一种负载功能化L‑脯氨酸的具有温度/磁双响应性的杂化微球制备方法与流程

本发明属于高分子催化剂及其合成领域，具体涉及一种负载功能化L-脯氨酸的具有温度/磁双响应性的杂化微球制备方法。

背景技术：

L-脯氨酸是自然界含量丰富的一种天然手性有机小分子，其结构简单，原料易得。L-脯氨酸作为手性催化剂，在多种不对称催化反应中表现出良好的催化性能，因此成为不对称Aldol反应中重要的手性催化剂。L-脯氨酸催化直接不对称Aldol反应有诸多优点，但是，反应需在高极性有机溶剂中进行以稳定催化活性中间体，而L-脯氨酸在有机溶剂中溶解性差，催化剂用量大，催化效率低，并且，催化剂难以从反应体系中分离并循环使用。水是理想的绿色溶剂，价廉、无污染，以水为反应溶剂，克服了大多数有机溶剂带来的易燃、易爆、易挥发、容易污染环境的缺点。因此，研究者们又制备了负载L-脯氨酸的高分子催化剂，其中备受关注的是由两亲性嵌段聚合物自组装形成的核壳型高分子催化剂，其疏水性能核能有效地增加反应底物和催化剂在有限反应空间的局部浓度，提高催化反应速率，获得类似酶催化的高活性和高选择性。

温度响应性聚合物是实际应用中最为常见的一类刺激响应性材料。当外界温度变化时，温度响应性聚合物的亲水性和疏水性发生变化导致聚合物分子构象发生改变，从而引起聚合物溶解性的变化。在温度较低时，温度响应性聚合物溶液澄清透明，当温度升高到一定温度时，溶液变浑浊，发生相转变，相转变温度成为最低临界温度LCST。聚N-异丙基丙烯酰胺是一种临界温度约为32℃的温敏性材料，在水溶液中具有“低温亲水，高温疏水”的特点。

磁性纳米粒子具有纳米粒子和磁性性质，其中Fe₃O₄磁性纳米粒子应用最为广泛，Fe₃O₄磁性纳米粒子具有制备简单、低毒性、高稳定性等特点，为其作为催化剂载体提供了必要条件。将催化剂分子负载于磁性纳米粒子表面，形成具有核壳结构的磁性复合微球，使该类负载型催化剂能有效分散于反应体系中，同时，可利用磁性纳米粒磁性分离的特点实现催化剂和反应体系的分离。

Javad Safaei-Ghomi[Tetrahedron Lett. 2016（57） ,1071–1073]等将L-脯氨酸功能化的Fe₃O₄纳米粒子作为催化剂，考察了N-芳羟胺、芳醛、靛红、α，β-不饱和醛的非对称1,3偶极环加成反应，发现Fe₃O₄-L-脯氨酸作为手性催化剂，反应条件温和，反应时间较短，产率高，而且Fe₃O₄-L-脯氨酸纳米粒子易回收，催化剂循环使用5次后，产率基本不变。

李新娟[RSC Adv. 2015, 5, 89149]等先通过RAFT沉淀聚合将甲基丙烯酸MAA、二硫代苯甲酸枯酯CDB、乙二醇二甲基丙烯酸酯EGDMA共聚制得P（MAA-co-EGDMA）聚合物微球，再通过表面引发RAFT聚合法将功能化L-脯氨酸、亲水单体NIPAM、疏水单体苯乙烯接枝到聚合物微球表面，制得负载手性催化剂毛发状聚合物微球。通过具有疏水和亲水部分的聚合物负载催化剂的方法，催化剂在水中组装形成胶束，疏水的核部分能将有机反应底物从周围水体系隔绝出来，将催化剂和有机反应物束缚在疏水空腔中，这样能够有效地进行催化。但是，反应结束后催化剂的回收率偏低。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题是提供了一种负载功能化L-脯氨酸的具有温度/磁双响应性的杂化微球制备方法，该杂化微球含有的温敏性链段的低临界溶解温度LCST为32~36℃。当环境温度低于LCST时，聚合物分子链舒展，可溶于水相，当环境温度高于其LCST时，聚合物分子链形成内核疏水、外壳亲水的胶束，疏水性能有效地增加反应底物和催化剂在有限反应空间的局部浓度，提高催化反应速率，因此，利用该温度/磁双响应性的杂化微球在水相中催化直接不对称Aldol反应，不仅可以通过控制温度提高催化效率，还可以通过磁分离回收使其重复使用，降低生产成本。

本发明所采用的技术方案是：一种负载功能化L-脯氨酸的具有温度/磁双响应性的杂化微球制备方法，按照如下步骤进行：

步骤一、制备功能化O-丙烯酰基-4-羟基-L-脯氨酸ProlA, 在烧瓶中加入三氟乙酸CF₃CO₂H，置于冰水浴中，搅拌下将反-4羟基-L-脯氨酸C₅H₉NO₃加入到烧瓶中，除去不溶物，加入三氟甲磺酸CF₃SO₃H，静置5分钟后，向烧瓶中加入丙烯酰氯C₃H₃OCl，室温充分搅拌，然后加入三氟乙酸CF₃CO₂H，室温下继续搅拌使充分反应，然后把烧瓶置于冰水浴中冷却，后加入的乙酸乙酯与石油醚混合溶液，真空抽滤，获得白色晶体，用乙醚多次洗涤白色晶体，然后将白色晶体在室温通风条件下干燥，获得白色粉末状的功能化O-丙烯酰基-4-羟基-L-脯氨酸ProlA；

步骤二、制备无规共聚物P(NIPAM-co-ProlA)，将N-异丙基丙烯酰胺NIPAM、功能化O-丙烯酰基-4-羟基-L-脯氨酸ProlA、链转移试剂苄基三硫代碳酸酯基丙酸BSPA和偶氮二异丁腈AIBN溶解在N,N-二甲基乙酰胺DMAC中，冰水浴下通入氮气除去其中的氧气，然后在氮气保护下，油浴中反应18小时，反应完成后，用乙酸乙酯和石油醚混合溶液，沉析多次，反应产物真空干燥，得到无规共聚物P(NIPAM-co-ProlA)；

步骤三、制备嵌段聚合物P(NIPAM-co-ProlA)-b-POEGA将步骤二制得的无规共聚物P(NIPAM-co-ProlA)、寡聚乙二醇丙烯酸酯OEGA、偶氮二异丁腈AIBN加入到N,N-二甲基乙酰胺DMAC中，超声震荡至完全溶解，冰水浴下，通氮气除去其中的氧气，在油浴中反应18小时，反应完成后，加入石油醚和乙酸乙酯的混合溶液，沉析多次，取下层黄色粘稠物，真空干燥，将干燥后的产物溶于水中，加入三乙胺，调节pH至6~7，用截留分子量为3500的透析袋，透析除去三乙胺盐，真空干燥，得到嵌段聚合物P(NIPAM-co-ProlA)-b-POEGA；

步骤四、制备改性Fe₃O₄纳米粒子，将六水三氯化铁FeCl₃·6H₂O、无水乙酸钠CH₃COONa、聚乙二醇PEG（200）溶于乙二醇中，200℃时充分反应，自然冷却至室温后用去离子水和无水乙醇洗涤数次，用外加磁场收集产物，真空干燥，即得磁性纳米粒子Fe₃O₄，将磁性纳米粒子Fe₃O₄分散于乙醇、去离子水和NH₃·H₂O的混合溶液中，加入γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷KH-570，搅拌使反应完全，所得产物用磁铁分离，用水和乙醇分别洗涤后，干燥获得黑色晶体即为改性Fe₃O₄纳米粒子；

步骤五、制作共聚物(P(NIPAM-co-ProlA)-b-POEGA)-SH，将步骤三制备的嵌段聚合物P(NIPAM-co-ProlA)-b-POEGA、硼氢化钠NaBH₄溶于甲醇CH₃OH，调节pH=11~13，通入氮气，密封搅拌，反应结束后，透析，干燥，得到共聚物(P(NIPAM-co-ProlA)-b-POEGA)-SH；

步骤六、制备负载功能化L-脯氨酸的具有温度/磁双响应性的杂化微球，将步骤五制备的共聚物(P(NIPAM-co-ProlA)-b-POEGA)-SH、步骤四制备的改性Fe₃O₄纳米粒子、N,N-二甲基甲酰胺DMF，装入密闭容器中，通入氮气，充分反应，将产物在真空中干燥获得黑色晶体即为L-脯氨酸的具有温度/磁双响应性的杂化微球Fe₃O₄@P(NIPAM-co-ProlA)-b-POEGA。

作为一种优选方式：步骤一中，所述制备功能化O-丙烯酰基-4-羟基-L-脯氨酸ProlA的具体过程为，在圆底烧瓶中加入10a～20a毫升三氟乙酸CF₃CO₂H，置于冰水浴中，搅拌下将1a～5a克反-4羟基-L-脯氨酸C₅H₉NO₃在5~10分钟加入到烧瓶中，溶解完全后除去不溶物，加入0.1a～0.5a克三氟甲磺酸CF₃SO₃H，静置5分钟后，向烧瓶中加入1a～5a毫升丙烯酰氯C₃H₃OCl，室温充分搅拌，然后加入三氟乙酸1a～5a毫升CF₃CO₂H，室温下继续搅拌100~120分钟使其充分反应，然后把烧瓶置于冰水浴中冷却，后加入体积比为1:1的乙酸乙酯与石油醚混合溶液50a~100a毫升，剧烈搅拌20分钟，真空抽滤，获得白色晶体，用乙醚多次洗涤白色晶体，然后将白色晶体在室温通风条件下干燥24小时，获得白色粉末状的功能化O-丙烯酰基-4-羟基-L-脯氨酸ProlA，其中a为正数。

作为一种优选方式：步骤二中，制备无规共聚物P(NIPAM-co-ProlA)的具体过程为，将N-异丙基丙烯酰胺NIPAM、功能化O-丙烯酰基-4-羟基-L-脯氨酸ProlA、链转移试剂苄基三硫代碳酸酯基丙酸BSPA和偶氮二异丁腈AIBN按照100～200:10～20:1:0.2～0.4物质的量比，总量为20b~50b毫摩尔，溶解在10b~40b毫升N,N-二甲基乙酰胺DMAC中，冰水浴下通入氮气30分钟除去其中的氧气，50～70℃油浴反应18小时，反应完成后，加入体积比为1:3的乙酸乙酯和石油醚混合溶液30b~50b毫升沉析3～5次，反应产物30～50℃真空干燥，得到黄色粘稠的无规共聚物P(NIPAM-co-ProlA)，其中b为正数。

作为一种优选方式：步骤三中，制备嵌段聚合物P(NIPAM-co-ProlA)-b-POEGA的具体过程为将无规共聚物P(NIPAM-co-ProlA)、寡聚乙二醇丙烯酸酯OEGA、偶氮二异丁腈AIBN按照1:5～10:1:0.2～0.4物质的量比,完全溶解于 N,N-二甲基乙酰胺DMAC中，冰水浴下，通氮气除去其中的氧气，50～70℃油浴反应18小时，反应完成后，用体积比为3:1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液沉析3~5次，取下层黄色粘稠物，用体积比为3:1的石油醚和乙酸乙酯混合溶液重复洗涤3~5次，30～50℃下真空干燥，将干燥后的产物溶于水中，加入三乙胺，调节pH至6~7，用截留分子量为3500的透析袋，透析24小时除去三乙胺盐并在30~50℃真空干燥，得到嵌段聚合物P(NIPAM-co-ProlA)-b-POEGA。

作为一种优选方式：步骤四中，制备改性Fe₃O₄纳米粒子的具体过程为：将1c~5c克六水三氯化铁FeCl₃•6H₂O、5c~10c克无水乙酸钠CH₃COONa、1c~5c克聚乙二醇PEG200溶于30c毫升乙二醇中，搅拌1 小时后，将此混合溶液装入内衬聚四氟乙烯内胆的50c毫升高压反应釜中，在200℃下加热12小时，自然冷却至室温后用去离子水和无水乙醇洗涤数次，用磁铁收集产物，在真空干燥箱内40~80 ℃条件下干燥24小时，即得磁性纳米粒子Fe₃O₄MNPS，取0.1d~0.5d克的Fe₃O₄MNPS分散于20d~50d毫升乙醇C₂H₅OH、10d~20d毫升去离子水、1d~5d毫升氨水NH₃·H₂O的混合溶液中，再加入0.1d~0.5d克γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷KH-570，在 40~80℃条件下搅拌24小时，所得产物用磁铁分离，即将磁铁放于反应瓶壁外，吸附住Fe₃O₄-MPS，将溶液倒掉，清水洗涤分离产物3次，乙醇洗涤分离产物一次，在40~60℃条件下，干燥12小时得到黑色晶体为改性Fe₃O₄纳米粒子Fe₃O₄-MPS，其中c、d为正数。

作为一种优选方式：步骤五中，制作共聚物(P(NIPAM-co-ProlA)-b-POEGA)-SH的具体过程为：称量0.1e~0.5e克P(NIPAM-co-ProlA)-b-POEGA、20e~40e毫克硼氢化钠NaBH₄溶于20e毫升甲醇CH₃OH中，其中P(NIPAM-co-ProlA)-b-POEGA和硼氢化钠的物质的量比1:20~35，用NaOH溶液调节pH=11~13，通入氮气，在20~40℃下密封容器中搅拌，反应结束后，使用截留分子量为3500的透析袋透析72小时，干燥24h，得到共聚物(P(NIPAM-co-ProlA)-b-POEGA)-SH，其中e为正数。

作为一种优选方式：步骤六中，制备负载功能化L-脯氨酸的具有温度/磁双响应性的杂化微球的具体过程为：称量0.1f~0.5f克共聚物(P(NIPAM-co-ProlA)-b-POEGA)-SH、0.1f~0.5f克改性Fe₃O₄纳米粒子、10f~30f毫升 N,N-二甲基甲酰胺DMF，通氮气N₂反应瓶密封，在40~80℃反应18小时，将产物真空干燥12小时，得到黑色晶体负载功能化L-脯氨酸的具有温度/磁双响应性的杂化微球Fe₃O₄@P(NIPAM-co-ProlA)-b-POEGA，其中f为正数。

本发明得到有益效果是：本发明所述的负载功能化L-脯氨酸的具有温度/磁双响应性的杂化微球手性催化剂用于水相中直催化不对称Aldol反应时，当环境温度高于嵌段聚合物的LCST时，聚合物分子链形成内核疏水、外壳亲水的胶束，疏水性能有效地增加反应底物和催化剂在有限反应空间的局部浓度，提高催化反应速率。因此，利用该温度/磁双响应性的杂化微球做催化剂，不仅可以通过控制温度提高的催化效率，还可以通过磁分离回收使其重复使用，降低生产成本。

附图说明

图1、本发明步骤二中制备无规共聚物P(NIPAM-co-ProlA)的反应过程示意图；

图2、本发明步骤三中制备嵌段聚合物P(NIPAM-co-ProlA)-b-POEGA的反应过程示意图；

图3、本发明步骤五中制备共聚物(P(NIPAM-co-ProlA)-b-POEGA)-SH的反应过程示意图；

图4、本发明步骤六中制备L-脯氨酸的具有温度/磁双响应性的杂化微球反应过程示意图；

图5、本发明未改性Fe₃O₄和改性Fe₃O₄-MPS的红外光谱图分析；

图6、本发明Fe₃O₄-MPS、Fe₃O₄@P(NIPAM-co-ProlA)-b-POEGA的热重图；

图7、L-脯氨酸催化环己酮和对硝基苯甲醛的Aldol反应（醛酮缩合）的机理图。

1、L-脯氨酸的氨基与环己酮，2、对硝基苯甲醛，3、亚胺正离子，4、烯胺，5、过渡态，6、产物。

具体实施方式

步骤一、在圆底烧瓶中加入9毫升三氟乙酸CF₃CO₂H，置于冰水浴中，将3.81克干燥的反-4羟基-L-脯氨酸C₅H₉NO₃缓慢加入圆底烧瓶中，滴入时间为5-10分钟，在滴入过程中搅拌，并在滴入全部后继续搅拌5分钟，然后除去不溶物，剩余溶液保留在圆底烧瓶中，然后加入0.3毫升的三氟甲磺酸CF₃SO₃H，静置5分钟后，继续加入4.6毫升的丙烯酰氯C₃H₃OCl，从冰水浴中取出烧瓶，将圆底烧瓶中的溶液在室温下搅拌放热，20分钟后，加入1毫升三氟乙酸CF₃SO₃H，获得无色澄清液，室温下继续搅拌1小时40分钟，在冰水浴中冷却，然后缓慢加入54毫升体积比为1：1的乙酸乙酯与石油醚混合溶液，剧烈搅拌20分钟，在0~5℃下继续搅拌15分钟，真空抽滤获得白色晶体，用乙醚多次洗涤白色晶体，然后置于通风厨中，室温下干燥24小时，得白色粉末状的功能化O-丙烯酰基-4-羟基-L-脯氨酸ProlA。

步骤二、将1.132克的N-异丙基丙烯酰胺NIPAM，0.1162克的功能化O-丙烯酰基-4-羟基-L-脯氨酸ProlA、0.0136克链转移试剂苄基三硫代碳酸酯基丙酸BSPA和3.3毫克偶氮二异丁腈AIBN溶解在6.25毫升的N,N-二甲基乙酰胺DMAC中，在冰水浴中通入氮气30分钟，然后在氮气保护下放入集热式恒温加热磁力搅拌器中60℃油浴加热反应，持续18小时，反应完成后，加入体积比为1:3的乙酸乙酯和石油醚的混合溶液30毫升，搅拌下，沉析三次，以除去未反应的单体和链转移剂，反应产物放入真空干燥箱干燥24小时，得到黄色粘稠液体无规共聚物P(NIPAM-co-ProlA)。

步骤三、将6.5毫升DMAC缓慢滴入到含0.765克无规共聚物P(NIPAM-co-ProlA)、0.4毫升寡聚乙二醇丙烯酸酯OEGA、2.9克偶氮二异丁腈AIBN的混合物中，超声震荡至完全溶解，在冰水浴中通氮气30分钟除去其中的氧气，然后在氮气保护下60℃油浴反应17小时，然后滴入体积比为1：3的乙酸乙酯和石油醚的混合溶液30毫升，取下层黄色粘稠物，用体积比为1：3的乙酸乙酯和石油醚的混合溶液重复洗涤三次，放入真空干燥箱中干燥24小时，将得到的聚合物溶于水中，用三乙胺Et₃N调节pH至6.3，用截留分子量为3500的透析袋，透析24小时，除去三乙胺盐，再次真空干燥，得到嵌段聚合物P(NIPAM-co-ProlA)-b-POEGA。

步骤四、将1.08 克六水三氯化铁FeCl₃•6H₂O、2.88克无水乙酸钠CH₃COONa、0.8克聚乙二醇PEG（200）溶于30毫升乙二醇中，搅拌1 小时后，将此混合溶液装入内衬聚四氟乙烯内胆的50毫升高压反应釜中，在200℃下加热12小时，自然冷却至室温后用去离子水和无水乙醇洗涤数次，用磁铁收集产物，在真空干燥箱内60 ℃条件下干燥24小时，即得磁性纳米粒子Fe₃O₄MNPS，取0.2克的Fe₃O₄MNPS分散于40毫升乙醇、 10毫升去离子水、1.5毫升NH₃·H₂O的混合溶液中，再加入0.3克γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(KH-570)，在 60℃条件下搅拌24小时，所得产物用磁铁分离，即将磁铁放于反应瓶壁外，吸附住Fe₃O₄-MPS，将溶液倒掉，清水洗涤分离产物三次，乙醇洗涤分离产物一次，在45℃条件下，干燥12小时得到黑色晶体改性Fe₃O₄纳米粒子Fe₃O₄-MPS。

本发明制备的Fe₃O₄纳米粒子Fe₃O₄-MPS纳米磁性微粒结晶完整，晶界清晰，粒径范围为250~300nm。

从图5中可以看出，未改性Fe₃O₄微粒的特征吸收峰为3441cm^-1和559cm^-1分别对应于Fe₃O₄微粒表面吸附水的羟基伸缩振动和Fe₃O₄的特征吸收峰Fe-O键。而对于经KH570改性的Fe₃O₄在1649cm^-1出现新的吸收峰，对应于KH570的C=C吸收。同时，在1059cm^-1处之间还出现了新的吸收峰，根据KH570的特征吸收谱图，这些新出现的吸收峰对应于KH570酯基中的 Si-O键的吸收峰，表明改性后Fe₃O₄微粒红外谱图上出现的新吸收峰是由偶联剂的对应官能团特征吸收形成的。这表明Fe₃O₄改性成功。

步骤五、称量0.3克嵌段聚合物P(NIPAM-co-ProlA)-b-POEGA、25.54毫克硼氢化钠NaBH₄溶于20 毫升CH₃OH甲醇中，用NaOH溶液调节pH=11~13，通入氮气，在25℃下密封容器中搅拌，反应结束后，使用截留分子量为3500的透析袋透析72小时，干燥24h，得到共聚物(P(NIPAM-co-ProlA)-b-POEGA)-SH。

步骤六、称量0.130克共聚物(P(NIPAM-co-ProlA)-b-POEGA)-SH、0.13克改性Fe₃O₄纳米粒子、20毫升 N,N-二甲基甲酰胺DMF，通入氮气反应瓶密封，在60℃反应18小时，将产物真空干燥12小时，得到负载功能化L-脯氨酸的具有温度/磁双响应性的杂化微球。

从图6中可以看出，(P(NIPAM-co-ProlA)-b-POEGA)成功接枝到Fe3O4纳米粒子表面，接枝量为10.88%。

负载功能化L-脯氨酸的具有温度/磁双响应性的杂化微球Fe₃O₄@P(NIPAM-co-ProlA)-b-POEGA磁性能分析

用实验室中的磁铁对磁性高分子微球的磁响应性进行了简单的测试，放置磁铁于分散液一侧后，一段时间后，可以清楚的看到磁球运动到了磁铁一侧，从分散液中分离出来，说明Fe₃O₄@P(NIPAM-co-ProlA)-b-POEGA杂化微球具有优异的磁响应性；另外，当把磁铁移开，超声后样品又可以重新分散于水中。

负载功能化L-脯氨酸的嵌段聚合物P(NIPAM-co-ProlA)-b-POEGA温敏性分析

当温度低于36℃时，聚合物分子链溶于水，负载功能化L-脯氨酸的嵌段聚合物水溶液变清晰；当温度高于36℃时，聚合物分子链形成内核疏水、外壳亲水的胶束，负载功能化L-脯氨酸的嵌段聚合物水溶液变浑浊。所以，负载功能化L-脯氨酸的嵌段聚合物P(NIPAM-co-ProlA)-b-POEGA的LCST为36℃。

L-脯氨酸催化Aldol反应（醛酮缩合）的机理

从图7中可以看出：首先L-脯氨酸的氨基与环己酮1生成亚胺正离子3，然后脱去α-H生成具有亲核能力的烯胺4，其羧基上的氢原子与对硝基苯甲醛2上的羰基氧上的孤对电子形成氢键，烯胺的双键反面进攻醛羰基形成过渡态5，过渡态水解得到产物6。

通过可逆加成链转移（RAFT）聚合法将功能化的L-脯氨酸ProlA、温敏性单体N-异丙基丙烯酰胺NIPAM及亲水性单体寡聚乙二醇丙烯酸酯OEGA聚合成具有温度响应性的两亲性嵌段聚合物，利用“点击化学”方法将上述嵌段聚合物负载到磁性Fe₃O₄纳米粒子上，得到具有温度和磁双响应性的杂化微球。本发明的杂化微球可用于水相中催化直接不对称Aldol反应，反应体系的温度高于嵌段聚合物的低临界溶解温度（LCST）有利于Aldol反应的催化效率的提高和有机产物的释放，利用其磁性可高效分离回收该杂化微球，可重复使用。