专利名称：人尿中低密度脂蛋白含量酶联免疫吸附试验试剂盒及制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术产品，具体涉及一种人尿中低密度脂蛋白(Low density lipoprotein LDL)含量的酶联免疫吸附试验试剂盒及制备方法。
本发明提供了一种LDL含量酶免试剂盒，该试剂盒是用抗体LDL(IgG)包被，抗体LDL(IgG)联接辣根过氧化物酶为检测抗体的夹心法，检测人尿中的LDL含量。并由下列试剂组成①LDL抗体IgG预包被板1块②LDL抗体IgG酶标记液1瓶③LDL标准(2500、1250、625、56、10、0ng/ml)各1瓶④浓缩洗涤液1瓶⑤底物液冲液甲、乙各1瓶⑥终止液1瓶本发明的另一所要解决的技术问题是提供了上述尿中LDL含量的ELISA试剂盒的制备方法，该方法包括下列步骤一、原材料及其规格正常人血清动物新西兰大白兔，健康雄性，体重2～3kg超速离心机日立牌80-P-7型，RPZ-48T区带转子，RPS-50-2水平转子密度梯度形成仪日立牌，DGP-2型Unic紫外分光度计SP-800型酶联免疫测定仪Labosystems Dragon Multiskam MK3UV754分光光度计旋涡混合器XW-80型PHS-20型精密酸度计电泳仪上海酶标板华东理工大学ELISA测定CV％(％)＜10％辣根过氧化物酶(RZ3.0，SigMA)NaIO4A.R(进口分装)NaBH4A.R(进口分装)其他试剂Na2HPO4.12H2O A.R柠檬酸 A.RNaclA.R甘油化学纯H2O2A.RTween-20化学纯邻苯二胺化学纯H2SO4A.R蒸馏水必需符合《中国药典》(1990)之规定Low Density lipoprotein，LDL标准品(SigMA)二、包被抗体LDL多克隆抗体的制备(一)区带密度梯度离心纯化LDL操作流程本文参考Hinton(1976)区带密度梯度离心法，但做了较大改进。使用日立30-P-7离心机，RPZ-48T转子做区带离心。先用阿贝折射仪，将NaBr梯度液配制成密度为1.4的液体，然后将密度为1.4的NaBr和密度为1.0的蒸馏水经密度梯度形成仪由边孔加区带转子内，此时转速维持在2800/rpm。加至中孔有梯度液流出时，再经边孔用恒流泵注入密度为1.4的人血清50ml。待血样全部加入后，将转速上升至42000/rpm离心18小时后共得到四个峰，由中孔收样，样品流经Unic紫外分光光度计测得四个脂蛋白组分峰。其中第一个峰呈乳白色，集中在第一管，为极低密度脂蛋白(vLDL)。其余几个峰均呈浅黄色，分别为低密度脂蛋白(LDL)及高密度脂蛋白(HDL)。其余系去脂血清，含其他杂蛋白高峰。将收集到的峰，选主峰顶部数管不可太宽，以免混入中间密度脂蛋白(IDL)。(二)脂蛋白抗血清LDL的制备按常规制备蛋白质抗血清制备法。首先用纯化的LDL溶于0.01MPH7.4磷酸缓冲液中，加等量的福氏完全佐剂乳化后，给新西兰太白兔，颈背部多点及脚垫内注射2.0mg，为基础免疫。每两周加强一次，共免疫6次。最后一次免疫后8-10天抽血测试效价，效价满意者，由心脏抽血收集抗血清，抗血清再经硫酸铵两次盐析(50％及33％饱和(NH4)SO4)分步沉淀纯化成兔抗人(LDL)抗体IgG(简称LDL抗体IgG)。(三)酶标兔抗人LDL抗体IgG交联物的制备经纯化所得的兔抗人LDL抗体IgG与辣根过氧化物酶用改良的过碘酸钠法交联获得“酶标抗体IgG”。试剂配制和操作步骤如下1.过碘酸钠标记法试剂(1)0.06M NaIO4(0.13克NaIO4，加水至10ml)(2)0.16M乙二醇溶液0.1ml加水至10ml(3)NaBH4(5mg/ml，NaBH45mg加水至1ml)(4)0.05M PH9.5碳酸盐缓冲液甲液无水碳酸钠10.6克加水至500ml乙液无水碳酸氢钠16.8克加水至1000ml取甲液16ml+乙液34ml，加水至200ml(5)0.02M PH7.4 PBS(用0.1M PH7.4 PBS稀释)2.过碘酸标记法的操作步骤7.5mg HRP+0.5ml蒸馏水溶解↓加0.06M NaIO40.5ml，混合后置4℃，30分钟↓加0.16M乙二醇0.5ml室温30分钟↓加mg/ml的兔抗脂蛋白抗体IgG 0.5ml(约含LDL抗体IgG 7mg)，混合后装透析袋，用0.05M，pH9.6碳酸缓冲液透析过液↓次日吸出透析物，加NaBH4溶液0.2ml(5mg/ml)置冰箱2小时↓吸出上述结合物混合液，加入等体积饱和硫酸铵，冰箱4℃ 30’后，离心4000转/分×15分钟弃上清，沉淀溶于1ml PH7.4 0.02M PBS中透析过液，换液三次，每次1000ml↓次日，再离心除去不溶物即得“酶标抗体IgG”，分装于安瓿中密封后，置-40℃保存(四)脂蛋白LDL酶联免疫吸附试验(ELISA)双抗体夹心法的操作步骤尿样原液包被稀释液Na2CO30.16克，NaHCO30.29克，NaN30.02克，加水至100ml成为pH9.6碳酸盐缓冲液。样品稀释液NaCL 8克，KH2PO40.2克，Na2HPO42.9克，KCL0.2克，T ween-20 0.5ml，NaN30.2克，加水至1000ml，用前每100ml加10ml小牛血清成为pH7.4PBS-Tween 20样品稀释液。洗涤液Tris 2.42g，1N HCL 13ml，Tween-20 0.5ml加水至1000ml成为pH7.4 0.02M Tris-Tween 20洗涤液。基质液0.1M Na2HPO45.14ml(3.6克Na2HPO4加水100ml)，0.05M柠檬酸4.86ml(1克柠檬酸加水100ml)邻苯二胺4mg，3％H2O20.05ml成为基质液。双抗体夹心法操作程序0.1ml抗体IgG包被(20μg/ml IgG 4℃过夜)↓洗涤0.1ml样品(0.1ml尿原液)(37℃2小时)0.1ml脂蛋白标准液LDL标准品(SigMA进口)0-2500ng/ml↓洗涤0.1ml酶标抗体IgG(1∶2000)(37℃2小时)↓洗涤0.1ml基质液(邻苯二胺4mg溶于10ml)柠檬酸磷酸氢(37℃10分钟)二钠缓冲液加3％H2O20.05ml)↓0.05ml 3M H2SO4终止反应↓490nm测OD值(DG3022酶联免疫测定仪)↓计算含量(五)分离和纯化的脂蛋白LDL的鉴定经区带离心和纯化的脂蛋白LDL应用琼脂糖免疫双扩散结果显示出LDL为单一沉淀线，证明抗原已经纯化，再经0.22μ除菌滤膜过滤除菌。分别用Lowry氏法测定蛋白质含量做抗原。做免疫原时需新鲜制备品。(六)抗体IgG的鉴定经两次盐析纯化的LDL抗体IgG，经长海医院实验诊断科血清室用免疫电泳鉴定结果，LDL为单一沉淀线。(七)标准曲线的制备倍比稀释的LDL(SigMA进口)标准液，作双抗体夹心法ELISA测定，分别绘出标准曲线图。曲线呈“S”型，灵敏度良好，LDL-蛋白质(LDL-P)最低检测量均为100μg。标准曲线测定LDL-P含量范围为100-1000ng/ml。均在正常人含量波动范围之内。在ELISA双抗体夹心法的酶标板上的标准曲线的梯度浓度良好。(八)精密度试验为了明确和证明本研究的脂蛋白(LDL)ELISA的精密度，作了批内、批间和各医院实验室间重复性试验。
批内及批间实验，用混合血清分别作LDL批内测定，结果见表1。用混合血清作LDL-P批间含量测定，结果见表2。所得变异系数(CV％)，说明本法重复性良好。
表1 ELISA法测定各脂蛋白之批内实验类别稀释倍数n X(g/L) SD CV％LDL-P 1∶2000 30 0.80 0.057.01∶4000 30 0.82 0.056.6HDL-P 1∶2000 30 0.27 0.035.01∶4000 30 0.23 0.0210表2 ELISA法测定各脂蛋白之批间实验类别稀释倍数n X(g/L) SD CV％LDL-P 1∶2000 45 0.70 0.048.6HDL-P 1∶2000 30 0.22 0.029.0(九)准确性实验ELISA法与UC法测LDL-P(低密度脂蛋白-蛋白质)的比较。
用14例血样，每例血样分别用UC法和ELISA法分离测定LDL-P含量。
UC法，用日立80P-7型离心机及RPS50-2转子。取血样0.5ml，以密度为1.003-1.006的NaCL轻梯度液及密度为1.35的NaBr重梯度液配成线性梯度，49000rpm，10～15℃离心4.5小时。用恒流泵将四条LP带吸出(先用乙酰苏丹黑B予染呈兰色)。用Lowry法分别测定LDL-P含量。
ELISA法和UC法测定同一份血样结果非常显著相关，其相关系数为r＝0.975(P＜0.01)。上海长海医院肾内科进行尿脂蛋白测定的试验目前对肾脏病人尿中各种蛋白质的检测项目日益增多，而尿脂蛋白测定至今未见报道。本文测定55例各种慢性肾脏病患者尿中高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)。并对其临床意义进行初步探讨。
检测对象均为各种慢性肾脏病患者，其中原发性肾病综合症(肾病)24例(I型10例，II型14例)；慢性肾功能衰竭(慢性肾衰)19例，慢性肾炎6例；其它肾病包括隐匿性肾炎、肝硬化性肾炎、狼疮性肾炎、痛风性肾病和双肾钙化，糖尿病肾病各1例。所有检测对象均留24小时尿，以酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定尿中高密度脂蛋白-蛋白质(HDL-P)和低密度脂蛋白-蛋白质(LDL-P)，以μg/L为单位。另设对照组19例，均为正常成人。结果一、正常人尿中HDL-P和LDL-P的含量对照组正常人19例尿中HDL-P和LDL-P均为“0”。二、肾病病人尿中HDL-P和LDL-P的含量肾病病人24例，尿中HDL-P全部阳性，其中I型平均为226±178.09μg/L；*上海医学测试中心II型为357.86±172.14μg/L。I型尿LDL-P全部阴性(均为0)；II型则全部为阳性。平均105.63±112.96μg/L，且全部病例尿中HDL-P均＞LDL-P，无1例LDL-P＞HDL-P。三、慢性肾衰病人尿中HDL-P和LDL-P的含量慢性肾衰病人19例，尿中HDL-P阳性者16例(84％)，平均为411.63±392.24μg/L；尿中LDL-P阳性者12例(63％)，平均为353.33±295.91μg/L。尿中HDL-P＞LDL-P者5例(26％)。四、慢性肾炎病人HDL-P和LDL-P的含量慢性肾炎病人6例，尿中HDL-P与LDL-P均阳性，HDL-P平均为3.01±162.50μg/L，LDL-P平均为164.50±127.90μg/L。全部病例尿中HDL-P均＞LDL-P。五、其他肾脏病人尿中HDL-P和LDL-P的含量其他肾脏病人共6例，尿中HDL-P除1例狼疮性肾炎外，其余5例均阳性；但尿中LDL-P有3例阴性(狼疮性肾炎、肝硬化肾炎和痛风性肾病各1例)，两者均阳性者，HDL-P＞LDL-P。讨论检验中查见正常人对照组尿中HDL-P和LDL-P均为阴性，而慢性肾脏病人皆为阳性(两者均阳性或二者之一为阳性)者52例(95％)，可见尿脂蛋白测定可作为慢性肾脏损害的指标之一。
在无明显肾功能不全的肾病组，慢性肾炎和其他肾脏病人尿中HDL-P检出的阳性率分别为100％、100％和83％，而LDL-P则为58％、100％和50％，前者平均为94％，后者平均为69％。就例数而言，上述3组病人尿中HDL-P阳性者共35例(仅1例阴性)，而尿中LDL-P阳性者23例(13例阴性)。也就是在尿中HDL-P阳性者中有12例尿中LDL-P阴性。就数值而言，肾病组和慢性肾炎组病人尿中HDL-P平均值明显＞LDL-P平均值(肾病组尿HDL-P平均值与尿LDL-P平均值相差非常显著，P＜0.001)；其它肾病组各例尿中HDL-P均＞LDL-P。故认为对于无明显肾功能不全的肾脏病人检测其尿中HDL-P较LDL-P敏感。
慢性肾衰组尿中HDL-P虽检出阳性率及平均值均＞LDL-P(两者平均值相差不显著，P＞0.05)，但其中5例尿中LDL-P明显＞HDL-P(包括尿HDL-P阴性者而尿LDL-P460μg/I1例)，1例中尿中HDL-P与LDL-P相等(均为500μg/L)。经统计学处理证明与尿HDL-P或血LDL-P均无相关性。另2例两者均阴性，但与血中尿素氮，血清肌酐或肌酐清除率均无相关性。
24例肾病病人中I型者尿中HDL-P均阳性，而LDL-P均阴性；II型者两者均阳性，故可作为肾病I型与II型鉴别的指标之一。I型尿脂蛋白检查与尿中C3测定或园盘电泳检测白蛋白相吻合；II型尿脂蛋白检查与激素反应相吻合。这种差异的机理似与两种脂蛋白的园形颗粒直径大小不同有关，HDL-P为6.5～9.5mum，LDL为20～25mum，HDL明显＜LDL，一般认为I型肾小球滤过膜损害较轻，推测其仅允许颗粒直径小的HDL通过，而不允许颗粒直径大的LDL通过；而II型肾小球滤过膜损害严重，则颗粒直径大的LDL也可通过。故初步认为对尿脂蛋白测定可作为选择性蛋白尿与非选择性蛋白尿鉴别指标之一。
采用上海新新医学生物工程有限公司提供ELISA法及其试剂盒测定尿中HDL-P和LDL-P是一种简单快速、不需特殊仪器、易掌握的优于肾脏病尿中其检验方法，并具有高度的敏感性和特异性。故从方法学来讲，对肾脏病的诊断和分型有重要的临床应用价值，应大力推广。上海第二医科大学附属新华医院用ELISA法测定尿中脂蛋白的试验在某些疾病中，尿中可出现脂蛋白。本文用酶联免疫吸附试验(简称ELISA)法，在我院首次用于临床检测38例慢性肾脏疾患尿中高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)，现将结果公布如下一、方法用上海新新医学生物工程有限公司提供的药盒，以ELISA法进行检测。二、对象(1)选正常人3个年龄组，4～16岁组(男25人，女12人)，17～23岁组(男28人，女17人)，45～60岁组(男40人，女27人)。测定其中高密度脂蛋白—蛋白质(HDL-P)及低密度脂蛋白—蛋白质(LDL-P)含量。
(2)选正常人15人，慢性肾脏疾患38例，其中肾病综合症18例。测定其尿中HDL-P及LDL-P含量。三、结果1.ELISA方法学鉴定(1)HDL-P及LDL-P的标准曲线(如
图1 ELISA法测脂蛋白的标准曲线所示)，曲线呈“S”状，可测范围在80～1000ng/L之间，与长海医院的标准曲线基本一致。
(2)我院与长海医院同做一组血样结果，发现HDL-P含量呈显著相关(如图2所示)n＝10，r＝0.642，P＜0.05。LDL-P含量(如图3所示)呈非常显著相关。N＝10，r＝0.817，P＜0.01。
2.正常人血中脂蛋白含量血中HDL-P含量，三个年龄组含量均值相差不大。LDL-P含量均值随年龄而增加。HDL-P及LDL-P含量，均女性高于男性。
3.正常人尿中脂蛋白含量检测正常人对照15例，尿中HDL-P及LDL-P均为阴性。检测肾病综合症18例，结果见表3。I型(8例)肾病综合症尿中HDL-P为阳性，LDL-P为阴性，II型(10例)肾病综合症尿中HDL-P及LDL-P均为阳性。四、讨论根据我院试用ELISA方法结果，呈“S”型的标准曲线与长海医院基本一致。同做一组样品呈显著相关。说明该法准确性及重演性均较好。
正常人血中HDL-P及LDL-P含量与长海医院结果相一致。
15例正常人尿中均未见HDL及LDL，而肾病综合症组患者，I型(轻型)尿中只出现HDL而II型(重型)尿中出现HDL及LDL。由于呈球状的LP分子颗粒大小不一样，LDL分子直径约为HDL的2～3倍，因此尿中LP出现的种类不同不仅说明肾小球泸过膜受到损害，而且还能说明其损害的程度，故用ELISA法对肾病综合症进行分型比其他方法更为敏感，而HDL比LDL又更敏感些。ELISA法简便快速，特异性强，灵敏度高，用于临床有较大的社会效益和经济效益。
表3 肾病综合症尿中HDL及LDL含量(μg/L)I型 II型HDL-P LDL-P HDL-P LDL-P0 0 450 1003000 440 1004000 300 2003000 500 4004500 620 3000 0 400 3005000 820 8000 0 500 300600 450400 260上海第六人民医院用ELISA法测定血和尿中脂蛋白的试验上海新新医学生物工程有限公司创立了用ELISA法检测肾病病人尿中脂蛋白组分的新方法。我院用其提供的药盒用于临床，感到较原来的方法更为科学，合理。现将结果公布如下一、方法用上海新新医学生物工程有限公司提供的药盒，以ELISA法进行检测。二、对象选正常健康人10人，急慢性肾脏疾患28例，其中急慢性肾炎8例，肾病综合症10例，蛋白尿10例，测定其尿中HDL-P及LDL-P含量。三、结果(一)ELISA方法学鉴定1.HDL-P及LDL-P的标准曲线(如图4所示)，曲线呈“S”状，可测范围在80～1000ng/L之间，与长海医院的标准曲线基本一致。
2.我院与长海医院同做一组血样结果，发现HDL-P含量呈显著相关(如图5所示)，LDL-P含量呈非常显著相关(如图6所示)。(二)检测健康人尿液10例，HDL-P和LDL-P均为阴性检测各种肾病28例尿液中脂蛋白组分含量，其中急慢性肾炎3例，3例HDL阳性(阳性率38％)，2例LDL阳性(阳性率25％)，肾病综合症10例，8例HDL阳性，(阳性率80％)，5例LDL阳性(阳性率50％)，蛋白尿10例，6例HDL阳性(阳性率60％)，3例LDL阳性(阳性率30％)，见附表4。
表4 各肾脏疾患尿中脂蛋白含量(μg/L)急慢性肾炎肾病综合症 蛋白尿HDL-P LDL-P HDL-P LDL-P HDL-P LDL-P- - 200- - -700- - - - -360- 640100*620100300- 640250*520-- - 2000 320*450200- - - - 300-40032045080*460-400260300- 540150400- - -44070*- -注*者为肾病综合症II型四、讨论根据我院试用ELISA方法，呈“S”型的标准曲线与长海医院基本一致。同做一组样品呈显著相关。说明该法准确性及重复性均较好。10例健康人尿中均未见HDL及LDL，而各种肾脏疾患则程度不同地出现HDL或(LDL)。有意义的是，在10例肾病综合症患者中，仅含有HDL均为阴性的是临床诊断为I型(轻型)的病人，而II型(重型)尿中出现HDL和LDL这是由于肾小球滤过膜受损的严重程度不一，以及小分子量的HDL比LDL更容易滤出的原因故用ELISA法对肾病综合症进行分型比其他方法更为敏感。在蛋白尿和急慢性肾炎时，我们也可根据其尿中LP的种类及多少，来诊断其病情的严重程度以及预后等等。同济大学上海放射免疫研究所用ELISA法测定人尿中脂蛋白的试验在某些肾脏疾病中，尿中可出现不同类型的脂蛋白，但以往没有见过这方面的报导。我所首先运用上海新新医学生物工程有限公司创立的用酶联免疫吸附试验(简称ELISA)法检测人尿中高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)。
现将结果公布如下一、方法用上海新新医学生物工程有限公司提供的药盒，以ELISA法进行检测。二、对象(1)选正常健康人3个年龄组，4～16岁组(男20人，女30人)，17～23岁组(男25人，女20人)和45～60岁组(男35人，女30人)，测定其中高密度脂蛋白2-蛋白质(HDL-P)及低密度脂蛋白—蛋白质(LDL-P)含量。
(2)选正常健康人10人，慢性肾脏疾患27例，其中肾病综合症16例，慢性肾炎11例，测定其尿中HDL-P及LDL-P含量。三、结果1.ELISA方法学鉴定(1)HDL-P及LDL-P的标准曲线(如图7 ELISA法测脂蛋白的标准曲线所示)，曲线呈“S”状。可测范围在80～1000ng/L之间，与长海医院的标准曲线基本一致。
(2)我所与长海医院同做一组样品，结果发现HDL-P含量呈显著相关。n＝10，r＝0.726，P＜0.05(如图8所示)，LDL-P含量呈非常显著相关。n＝10，r＝0.866，p＜0.01(如图9所示)。
(3)检测正常健康人尿中脂蛋白组分含量尿中HDL-P及LDL-P均为“0”。检测肾病综合症16例，其中I型7例，II型9例，尿中脂蛋白含量见表5。检测慢性肾炎11例，尿中脂蛋白含量见表6。
表5 肾病综合症病人尿中脂蛋白含量(μg/L)I型 II型HDL-P LDL-P HDL-P LDL-P450 0 300200300 0 500400400 0 100400440 0 100240300 0 220210450 0 300 1600 0 530 110700 230800 250四、讨论根据我所试用ELISA方法结果，呈“S”型的标准曲线与长海医院基本一致。同做一组样品呈显著相关。说明该法准确性及重演性均好。10例健康人尿中均未见HDL和LDL，而肾病综合症16例表6 慢性肾炎病人尿中脂蛋白的含量(μg/L)HDL-PLDL-P400 32000400 260500 2500000100 000250 10000600 320尿中HDL阳性有15例，阳性率为93.7％，LDL阳性有9例，阳性率为60％，有意义的是，I型(轻型)尿中只出现HDL，而II型(重型)尿中出现HDL和LDL。由于呈球状的LP分子颗粒大小不一样，LDL分子直径约为HDL的2～3倍，因此尿中LP出现的种类不同有仅说明肾小球泸过膜受到损害，而且还能说明其损害的程度，故用ELISA法对肾病综合症进行分型比其他方法更为敏感。慢性肾炎病人11例，其中6例HDL阳性，阳性率为54％，5例LDL阳性，阳性率为45％，可根据该病人尿中是否出现LP，以及出现的种类，含量的多少，来判断肾炎病人的病情轻重，以及预后。ELISA法简便快速，特异性强，灵敏度高，用于临床有较大的社会效益和经济效益。
本文参考Hinton(1976)区带密度梯度离心法，但做了较大改进。使用日立30-P-7离心机，RPZ-48T转子做区带离心。先用阿贝折射仪，将NaBr梯度液配制成密度为1.4的液体，然后将密度为1.4的NaBr和密度为1.0的蒸馏水经密度梯度形成仪由边孔加区带转子内，此时转速维持在2800/rpm。加至中孔有梯度液流出时，再经边孔用恒流泵注入密度为1.4的人血清50ml。待血样全部加入后，将转速上升至42000/rpm离心18小时后共得到四个峰，由中孔收样，样品流经Unic紫外分光光度计测得四个脂蛋白组分峰。其中第一个峰呈乳白色，集中在第一管，为极低密度脂蛋白(vLDL)。其余几个峰均呈浅黄色，分别为低密度脂蛋白(LDL)及高密度脂蛋白(HDL)。其余系去脂血清，含其他杂蛋白高峰。将收集到的峰，选主峰顶部数管不可太宽，以免混入中间密度脂蛋白(IDL)。(二)脂蛋白抗血清LDL的制备按常规制备蛋白质抗血清制备法。首先用纯化的LDL溶于0.01MPH7.4磷酸缓冲液中，加等量的福氏完全佐剂乳化后，给新西兰大白兔，颈背部多点及脚垫内注射2.0mg，为基础免疫。每两周加强一次，共免疫6次。最后一次免疫后8-10天抽血测试效价，效价满意者，由心脏抽血收集抗血清，抗血清再经硫酸铵两次盐析(50％及33％饱和(NH4)SO4)分步沉淀纯化成兔抗人(LDL)抗体IgG(简称LDL抗体IgG)。(三)酶标兔抗人LDL抗体IgG交联物的制备经纯化所得的兔抗人LDL抗体IgG与辣根过氧化物酶用改良的过碘酸钠法交联获得“酶标抗体IgG”。试剂配制和操作步骤如下1.过碘酸钠标记法试剂(1)0.06M NaIO4(0.13克NaIO4，加水至10ml)(2)0.16M乙二醇溶液0.1ml加水至10ml(3)NaBH4(5mg/ml，NaBH45mg加水至1ml)(4)0.05M PH9.5碳酸盐缓冲液甲液无水碳酸钠10.6克加水至500ml乙液无水碳酸氢钠16.8克加水至1000ml取甲液16ml+乙液34ml，加水至200ml(5)0.02M PH7.4 PBS(用0.1M PH7.4 PBS稀释)。2.过碘酸标记法的操作步骤7.5mg HRP+0.5ml蒸馏水溶解↓加0.06M NaIO40.5ml，混合后置4℃，30分钟↓加0.16M乙二醇0.5ml室温30分钟
↓加mg/ml的兔抗脂蛋白抗体IgG 0.5ml(约含LDL抗体IgG 7mg)，混合后装透析袋，用0.05M，pH9.6碳酸缓冲液透析过液↓次日吸出透析物，加NaBH4溶液0.2ml(5mg/ml)置冰箱2小时↓吸出上述结合物混合液，加入等体积饱和硫酸铵，冰箱4℃ 30’后，离心4000转/分×15分钟弃上清，沉淀溶于1ml PH7.4 0.02M PBS中透析过液，换液三次，每次1000ml↓次日，再离心除去不溶物即得“酶标抗体IgG”，分装于安瓿中密封后，置-40℃保存(四)脂蛋白LDL酶联免疫吸附试验(ELISA)双抗体夹心法的操作步骤尿样原液包被稀释液Na2CO30.16克，NaHCO30.29克，NaN30.02克，加水至100ml成为pH9.6碳酸盐缓冲液样品稀释液NaCL 8克，KH2PO40.2克，Na2HPO42.9克，KCL0.2克，T ween-20 0.5ml，NaN30.2克，加水至1000ml，用前每100ml加10ml小牛血清成为pH7.4PBS-Tween 20样品稀释液洗涤液Tris 2.42g，1N HCL 13ml，Tween-20 0.5ml加水至1000ml成为pH7.4 0.02M Tris-Tween 20洗涤液。基质液0.1M Na2HPO45.14ml(3.6克Na2HPO4加水100ml)，0.05M柠檬酸4.86ml(1克柠檬酸加水100ml)邻苯二胺4mg，3％H2O20.05ml成为基质液。
表I 双抗体夹心法操作程序0.1ml抗体IgG包被(20μg/ml IgG 4℃过夜)↓洗涤0.1ml样品(0.1ml尿原液)(37℃2小时)0.1ml脂蛋白标准液 LDL标准品(SigMA进口)0-2500ng/ml↓洗涤0.1ml酶标抗体IgG(1∶2000)(37℃2小时)↓洗涤0.1ml基质液(邻苯二胺4mg溶于10ml)柠檬酸磷酸氢(37℃ 10分钟)二钠缓冲液加3％H2O20.05ml)
↓0.05ml 3M H2SO4终止反应↓490nm测OD值(DG 3022酶联免疫测定仪)↓计算含量(五)分离和纯化的脂蛋白LDL的鉴定经区带离心和纯化的脂蛋白LDL应用琼脂糖免疫双扩散结果显示出LDL为单一沉淀线，证明抗原已经纯化，再经0.22μ除菌滤膜过滤除菌。分别用Lowry氏法测定蛋白质含量做抗原。做免疫原时需新鲜制备品。(六)抗体IgG的鉴定经两次盐析纯化的LDL抗体IgG，经长海医院实验诊断科血清室用免疫电泳鉴定结果，LDL为单一沉淀线。(七)标准曲线的制备倍比稀释的LDL(SigMA进口)标准液，作双抗体夹心法ELISA测定，分别绘出标准曲线图。曲线呈“S”型，灵敏度良好，LDL-蛋白质(LDL-P)最低检测量均为100μg。标准曲线测定LDL-P含量范围为100-1000ng/ml。均在正常人含量波动范围之内。在ELISA双抗体夹心法的酶标板上的标准曲线的梯度浓度良好。(七)精密度试验为了明确和证明本研究的脂蛋白(LDL)ELISA的精密度，作了批内、批间和各医院实验室间重复性试验。
批内及批间实验，用混合血清分别作LDL批内测定，结果见表1。用混合血清作LDL-P批间含量测定，结果见表2。所得变异系数(CV％)，说明本法重复性良好。
表1 ELISA法测定各脂蛋白之批内实验类别 稀释倍数n X(g/L) SD CV％LDL-P 1∶2000 300.80 0.057.01∶4000 300.82 0.056.6HDL-P 1∶2000 300.27 0.035.01∶4000 300.23 0.0210
表2 ELISA法测定各脂蛋白之批间实验类别 稀释倍数 nX(g/L) SD CV％LDL-P1∶200045 0.70 0.048.6HDL-P1∶200030 0.22 0.029.0(九)准确性实验ELISA法与UC法测LDL-P(低密度脂蛋白-蛋白质)的比较。
用14例血样，每例血样分别用UC法和ELISA法分离测定LDL-P含量。
UC法，用日立80P-7型离心机及RPS50-2转子。取血样0.5ml，以密度为1.003-1.006的NaCL轻梯度液及密度为1.35的NaBr重梯度液配成线性梯度，49000rpm，10～15℃离心4.5小时。用恒流泵将四条LP带吸出(先用乙酰苏丹黑B予染呈兰色)。用Lowry法分别测定LDL-P含量。
ELISA法和UC法测定同一份血样结果非常显著相关，其相关系数为r＝0.975(P＜0.01)。
权利要求
1.一种人尿中低密度脂蛋白的含量酶联免疫吸附试验试剂盒，其特征在于该试剂盒是由下列试剂组成的①LDL抗体IgG预包被板1块②LDL抗体IgG酶标记液1瓶③LDL标准(2500、1250、625、56、10、0ng/ml)各1瓶④浓缩洗涤液1瓶⑤底物液冲液甲、乙各1瓶⑥终止液1瓶
2.一种如权利要求1所述的一种人尿中低密度脂蛋白含量酶联免疫吸附试验试剂盒的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤一、原材料及其规格正常人血清动物新西兰大白兔，健康雄性，体重2～3kg超速离心机日立牌80-P-7型，RPZ-48T区带转子，RPS-50-2水平转子密度梯度形成仪日立牌，DGP-2型Unic紫外分光度计SP-800型酶联免疫测定仪Labosys tems Dragon Multiskan MK3UV754分光光度计旋涡混合器XW-80型PHS-20型精密酸度计电泳仪上海酶标板华东理工大学ELISA测定CV％＜10％辣根过氧化物酶RZ3.0，SigMANaIO4A.R进口分装NaBH4A.R进口分装其他试剂Na2HPO4.12H2O A.R柠檬酸 A.RNaclA.R甘油化学纯H2O2A.RTween-20化学纯邻苯二胺化学纯H2SO4A.R蒸馏水必需符合《中国药典》(1990)之规定Low Density lipoprotein，LDL标准品SigMA二、包被抗体LDL多克隆抗体的制备(一)区带密度梯度离心纯化LDL操作流程本文参考Hinton 1976区带密度梯度离心法，但做了较大改进。使用日立30-P-7离心机，RPZ-48T转子做区带离心，先用阿贝折射仪，将NaBr梯度液配制成密度为1.4的液体，然后将密度为1.4的NaBr和密度为1.0的蒸馏水经密度梯度形成仪由边孔加区带转子内，此时转速维持在2800/rpm，加至中孔有梯度液流出时，再经边孔用恒流泵注入密度为1.4的人血清50ml，待血样全部加入后，将转速上升至42000/rpm离心18小时后共得到四个峰，由中孔收样，样品流经Unic紫外分光光度计测得四个脂蛋白组分峰，其中第一个峰呈乳白色，集中在第一管，为极低密度脂蛋白vLDL，其余几个峰均呈浅黄色，分别为低密度脂蛋白LDL及高密度脂蛋白HDL，其余系去脂血清，含其他杂蛋白高峰，将收集到的峰，选主峰顶部数管不可太宽，以免混入中间密度脂蛋白IDL；(二)脂蛋白抗血清LDL的制备按常规制备蛋白质抗血清制备法，首先用纯化的LDL溶于0.01MPH7.4磷酸缓冲液中，加等量的福氏完全佐剂乳化后，给新西兰大白兔，颈背部多点及脚垫内注射2.0mg，为基础免疫，每两周加强一次，共免疫6次，最后一次免疫后8-10天抽血测试效价，效价满意者，由心脏抽血收集抗血清，抗血清再经硫酸铵两次盐析，50％及33％饱和(NH4)SO4分步沉淀纯化成兔抗人LDL抗体IgG，简称LDL抗体IgG；(三)酶标兔抗人LDL抗体IgG交联物的制备经纯化所得的兔抗人LDL抗体IgG与辣根过氧化物酶用改良的过碘酸钠法交联获得“酶标抗体IgG”，试剂配制和操作步骤如下I.过碘酸钠标记法试剂(1)0.06M NaIO4，0.13克NaIO4，加水至10ml(2)0.16M乙二醇溶液0.1ml加水至10ml(3)NaBH4，5mg/ml，NaBH45mg加水至1ml(4)0.05M PH9.5碳酸盐缓冲液甲液无水碳酸钠10.6克加水至500ml乙液无水碳酸氢钠16.8克加水至1000ml取甲液16ml+乙液34ml，加水至200ml(5)0.02M PH7.4 PBS，用0.1M PH7.4 PBS稀释II.过碘酸标记法的操作步骤7.5mg HRP+0.5ml蒸馏水溶解↓加0.06M NaIO40.5ml，混合后置4℃，30分钟↓加0.16M乙二醇0.5ml室温30分钟↓加mg/ml的兔抗脂蛋白抗体IgG 0.5ml约含LDL抗体IgG 7mg，混合后装透析袋，用0.05M，pH9.6碳酸缓冲液透析过液↓次日吸出透析物，加NaBH4溶液0.2ml 5mg/ml置冰箱2小时↓吸出上述结合物混合液，加入等体积饱和硫酸铵，冰箱4℃ 30’后，离心4000转/分×15分钟弃上清，沉淀溶于1ml PH7.4 0.02M PBS中透析过液，换液三次，每次1000ml↓次日，再离心除去不溶物即得“酶标抗体IgG”，分装于安瓿中密封后，置-40℃保存(四)脂蛋白LDL酶联免疫吸附试验ELISA双抗体夹心法的操作步骤尿样原液包被稀释液Na2CO30.16克，NaHCO30.29克，NaN30.02克，加水至100ml成为pH9.6碳酸盐缓冲液样品稀释液NaCL 8克，KH2PO40.2克，Na2HPO42.9克，KCL0.2克，T ween-20 0.5ml，NaN30.2克，加水至1000ml，用前每100ml加10ml小牛血清成为pH7.4PBS-Tween 20样品稀释液洗涤液Tris 2.42g，1N HCL 13ml，Tween-20 0.5ml加水至1000ml成为pH7.4 0.02M Tris-Tween 20洗涤液基质液0.1M Na2HPO45.14ml，3.6克Na2HPO4加水100ml，0.05M柠檬酸4.86ml，1克柠檬酸加水100ml邻苯二胺4mg，3％H2O20.05ml成为基质液。双抗体夹心法操作程序0.1ml抗体IgG包被，20μg/ml IgG 4℃过夜↓洗涤0.1ml样品0.1ml尿原液，37℃2小时0.1ml脂蛋白标准液 LDL标准品，SigMA进口0-2500ng/ml↓洗涤0.1ml酶标抗体IgG 1∶2000，37℃2小时↓洗涤0.1ml基质液，邻苯二胺4mg溶于10ml柠檬酸磷酸氢，37℃ 10分钟二钠缓冲液加3％H2O20.05ml↓0.05ml 3M H2SO4终止反应↓490nm测OD值，DG3022酶联免疫测定仪↓计算含量(五)分离和纯化的脂蛋白LDL的鉴定经区带离心和纯化的脂蛋白LDL应用琼脂糖免疫双扩散结果显示出LDL为单一沉淀线，证明抗原已经纯化，再经0.22μ除菌滤膜过滤除菌，分别用Lowry氏法测定蛋白质含量做抗原。做免疫原时需新鲜制备品；(六)抗体IgG的鉴定经两次盐析纯化的LDL抗体IgG，经长海医院实验诊断科血清室用免疫电泳鉴定结果，LDL为单一沉淀线；(七)标准曲线的制备倍比稀释的LDL SigMA进口标准液，作双抗体夹心法ELISA测定，分别绘出标准曲线图，曲线呈“S”型，灵敏度良好，LDL-蛋白质LDL-P最低检测量均为100μg，标准曲线测定LDL-P含量范围为100-1000ng/ml，均在正常人含量波动范围之内，在ELISA双抗体夹心法的酶标板上的标准曲线的梯度浓度良好；(七)精密度试验为了明确和证明本研究的脂蛋白LDL ELISA的精密度，作了批内、批间和各医院实验室间重复性试验；批内及批间实验，用混合血清分别作LDL批内测定，结果见表1，用混合血清作LDL-P批间含量测定，结果见表2，所得变异系数(CV％)，说明本法重复性良好；表1 ELISA法测定各脂蛋白之批内实验类别稀释倍数 n X(g/L)SD CV％LDL-P 1∶2000 30 0.80 0.05 7.01∶4000 30 0.82 0.05 6.6HDL-P 1∶2000 30 0.27 0.03 5.01∶4000 30 0.23 0.02 10表2 ELISA法测定各脂蛋白之批间实验类别 稀释倍数 n X(g/L) SD CV％LDL-P1∶2000 450.70 0.048.6HDL-P1∶2000 300.22 0.029.0(九)准确性实验ELISA法与UC法测LDL-P，低密度脂蛋白-蛋白质的比较；用14例血样，每例血样分别用UC法和ELISA法分离测定LDL-P含量；UC法，用日立80P-7型离心机及RPS50-2转子，取血样0.5ml，以密度为1.003-1.006的NaCL轻梯度液及密度为1.35的NaBr重梯度液配成线性梯度，49000rpm，10～15℃离心4.5小时，用恒流泵将四条LP带吸出，先用乙酰苏丹黑B予染呈兰色，用Lowry法分别测定LDL-P含量；ELISA法和UC法测定同一份血样结果非常显著相关，其相关系数为r＝0.975，P＜0.0全文摘要
本发明涉及生物技术产品技术领域。本发明公开了一种人尿中低密度脂蛋白含量酶联免疫吸附试验试剂盒及制备方法。本发明的试剂盒经临床试验结果表明对肾病患者的诊断比较确切，方法简便快速，特异性强，灵敏度高，有较好的临床应用前景。
文档编号G01N33/487GK1427258SQ0114268
公开日2003年7月2日 申请日期2001年12月18日 优先权日2001年12月18日
发明者杜凤鸣 申请人:杜凤鸣