专利名称：一种具有抗肝炎病毒活性的生物碱类新化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体涉及以獐牙菜苦苷为原料，通过与真菌Jspergi7/附w/ge/" 混合培养而代谢生成的一个新化合物，其骨架属于生物碱类。本发明也涉及这个化合物的 制备方法；本发明还涉及这个化合物在制备药物方面的用途，特别是在制备抗肝炎药物等 领域.背景技术肝炎是世界上重大传染性疾病，近年来呈逐渐上升趋势。我国是肝炎大国，2006年全 世界有3.5亿乙肝病毒携带者，中国有近1,2亿；丙肝病毒携带者1.7亿，中国也有近2000 万。2000年全球约有200万人死于与病毒有关的乙肝癌和晚期肝硬化，中国也有近30万 人死亡。藏茵陈来源于龙胆科(Gentianaceac)獐牙菜属(Swertia )植物，该属多种中药、 民族药及民间药均有长期治疗肝炎的临床背景。藏茵陈在治疗肝炎后高胆红素血症、急性 黄胆肝炎和慢性肝炎均取得了良好的效果。獐牙菜苦苷是藏茵陈中的一个主要的有效成分。 对獐牙菜苦苷的代谢研究自20世纪八十年代以来已有报道，先后有红百金花内酯、龙胆宁 械等化合物被分离鉴定。我们在针对獐牙菜苦苷在真菌Jspefg,7/附/i/g"中代谢研究中分离 并鉴定了 一个新的水溶性的化合物，药效学研究表明以该化合物为主要组成的制剂具有良 好的抗炎作用。针对该化合物，通过实验确定了合理的制备技术，利用该技术制备的产物 可以使该化合物的含量高于70%。发明内容本发明的目的是提供一种以獐牙菜苦苷为原料，通过代谢、分离制备一个新的化合物I :<formula>formula see original document page 3</formula>化合物I命名为(4- (l-Methylaminpmethyl-vinyl) -5，6-dihydropyran-2-one )。分子 组成C10H12O3N;分子量195;紫外光谱UV: X max: 279.2nm。高分辨率质谱ESI-MS (int.rd): 194.2165(100， M+), 178.1823(81， [M+-CH3J), 150.2017(62， [M+誦C02]), 132.1857(12， IM+-C02-H201), 104.1323(51),90.105(52)。核磁共振氢谱'H NMR (400MHz，CDC13) &: 3.41(2H， t， J=6.0Hz， 6國H2)， 4.36(2H， t， J=6.0Hz， 7隱H2)， 7.42(1H， t， J=7.7Hz， IO-H)， 7.87(1H， dd， J=7.7Hz， J=1.3Hz， 8-H)， 8.23(1H， dd， J=7.7Hz， J=1.3Hz， 3-H)， 10.3(1H， s， l-H)。 核磁共振碳谦13C NMR (CDC13， 100MHz) &: 24.2(C-6)， 66.6(C-7)， 127.1(C-5)， 127.8(C-10)， 132.6(C-4)， 135.8(C-3)， 138.2(C-8)， 141.0(C-9)， 164.7(C-11)， 191.5(C-1)。依据上述理化性质，结合二维核磁共振谱HMBC， HSQC和COSY ,确证本化合物 的结构如下，即式(I )。本发明的另 一个目的是提供上迷化合物的制备方法，本发明的制备方法可以使该化合 物的含量高于90%,包括以下步骤1、 将獐牙菜苦苦溶液加入真菌^^ ^///| "/^/"培养液中，使獐牙菜苦苷的最终浓度 为0.5mg/ml，在37匸，160rpm下培养5天。培养液收集、过滤、减压浓缩；2、 将上述浓缩液离心、上清液用石油瞇萃取后，再用三氯甲烷或乙酸乙酯萃取3次， 萃取液合并，回收溶剂至干；3、 将残留物溶于水中，过滤得上清液，此上清液用于制备液相分离，制备液相条件为 流动相A(0.04。/o甲^/乙猜溶液)和B( 0.04%曱^/水溶液)；梯度条件为0~10min 15%A, 10~30min 15%A~24%A， 30"0min 24%A~100%A。流速为20ml/min。制备液相分离接收 液减压浓缩、冷冻干燥，千燥物再经一次制备液相制备，制备液相条件为15V。A等梯度。 流速为20ml/min。接收液减压浓缩、冷冻千燥，干燥得纯度为98%的化合物(I )。上述方法获得的化合物(I )的含量大于98%。 制备含重为70%以上的方法如下1、 将獐牙菜苦苦溶液加入真菌/^/wg"/附w/g"中，使獐牙菜苦苷的最终浓度为 0.5mg/ml，在37t:， 160ipm下培养5天。培养液收集、过滤、减压浓缩；2、 将上述浓缩液离心、上清液用石油鍵萃取后，再用三氯曱烷或乙酸乙酯萃取3次， 萃取液合并，回收溶剂至千；3、 将残留物溶于水中，过滤得上清液，此上清液以大孔树脂吸附，先以2倍的柱床体积的水洗脱，再以5倍柱床体积的乙醇洗脱，sox:减压浓缩。4、 将浓缩液上葡聚糖凝胶Sephades G-25,以2倍柱床体积的甲醇洗脱，收集相应的 色带，50X:减压干燥，即得含量大于70%的化合物(I )。上述制备方法只是一种非限定性举例，本发明包括任何使化合物(I )含量大于70% 的代谢、分离制备方法.本发明的另一个目的是提供化合物(I)在抗肝炎药物中的应用。为了更好地观察了本药物在抗肝炎方面的作用效果，本发明设计了以下药效学试验。(一) 实验材料1、 药品与试剂本发明化合物，白色粉末，自制。2、 实验动物 Wistar种大鼠，由天津药物研究院动物室提供。(二) 实验方法与结果本发明药物对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响抗炎药效学实验 取体重为100~140g的Wistar种大鼠60只，雌雄并用，随机分成6组，每组10只。 对照组为蒸馏水，供试药为含50。/。本发明化合物的制剂。各组大鼠提前4天灌胃给药，每 天一次，剂量为30mg/kg。于末次给药后半h，以10。/。新鲜蛋清0.05ml/只注入左足下致炎， 致炎(K5h、 lh、 2h、 3h、 4h,以窄带尺测量踝关节圆周，用右足做对照，以给药前后踝关 节圃周为肿胀度，比较各组肿胀度差异。表l本发明化合物对大鼠蛋清足跖肿胀的影响组别刑重给药后不同时间(h)的胂胀度(x+SD)n0.512 34对照组-100.28 ± 0.210.22 ± 0.110.23 ± 0.140.24 ± 0.210.08 ± 0.11给药组0.030100.09 ± 0.07**0.09 ± 0.12* 0.06 ± 0.07* 0.04 ± 0.03*0.11 ± 0.02*P<0.05; **P<0.001从表1中可以看出，致炎后0.5h内，给药组与对照组的肿胀度的差异极度显著 (P<0.001);从lh到4h内两组肿胀度的差异也显著(P^.05)，由此可以看出本发明化合物 在30mg/kg的剂量下，对Wistar种大鼠蛋清足跖肿胀具有显著的效量。
图1为化合物I的HMBC谦困； 图2为化合物I的COSY谦图； 图3为化合物I的HSQC谗图。
具体实施方式
以下通过实施例和试验例对本发明作进一步的说明，但是本发明不受限于这些实施例。 实施例1将律牙菜苦苷(90%)溶于甲醇中配成浓度为50mg/ml的獐牙菜苦苷溶液，备用。 /1s/wg说"s/ifger菌种接种于培养液中，培养液的成分如下葡萄糖8g/L,蛋白胨2.58g/L， 酵母骨2.58g/L， MgS047H20 18g/L， MnS04.4H20 18g/L， K2HP0418g/L， NaCl2.58g/L, pH6.0。 37X:， 160rpm培养2天，以2%的量加入獐牙菜苦苦溶液，继续培养5天，培养 结束后收集培养液、过滤，滤液在50iC条件下减压浓缩至原体积的十分之一.浓缩液过滤， 上清液依次用石油醚、三氯甲烷萃取3次。三氯曱烷萃取液合并，合并减压蒸干，残留物 溶于15%的乙精溶液中，用于制备液相分离。制备^M目分离条件为流动相A(0.04。/o甲 ^/乙腈溶液)和B (0.04%曱^/水溶液)；梯度条件为0~10min 15°/。A, 10~30min 15% ~24%A, 30~40min 24% ~100%A。流速为20ml/min。制备液相分离接收液减压浓缩、冷 冻干燥，干燥物再经一次制备液相制备，制备液相条件为15%A等梯度。流速为20ml/min。 接收液减压浓缩、冷冻千燥，干燥得纯度为98%的化合物(I )。 实施例2将獐牙菜苦苷(50%)溶于曱醇中配成浓度为50mg/ml的獐牙菜苦苷溶液，备用。 /^/wgi7/附w&"菌种接种于培养液中，培养液的成分如下葡萄糖8g/L，蛋白胨2.58g/L， 酵母骨2.58g/L， MgS047H20 18g/L， MnS04.4H20 18g/L， K2HP04 18g/L， NaCl2.58g/L， pH6.(K 371C, 160rpm培养2天，以2%的量加入獐牙菜苦苷溶液，继续培养5天，培养 结束后收集培养液、过滤，滤液在501C条件下减压浓缩至原体积的十分之一。浓缩液过滤， 上清液依次用石油醚、三氯曱烷萃取3次。三氯甲烷萃取液合并，合并减压蒸干，残留物 溶物水中，过滤得上清液，此上清液注入已处理过的大孔树脂柱中(药物混合物与树脂的 比例为1: 20),先以2倍的柱床体积的水洗脱，再以5倍柱床体积的乙醇洗脱，乙醇50 TC减压浓缩。将浓缩液上葡聚糖凝胶S印hadesG-25，以2倍柱床体积的甲醇洗脱，收集相 应的色带，501C减压干燥，即得含量大于70%的化合物(I )。
权利要求
1. 一种新的化合物，其化学结构如下id="icf0001" file="A2007100567310002C1.gif" wi="82" he="44" top= "39" left = "62" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>(I)
2、 权利要求1的化合物的制备方法，包括以下步骤A、 以獐牙菜苦苷为原料，经过与真菌J印erg,7/附w/ger培养液混合培养5天， 培养液收集、过滤、减压浓缩；B、 将上述浓缩液离心、上清液用石油醚萃取后，再用三氯甲烷或乙酸乙酯等有 机溶剂萃取3次，萃取液合并，回收溶剂至千；C、 将残留物溶于水中，过滤得上清液，此上清液进一步用柱色i普分离，制备液 相分离接收液减压浓缩、冷冻干燥得纯度为98%的化合物(I )。
3、 权利要求1的化合物在制备抗肝炎的药物中的应用。
4、 含有治疗有效量的化合物(I )的药物组合物，
5、 根据权利要求4的药物組合物，其中化合物(I )的含量大于50%，尤其含 量大于70%为佳，尤其含重大于90%更佳。
全文摘要
本发明涉及一种具有抗肝炎活性的新的生物碱类化合物(I)及其制备方法和用途。本发明中涉及的新化合物(I)，是以獐牙菜苦苷为原料，通过与真菌Aspergllus niger混合培养而代谢生成的一个生物碱类化合物。药理试验表明，本发明化合物具有显著的抗炎作用，可用于制备治疗肝炎药物。
文档编号C12P17/18GK101239982SQ20071005673
公开日2008年8月13日 申请日期2007年2月6日 优先权日2007年2月6日
发明者刘昌孝, 军 常, 张铁军, 田成旺 申请人:天津药物研究院