CBZ-3-苯基异丝氨酸和甲磺酸进行酯化反应，形成便于手性色谱分离的(±)-N-CBZ-3-苯基异丝氨酸乙酯(式7) 式6 式7
此处，在装有机械搅拌器、氮气吹扫、温度计和加热套管的三颈圆底烧瓶中，将如式6所示物质(0.072kg，1.0当量)加到过量的乙醇(230L/kg苯基异丝氨酸)和0.5当量甲磺酸中。回流所述反应混合物3小时，然后在≤45℃的减压条件下浓缩成油状。将该油状物溶于氯仿中，并用5％碳酸氢钠洗涤有机物一次，用纯水洗涤两次，用硫酸钠干燥，过滤，然后浓缩成油状，在静置时固化成米白色的残留物。在己烷中将所述固体制成淤浆，过滤，并干燥形成如式7所示外消旋3-N-CBZ-3-苯基异丝氨酸乙酯，得率大于90％。
再者，如本领域已知的，可以形成如式6所示酸的其它酯，用于本发明。例如，可以是如式6所示酸的其它烷基酯如甲酯等，以及芳族酯和烯基酯。此外，如上所述，在3-N-位可以使用其它各种酰基代替CBZ基团，或者所述化合物可以作为下述手性分离步骤中的胺或铵盐而保持游离。此外，在手性分离步骤前，2-羟基或者可以以如下所述的方式受到保护。
因此可以理解，本发明试图形成各种用于本发明手性分离的化合物，如通式所示的化合物
式7a式中，P1选自H和羟基保护基，R1选自H、烷基、烯基和芳基；R2选自H和R3CO，其中R3选自烷基、烯基、芳基、O-烷基、O-烯基和O-芳基。下表A表明本发明可以不受限制地使用通式7a所示各种化合物。
表A
应理解，表A中作为P1的各种羟基保护基包括但不限于苄氧基甲基(BOM)、苄基、取代的苄基、苯甲酰等。
C.手性折分所述酯前体如图3所示，通过手性色谱纯化，将式7所示的外消旋(±)-N-CBZ-3-苯基异丝氨酸乙酯(或通式7a所示的一种化合物)，由此通过使用对旋光异构体具有不同亲和力的色谱固定相，使它们以不同流速流经固定相，将所需的(2R，3S)-3-N-CBZ-3-苯基异丝氨酸乙酯(通式8)和其对映体(以及非对映体，若存在的话)进一步分离，因此，可以通过色谱方法将它们完全或部分分离。
式7 式8首先，使用如下式的N-苯甲酰乙酯的外消旋混合物评价许多色谱柱和条件
评价结果列于表1中，如下
表1
IPA异丙醇EtOH乙醇BuOH丁醇MTBE甲基叔丁基醚n.s.未分离K′化合物的相对保留时间α色谱柱的选择性基线分辨对映体和HPLC基线完全分离然后基于这些结果，评价许多条件，包括各种移动相，来分离通式7所示N-CBZ苯基异丝氨酸乙酯，结果如表2所示
表2
IPA异丙醇EtOH乙醇MTBE甲基叔丁基醚K′化合物的相对保留时间α色谱柱的选择性基线分辨对映体和HPLC基线完全分离当最后一栏“基线分辨？”中给出肯定表示时，色谱通常显示两个清楚的峰，各自从近似基线升起，并各自对应两种对映体，表明它们实际上已经完全分离。当所述最后一栏表明所述基线“刚刚”被分辨，则色谱通常显示两个清楚的峰，在所述基线以上观察到一些重叠，表明对映体部分但未完全分离。当最后一栏表示为“n.s.”时，色谱通常显示一个峰，表明对映体很少分离或者不分离。应注意到，在乙醇/己烷移动相的特定混合物中，在色谱上出现两个额外的峰，这被认为是非对映体。还有如本领域人员所理解的，色谱上可以观察到额外的小峰。
令人感兴趣的是，在所尝试的任意条件如表1和2中所述的条件下，并不能分离如下式的苯甲酸外消旋混合物 认为最适宜分离如式7所示乙酯对映体的条件是使用包含键合到10μKromasil氧化硅上的S，S Whelk-O的固定相。这种S，S Whelk-O的固定相可以从Regis Technologies，Inc.，(位于Morton Grove，IL)获得。尤其是从RegisTechnologies可以获得共价结合到球形氧化硅、不规则氧化硅或者球形Kromasil氧化硅(其尺寸有各种，如10μ和5μ)上的各种柱长的S，S Whelk-O。RegisTechnologies定为S，S Whelk-O1的一种S，S Whelk-O固定相具有如下结构式 Regis Technologies定为S，S Whelk-O 2的另一种S，S Whelk-O固定相和氧化硅载体具有共价三官能连接。本发明可以使用这些固定相中的任一种，以及本文所述的其它固定相/色谱介质。
在优选的方法中，使用ProChrom HPLC系统将所述外消旋CBZ-苯基异丝氨酸乙酯折分成各对映体，所述HPLC系统具有包含800g固定相的8cm直径色谱柱，所述固定相包含全封端的S，S Whelk-O，它和10/100 Kromasil氧化硅共价结合。影响色谱分离的Whelk-O键的结合位置是四氢菲π体系、二硝基苯甲酰胺π体系以及酰氨基-质子氢键给体。所述移动相为20％异丙醇/80％己烷；流速为300mL/分钟，检测器波长为220nm。制备每毫升异丙醇中含0.025g外消旋物的溶液，并连续注入60mL等份(相当于1.5g外消旋原料)。在减压条件下除去溶剂，制得旋光纯的(2R，3S)-N-CBZ-3-苯基异丝氨酸乙酯产物，为白色固体，回收率为85％。
应理解，本发明中可以使用其它类型的色谱介质，在此通过手性色谱分离，这种色谱介质可以用于分离外消旋苯基异丝氨酸乙酯的对映体，和/或本文所述的其它化合物。例如，具有一种或多种四氢菲π体系、二硝基苯甲酰胺π体系或酰氨基-质子氢键给体、或者其它类似键合位置作为关键键合位置的色谱介质可以替换为本发明固定相中的S，S Whelk-O。此外，应理解，氧化硅基材可以用其它合适的色谱底物替换，如本领域所知的。
还应理解，虽然优选完全分离对映体，使其对应的色谱峰和HPLC基线可以相互辨认，但是本发明也允许效率较低的分离，其中可以观察到HPLC峰存在一些重叠。
D.紫杉烷合成中酯前体的应用在手性色谱提纯之后，通过本领域已知的各种方法，所得旋光纯的(2R，3S)-N-CBZ-3-苯基异丝氨酸乙酯可以用于制备所需的紫杉烷。例如，如图4所示，可以用合适的保护基如BOM、苄基、取代的苄基、苯甲酰基等保护如式8的2-O-位，之后皂化成相应的羧酸，由此提供适于和浆果赤霉素III衍生物结合的侧链前体，形成所需的紫杉烷，如紫杉醇、多西紫杉醇或者它们的同系物。在美国专利No.5,675,025、5,684,175、5,688,977、5,750,737、5,770,745、5,939,566、5,948,919、6,048,990、6,066,749、6,072,060、6,107,497、6,136,999和6,143,902中描述了使用(2R，3S)-N-CBZ-3-苯基异丝氨酸乙酯前体制备紫杉烷的方法，其内容参考引用于此。
如美国专利No.5,750,737(Sisti等人)所述，可以用苄氧基甲基(BOM)保护(2R，3S)-N-CBZ-3-苯基异丝氨酸乙酯的2-羟基位置，如下 式8 式9此处，在氮气气氛中，将如式8所示乙酯溶解在无水THF中，并在例如干冰/丙酮浴中冷却至低温如-40℃或-78℃，之后滴加烷基锂试剂如正丁基锂，但是要求所述烷基锂试剂是直链烷基。在任何情况下，所述反应最好在不高于0℃的温度进行。所得混合物搅拌约10分钟。然后，以约5分钟为间隔滴加苯氧基甲基氯(BOM-Cl)，在低温下搅拌所述混合物约2-5小时。之后，所述溶液升温至0℃，并用水猝灭反应，除去过量的正丁基锂。所得混合物在真空中浓缩成残留物，之后，用乙酸乙酯提取所述残留物，并用水和盐水洗涤，以除去不想要的盐。然后，干燥有机层，并在真空条件下浓缩，残留物在乙酸乙酯∶己烷中重结晶，或者用乙酸乙酯∶己烷进行色谱分离，制得如式9所示的乙酯。
然后，将如式9皂化成相应的酸，如下 式9 式10此处，将如式9溶解在乙醇/水(比例8∶1)中。往所述溶液中加入氢氧化锂(或者其它合适的碱金属氢氧化物)，并搅拌所得混合物约3小时，以皂化所述化合物。然后，酸化所述混合物(1N盐酸)，并用乙酸乙酯提取。分离所得有机层，干燥并在真空条件下浓缩。然后，将残留酸分离，而无需进一步纯化，由此制得如式10所示的酸。
如图5所示，如式10可以结合到合适的紫杉烷主链，如受保护的浆果赤霉素III或者10-脱乙酰基浆果赤霉素III主链上，如本领域所已知的；之后，将结合的产物转化成紫杉醇或者其它紫杉烷。如美国专利No.5,750,737所述的，式10可以用7-CBZ浆果赤霉素III酯化，如下 此处，将如式11(1当量)和如式10所示酸侧链(6当量)溶解在甲苯中。往这一混合物中加入0.5当量二甲氨基吡啶(DMAP)，较好是6当量二环己基碳二亚胺(DCC)，并在70℃下加热所得混合物30分钟到1小时，但是上述温度范围可以是60-80℃。可以使用其它二烷基碳二亚胺代替DCC，其中一个例子是二异丙基碳二亚胺。接着，将所述溶液冷却至室温，并往溶液中加入相等体积的乙酸乙酯或者二乙基醚。然后，将所得混合物冷却至0℃，并在这一温度下保持24小时。之后，进行过滤，并用二乙醚或者乙酸乙酯清洗残留物。然后，用盐酸(5％)、水以及最后用盐水洗涤所述混合有机物。分离所述有机相，干燥并在真空中浓缩。所得残留物溶解在乙酸乙酯∶己烷中，并经过硅胶沉积柱洗提。然后，在真空中将洗脱液浓缩，形成通式12所示的如化化合物。
如美国专利No.5,750,737中所述的，所述3′-N-CBZ和7-O-CBZ保护基可以通过氢化反应除去，所述3′-N-酰氨基可以使用苯甲酰氯作为酰化剂进行酰化，在3′-N-位处加上苯甲酰基，2′-O-BOM保护基可以通过另一氢化反应除去，由此制得紫杉醇 紫杉醇此处，将式12所示结合的产物溶解在异丙醇中，往其中加入Pearlman催化剂。所得混合物在40psi下进行氢化反应24小时，或者，所述混合物可以在氢气气氛中搅拌24小时。之后，所述混合物通过硅藻土进行过滤，并在真空中浓缩成残留物。所述残留物较好是在加入无水碳酸钾的甲苯中进行提取。或者，所述残留物在乙酸乙酯或甲苯中进行提取，并加入叔胺碱如三乙胺。在任一情况中，都在之后滴加苯甲酰氯，并搅拌所述混合物2小时。所得混合物用水，最后用盐水洗涤。然后分离所得有机层，干燥并在真空中浓缩，制得C2′-OBOM紫杉醇。所述BOM基通过将所述C2′-OBOM紫杉醇溶解在异丙醇中来除去，所述异丙醇中加入了Pearlman催化剂。这种混合物在40psi氢气中氢化24小时，制得紫杉醇。
在美国专利5,675,025、5,684,175、5,688,977、5,939,566、5,948,919、5,973,170、6,048,990、6,066,749、6,072,060、6,107,497、6,133,462、6,136,999和6,143,902中描述了使用各种合适的侧链前体和浆果赤霉素III主链半合成紫杉烷如紫杉醇、多西紫杉醇等的方法，其内容参考引用于此。应理解，本发明尤其适于提供这些方法中使用的合适的(2R，3S)侧链前体。
因此，本发明已经参考本发明具体的实施方式进行了说明。应理解，虽然本发明借助已有技术由以下权利要求书限定，但是在不背离本文所述发明概念的条件下可以对本发明示例性实施方式作出修改或改动。
权利要求
1.一种加工具有许多旋光异构体的溶液，由此制得如下式的(2R，3S)目标异构体的方法 式中，P1选自H和羟基保护基，R1选自H、烷基、烯基和芳基；R2选自H和R3CO，其中，R3选自烷基、烯基、芳基、O-烷基、O-烯基或者O-芳基；其前提是当R3为Ph，且P1是H时，R1不是H；所述方法包括如下步骤(a)使所述溶液经过色谱的固定相，该固定相对目标异构体和其旋光异构体的一种具有更大的亲和力，由此所述目标异构体与其旋光异构体会以不同流速流经所述固定相，(b)收集一部分含有目标异构体的溶液。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定相装填到具有第一开口和第二开口的色谱柱中，使溶液流经固定相的步骤通过将溶液注入第一开口来完成，所述包含目标异构体的溶液的一部分从第二开口收集。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶液包含以第一相互比例关系存在的目标异构体和所述旋光异构体，所收集的部分溶液包含以第二相互比例关系存在的目标异构体和所述旋光异构体，其中，所述第二相互比例大于所述第一相互比例。
4.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶液是目标异构体和所述旋光异构体的外消旋溶液。
5.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶液包含所述目标异构体的非对映体。
6.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定相包含共价结合到氧化硅上的色谱介质。
7.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定相选自RegisTechnologies，Inc.产品号786101、786102、786103、786104、786615、786625、786635、786645、786415、786425、786435和786445。
8.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定相包含色谱介质，它包含选自四氢菲π体系、二硝基苯甲酰胺π体系和酰氨基-质子氢键给体的结合点。
9.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定相包含S，S Whelk-O。
10.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定相包含结合到10μKromasil氧化硅上的S，S Whelk-O。
11.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶液包含选自乙醇、异丙醇和己烷的溶剂。
12.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶液包含20％异丙醇/80％己烷。
13.权利要求12所述的方法，其特征在于，所述溶液包含每毫升异丙醇中约0.025g所述旋光异构体。
14.权利要求1所述的方法，其特征在于，R1是烷基。
15.权利要求1所述的方法，其特征在于，R2是R3CO，其中，R3是PhCH2O。
16.权利要求1所述的方法，其特征在于，P1是H。
17.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标异构体是如下式的(2R，3S)乙酯
18.权利要求17所述的方法，其特征在于，所述固定相包含S，S Whelk-O。
19.权利要求18所述的方法，其特征在于，所述S，S Whelk-O结合到氧化硅上。
20.将目标产物和旋光异构体分离的方法，其中，所述目标异构体具有如下结构式 式中，P1选自H和羟基保护基，R1选自H、烷基、烯基、芳基；R2选自H和R3CO，其中，R3选自烷基、烯基、芳基、O-烷基、O-烯基或者O-芳基；其前提是当R3为Ph，且P1是H时，R1不是H；所述方法包括如下步骤(a)使所述溶液经过色谱的固定相从上游流到下游，该固定相对目标异构体或其旋光异构体中的一种具有更大的亲和力；(b)收集许多阶段中的溶液，各阶段包含从各时间间隔收集的一部分溶液，由此形成各收集溶液，其中，在第一收集溶液中，所述目标异构体和旋光异构体处于第一相互比例关系，在第二收集溶液中，它们处于第二相互比例关系，所述第一相互比例关系不同于第二相互比例关系。
21.加工如下式的(±)-N-CBZ-3-苯基异丝氨酸乙酯外消旋混合物，由此将所述(2R，3S)异构体和其对映体分离的方法 所述方法包括使用包含S，S Whelk-O的固定相和包含选自乙醇、异丙醇或己烷溶剂的移动相通过HPLC来色谱分离所述外消旋混合物。
22.权利要求21所述的方法，其特征在于，所述固定相包含共价结合到氧化硅上的S，S Whelk-O。
23.权利要求21所述的方法，其特征在于，所述移动相是20％异丙醇/80％己烷。
24.权利要求21所述的方法，其特征在于，所述移动相包含每毫升溶剂中约0.025g(±)-N-CBZ-3-苯基异丝氨酸乙酯。
25.权利要求21所述的方法，其特征在于，(2R，3S)异构体的HPLC峰和来自其对映体的HPLC峰的基线分辨开来。
26.加工包含通式如下的旋光异构体的混合物，由此将旋光异构体相互分离的方法 式中，P1选自H和羟基保护基，R1选自H、烷基、烯基、芳基；R2选自H和R3CO，其中，R3选自烷基、烯基、芳基、O-烷基、O-烯基或者O-芳基；其前提是当R3为Ph，且P1是H时，R1不是H；所述方法包括使用对各旋光异构体具有不同亲和力的固定相通过HPLC色谱分离所述外消旋混合物。
27.权利要求26所述的方法，其特征在于，所述混合物是如下式的对映体的外消旋混合物
28.权利要求26所述的方法，其特征在于，所述固定相包含S，S Whelk-O。
29.权利要求26所述的方法，其特征在于，所述方法包括使用包含选自乙醇、异丙醇和己烷的溶剂的移动相。
30.权利要求26所述的方法，其特征在于，R1是烷基。
31.权利要求26所述的方法，其特征在于，R2是R3CO，其中，R3是PhCH2O。
32.权利要求26所述的方法，其特征在于，P1是H。
33.加工包含如下式的(2R，3S)异构体以及包含如下式的(2S，3R)对映体的混合物的方法 式中，R1是烷基，R3选自烷基、烯基、芳基、O-烷基、O-烯基或者O-芳基；所述方法包括使用对(2R，3S)异构体和(2S，3R)对映体中的一种具有更大亲和力的固定相来色谱分离所述混合物。
34.权利要求33所述的方法，其特征在于，R1是乙基。
35.权利要求33所述的方法，其特征在于，R3是PhCH2O。
36.权利要求33所述的方法，其特征在于，R1是乙基，R3是PhCH2O。
37.权利要求33所述的方法，其特征在于，所述固定相包含S，S Whelk-O。
38.权利要求33所述的方法，其特征在于，R1是乙基，R3是PhCH2O，所述固定相包含S，S Welk-O。
全文摘要
提供一种方法，用于加工具有旋光异构体的溶液，制得(2R，3S)目标异构体，式中，P
文档编号B01J20/281GK1547567SQ02816547
公开日2004年11月17日 申请日期2002年6月27日 优先权日2001年6月27日
发明者J·D·麦克切斯尼, H·R·布林克曼, S·齐加, D·贝尔, J D 麦克切斯尼, 布林克曼 申请人:拿坡罗生物治疗股份有限公司