专利名称：分析比较微生物群落结构的监测方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物生态学领域的监测方法，具体是一种分析比较微生物群落结构的监测方法。
背景技术：
长期以来，在利用微生物生态系统进行生产活动的许多行业部门，受微生物分离培养技术的限制，无法全面、客观地认识系统中的群落成员，无法及时动态跟踪系统成员种群数量变化对系统功能的影响，生产效率不仅低，且不稳定。而通过分析微生物群落的总基因组DNA的组成，可以比较客观地认识微生物群落的结构，由于16S rDNA中包含了相应细菌种类的系统分类地位的信息，因此，以16S rDNA为对象可以比较准确地分析微生物群落的种群结构组成。一种常用的技术是构建基因文库。例如，根据16S rDNA在进化上的保守性特点设计具有不同专一性的通用引物，扩增环境中所有细菌或某一个类群细菌的16SrDNA，将扩增产物克隆到载体上构建成基因文库，通过分析一定数量的克隆子的序列以及它们的出现频率，可以在一定程度上了解环境样品中的主要细菌类群及其出现丰度等种群结构信息。这种方法需要进行克隆、测序等分子水平的工作，需要良好的实验条件和专用设备，耗费人力、财力和时间都较大，难以在医院、工厂等实际生产场所应用。另外，由于PCR扩增的偏好性，对生态系统样品中的种群结构的测度准确性也不特别高。目前基于16S rDNA扩增用的较多的还有通过温度梯度凝胶电泳或变性梯度凝胶电泳分析PCR扩增得到16SrDNA可变区(如V3区)序列的多样性，从而反映微生物区系的复杂性。但这种方法也只能对大小为500bp以下的序列进行有效分离，而且当微生物种类过多时，同一个条带可以包含多个种类的DNA信息，因此，不能做到在较高的分辨率下分析比较微生物群落结构的差异。
对微生物生态系统进行动态检测和平行比较的方法还有基于环境样品中微生物总基因组的RAPD指纹图谱技术。该技术是用短的(8-12bp)随机的单个引物序列通过PCR扩增技术便可获得样本的指纹图谱，由于每条引物序列均很短，会在整个样本的基因组DNA上随机退火，只要2个引物在模板上的结合位点相近，结合方向互补，就可以扩增得到DNA片段。1999年Wikstromd等人报道了(Biomonitoring complex microbial communities using random amplifiedpolymorphic DNA and principal component analysis，用RAPD结合主成分分析技术生物检测复杂的微生物群落)用6个不同的传统短引物RAPD分析实验室的2个模拟装置“Flask system”和“ Bioreactor system”中微生物群落结构在3周内RAPD指纹图谱的变化情况，结果显示RAPD指纹图谱在检测时间内较为稳定。然而，用这种短的随机引物的RAPD-PCR技术最大的不足在于引物太短(8-12bp)，获得的指纹纹图谱条带多而复杂，不利于同时分析比较大量数据，以及PCR反应本身的可重复性较差，即使同一次实验的不同反应管也会有差异，不同的操作人员、不同的实验室差异就更大。
发明内容
本发明的目的在于克服现有短的RAPD-PCR技术中的不足，提供一种分析比较微生物群落结构的监测方法，即分析比较微生物群落结构差异的LP-RAPD-PCR(长引物随机扩增多态性DNA的聚合酶链式反应)分子生态监测方法，使其具有重复性好、灵敏、简易的特点。本发明所用引物长约15-24bp，PCR反应中用一对引物扩增而不是单个的引物，PCR的退火温度在52度。所涉及用LP-RAPD扩增技术同时比较各种生态环境中微生物群落结构的差异及同一生态系统中微生物种群结构的时空动态变化，具有重复性高、简便、快速、灵敏的特点。
本发明是通过以下技术方案实现的，方法步骤如下1)选定一对LP-RAPD引物，长度15-24bp，(G+C)含量50％；2)环境样品中混合微生物总基因组DNA的提取；3)LP-RAPD循环反应，退火温度在52℃；4)待测生态系统微生物混合DNA的LP-RAPD产物经1.2-1.5％琼脂糖凝胶电泳；5)通过Southern-Blot印迹杂交检测。
以下对本发明的进一步限定首先，选择或设计研究目标微生物生态系统的LP-RAPD的引物，并确定PCR反应的循环程序。不同的研究对象，即不同的微生物生态系统，提取混合微生物基因组DNA没有通用的方法，要根据具体情况采用合适的方法。引物设计的原则是1对长度为15-24bases，(G+C)含量50％，并确定PCR反应的循环程序，LP-RAPD-PCR的25μL PCR反应体系中，含模板80ng，23mN MgCl22.5μL，2.5mM的dNTP mix 2μL，20pmol的引物各1μL；PCR反应的循环程序为95℃预变性7min，75℃保温时加入Taq DNA聚合酶；之后进入循环，94℃变性1min，52℃退火1min，65℃延伸8min，30个循环；最后65℃延伸16分钟。PCR产物要进行浓度测定，PCR产物经DyNA quant200浓度测定后，取大约5μgPCR产物，可以使用市售的PCR产物纯化试剂盒，经MO BIO UltraCleanPCR Clean-up DNA Purification kit纯化，纯化后经DyNA quant 200进行浓度测定；LP-RAPD的扩增产物是多种不同大小和序列的DNA片段的混合物，使用某种方法可以对这些DNA片段进行标记，例如地高辛标记，探针标记体系含纯化后的PCR产物3μg，10×六核苷酸混合物2μL，dCTP、dGTP、dATP各1mM、dTTP0.65mM、DIG-11-dUTP0.35mM的dNTPs mix 2μL，2u/μL的klenow酶1μL，水补足到20μL，37℃标记20h，反应结束后加4M LiCl2μL，0.2MPH8.0的EDTA2.5μL，75μL冰冷的无水已醇，混匀后-20℃沉淀至少2h，之后14,000rpm/min离心30min，70％的已醇洗滴，14,000rpm/min离心30min，干燥后溶于50μL无菌水中。
待测目标微生物生态系统混合DNA的LP-RAPD指纹图谱，经1.2％或1.5％琼脂糖凝胶电泳后，真空转迹于带正电荷的尼纶膜上；真空转迹、固定完毕后，将转移膜浸于50ml Blocking solution中，该溶液组成为0.1M马来酸，0.15MNaCl，1g Blocking reagent，PH7.5，将膜卷于杂交管中，68℃预杂交至少30min，变性DNA探针，沸水中煮10分钟，大约500ng，立即置于冰盐混合物中，用含有探针的杂交液20ml更换预杂交液60℃杂交至少10h，回收含有探针的杂交液，贮存于-20℃，每次用之前68℃变性10min，杂交完毕后，先用50ml2×SSC，0.1％SDS室温洗膜两次，每次15min；再用50ml0.5×SSC，0.1％SDS68℃洗膜两次，每次15min，最后进行显色反应。
真空转迹，其方法如下①真空转迹框保持清洁干燥，与缓冲瓶、真空泵连接；②将带口的塑料膜置于支持膜上，去离子水预湿的滤纸和转移膜，可以用硝酸纤维素膜或带正电的尼纶膜，先后倾斜45度角缓缓铺于塑料膜窗口下并完全覆盖该窗口，排除任何气泡；③凝胶倾斜45度角缓缓置于塑料膜窗口上，排除凝胶与转移膜间的气泡；④安装顶框，以四个夹子对称固定，打开真空泵固定凝胶；⑤加足够的溶液1，配方为去嘌呤液，0.25M HCl，覆盖凝胶，稳定真空泵在50mbar，所有进一步的处理均在50mbar进行；⑥7min后，倾斜转迹框，拥戴手套的手指轻轻去除凝胶表面液体；⑦加足够的溶液2，配方为变性液，1.5M NaCl，0.5M NaOH，覆盖凝胶，同上，等待7min，彻底移走残留的液体；⑧加足够的溶液3，配方为中和液，1.0M Tris，1.5M NaCl，PH7.5，覆盖凝胶，同上，等待7min，彻底移走残留的液体；⑨加溶液4，配方为转移液，20×SSC，转移液覆盖凝胶的厚度为凝胶厚度的两倍，等待30～40min，彻底移走残留的液体；⑩关闭真空泵，移走凝胶，取出膜，紫外固定5min，室温干燥。
显色反应，其方法如下①在Washing Buffer，配方为0.1M马来酸，0.15M NaCl，0.3％(v/v)Tween 20，PH7.5，中简短洗膜1～5min，然后在100ml Blocking Solution中轻摇30min；②在20ml Antibody Solution中，轻摇30min，抗体以1∶5000稀释于Blocking Solution中；③在100ml Washing Buffer洗膜两次，每次15min；④在20ml Detection Buffer，配方为0.1M Tris，0.1M NaCl，PH9.5，20℃，中平衡2～5min，用10ml新鲜配置的显色液再暗处显色，配方为加200μL的NBT/BCIP到10ml Detection Buffer中；⑤显色完毕后，将膜侵入去离子水中以终止反应，照相或扫描记录结果。
本发明将LP-RAPD技术应用到研究自然界复杂环境样品中，不经纯培养直接提取环境样品中混合微生物的总基因组DNA，其中DNA分子的种类及各分子的相对比例反应了环境样品中菌群的种类数量及种群之间的相对比例，生态系统中微生物群落结构的组成信息转化成了提取到的不同DNA分子的组成和相对比例。不同的环境样品DNA分子的组成及相对数量不同，这种差异又间接地反应在LP-RAPD获得的指纹图谱中。在多种细菌组成的微生物群落中，各种细菌当其种群数量超过总数量的1-10％时，其特征性LP-RAPD主条带就可以在群落结构DNA指纹图中表现出来。因此，在得到的LP-RAPD指纹图中，每一条带可以是来自若干种不同微生物的基因组DNA片段组成，条带的数目反映微生物类群的多少，每一条带的亮度反映该类群微生物种群数量的高低，这样，生态系统中微生物群落的结构信息，就被间接地记录在LP-RAPD的指纹图谱中。因此，分析不同环境样品中微生物混合DNA经LP-RAPD获得的指纹图谱的差异，就可分析比较不同生态系统微生物群落的结构的差异，或者同一个群落在不同功能状态下、不同的外界环境条件下种群结构的变化情况。
对于复杂的环境样品，电泳分析LP-RAPD扩增得到的不同生态系统微生物群落指纹图谱，不同系统中有很多条带具有相同的电泳特性但其序列组成信息不同，仅从电泳图上只能分析DNA条带大小信息，不能看到更深层次的序列信息，结合混合探针杂交的技术，可以看到不同生态系统微生物指纹图谱的条带大小差异也可以看到各条带的序列信息的差异，从而可以实现对微生物群落结构的分析和比较。
本发明具有实质性特点和显著进步，所涉及的LP-RAPD技术应用到研究生态系统中微生物种群的结构，具有重复性高、简便、快速、灵敏的特点，可以快速、有效地同时平行分析不同生态系统的种群结构差异以及同一生态系统微生物种群结构的动态变化。为发现、鉴别和分离生态系统中的优势功能菌以及为调控生态系统的功能提供监测方法。结合微生物生态系统宏观功能的变化与微生物生态系统DNA指纹图谱的变化，进行分析比较，寻找规律。在DNA指纹图谱中，常常可以找到与功能变化相关的DNA条带，可能来源于环境中某种起重要作用(如苯酚降解)的功能菌。在这个已知序列片断的引导下从环境样品中直接鉴定分离得到降酚菌，通过发酵生产制成活菌制剂投放到污水处理厂，可大大提高活性污泥的降酚能力。根据来源于肠道功能菌基因组的已知序列，可以设计特异性检测肠道功能菌的探针和引物用来评价益生素等药物的药效及筛选药物等。
图1不同长引物对2例纯菌DNA和2例儿童肠道微生物DNA扩增的指纹图谱展示。所用引物如图中所示。样品编号1，arthrobacter nicotianae P1-7(AN)；2，klebsiella sp P8-14(KS)；3，3岁健康儿童样品(A)；4，4岁健康儿童样品(B)。M为分子量Marker。
图2.(a)用长引物LP1，LP3对2例6岁健康儿童3个月内4次取样的肠道微生物动态检测的指纹图谱展示；(b)相似性分析树状图。M为分子量Marker。
图3通过长引物LP1，LP2扩增和分子杂交技术比较分析悬浮污泥和生物模样品中微生物群落结构的差异。(a)指纹图谱，(b)分子杂交图谱。M为分子量Marker。
具体实施例方式
以下结合附图提供三项实施例。
实施例一比较研究由4对长引物扩增得到的2例个体肠道微生物指纹图谱的差异情况，同时检测其对2个不同种的纯菌的区别能力。研究中用到的长引物序列见表1。
表1实施例中用到的长引物PrimerPrimer sequencenameNE15’-AGTAAGTGACTGGGGT-3’NE25’-TATGTAAGCTCCTGGG-3’LP15’-GTTGATCAGTGTCGTTCCTG-3’LP25’-CCTTTCACTCCCTGATCACT-3’LP35’-CGACCTGCATTGATCTGTAG-3’人体肠道内定居着十分复杂而又相对稳定的微生物群落。据估计，1g湿重的粪便样品中有大约1011个微生物细胞，大概400种以上的不同类型。这些肠道内固有的微生物对人体健康有着重要的作用帮助消化、生产人体必需的维生素以及帮助人体抵御外来病原微生物的入侵等；据报道，结肠癌可能与肠道微生物种群结构的异常有关。因此，研究肠道微生物的种群结构进而研究肠道微生物的功能具有重要的理论与实际意义。
样品取自1例3岁健康儿童样品和1例4岁健康儿童样品。。收集新鲜的粪便样品，提取总DNA后，得到由长引物对LP1，LP3扩增得到指纹图谱，计算Sorenson相似性系数(pairwise similarity coefficient Cs)，比较凝胶电泳DNA指纹图谱、分子杂交DNA指纹图谱的相似性。Cs＝2j/(a+b)×100，其中a是一组DNA指纹图谱的条带数目，b是另一组DNA指纹图谱的条带数目，j是在两个图谱中共有条带的数目，两个完全不同的指纹图谱的Cs值是零，而完全相同的2个DNA指纹图谱的Cs值是100％。用这个相似性系数分析图1的结果是，从凝胶电泳图上看，2个纯菌与2例儿童粪便样品指纹图谱之间的相似系数Cs值见表2。
表2不同长引物对扩增纯菌和粪便样品DNA指纹图谱间相似性(Cs)分析NE1，NE2LP1，LP2 LP1，LP3 LP2，Lp3AN/KS 37％50％ 0 13％A/B54％44％ 47％ 50％表2数据表明首先，4对长引物可以很好的区别2例纯菌；1例3岁健康儿童和1例4岁健康儿童肠道微生物菌群结构的指纹图谱差异较大，与文献报道的用TGGE分析肠道菌群16S rDNA的技术得到的结论是一致的，即，每例健康个体均有各自独特的肠道菌群结构。
实施例2对2例健康儿童(C and D)肠道微生物菌群进行连续3个月动态监测，收集新鲜的粪便样品，提取总DNA后，得到LP-RAPD指纹图谱，计算Sorenson配对比较相似性系数(pairwise similarity coefficient Cs)，从凝胶电泳图上看(图2)，每例儿童4次取样的指纹图谱之间的最低相似性为86％和83％，两例儿童指纹图谱之间的相似系数Cs值为60％。据文献报道以及在后来的工作中均发现，健康个体肠道微生物的特有的优势菌群结构在至少一年内是稳定的，与建立的通过PCR/TGGE指纹图谱分析肠道微生物菌群结构得到的结论一致。
实施例3污水生物处理技术是环境保护中最重要的技术方法之一。其原理主要是通过微生物对各种有机污染物的降解作用使水净化。生物膜法处理污水是最为常用的一种处理工艺，其主体都是由各种细菌、真菌、藻类和原生动物等构成的复杂微生物生态系统，其中生物膜系统的微生物也会与悬浮污水中的微生物进行着相互交换，因此在对系统中微生物种群结构的研究中，人们常常从悬浮污水中取样研究，代替生物膜上的微生物。究竟悬浮污水样能否准确反应整个生物膜系统中微生物的菌群结构，通过长引物指纹图谱结合分子杂交技术对同一时间取到的2分样品进行分析比较，结果显示(图3)，长引物扩增得到的生物膜样的微生物DNA指纹图谱与悬浮污水样中微生物DNA的指纹图谱相似性为70％(根据杂交结果计算)，生物模样的指纹图谱条带更为丰富，微生物的浓度更高。这可能由于在生物膜上，微生物的停留时间较水样长，可以通过微生物新陈代谢更为充分的达到群落的平衡状态；在好氧环境下，也可能生物膜中存在一些厌氧的区域，而厌氧微生物在水样中就不能存在。用悬浮污水样替代生物模样来研究系统中微生物的组成结构低估了生态系统中微生物的总量和种类，取悬浮污水样研究整个生物膜系统微生物的结构和功能是不准确、不科学的。应当取生物膜样来研究生物膜系统的微生物菌群结构。
权利要求
1.一种分析比较微生物群落结构的监测方法，其特征在于1)选定一对LP-RAPD引物，长度15-24bp，(G+C)含量50％；2)环境样品中混合微生物总基因组DNA的提取；3)LP-RAPD-PCR循环反应，退火温度在52℃；4)待测生态系统微生物混合DNA的LP-RAPD产物经1.2-1.5％琼脂糖凝胶电泳；5)通过Southern-Blot印迹杂交检测。
2.根据权利要求1所述的这种并行比较微生物群落结构分子生态的监测方法，其特征是以下对监测方法进一步限定首先，设计研究目标微生物生态系统的LP-RAPD的引物，引物设计的原则是1对长度为15-24bases，(G+C)含量50％，并确定PCR反应的循环程序，LP-PCR的25μL PCR反应体系中，含模板80ng，23mM MgCl22.5μL，2.5mM的dNTP mix 2μL，20pmol的引物各1μL；PCR产物经DyNA quant200浓度测定后，取大约5μg PCR产物经MO BIOUltraClean PCR Clean-up DNA Purification kit纯化，纯化后经DyNA quant200进行浓度测定；探针标记体系含，纯化后的PCR产物3μg，10×六核苷酸混合物2μL，dCTP、dGTP、dATP各1mM、dTTP 0.65mM、DIG-11-dUTP 0.35mM的dNTPsmix 2μL，2u/μL的klenow酶1μL，水补足到20μL，37℃标记20h，反应结束后加4M LiCl 2μL，0.2M PH 8.0的EDTA 2.5μL，75μL冰冷的无水己醇，混匀后-20℃沉淀至少2h，之后14,000rpm/min离心30min，70％的己醇洗滴，14,000rpm/min离心30min，干燥后溶于50μL无菌水中；待测目标微生物生态系统混合DNA的LP-RAPD指纹图谱，经1.2％或1.5％琼脂糖凝胶电泳后，真空转迹于带正电荷的尼纶膜上；真空转迹、固定完毕后，将转移膜浸于50ml Blocking solution中，该溶液组成为0.1M马来酸，0.15MNaCl，1g Blocking reagent，PH 7.5，将膜卷于杂交管中，68℃预杂交至少30min，变性DNA探针，沸水中煮10分钟，大约500ng，立即置于冰盐混合物中，用含有探针的杂交液20ml更换预杂交液60℃杂交至少10h，回收含有探针的杂交液，贮存于-20℃，每次用之前68℃变性10min，杂交完毕后，先用50ml 2×SSC，0.1％SDS室温洗膜两次，每次15min；再用50ml 0.5×SSC，0.1％SDS68℃洗膜两次，每次15min，最后进行显色反应。
3.根据权利要求2所述的这种并行比较微生物群落结构分子生态的监测方法，其特征是，所述的真空转迹，其方法如下①真空转迹框保持清洁干燥，与缓冲瓶、真空泵连接；②将带口的塑料膜置于支持膜上，去离子水预湿的滤纸和转移膜，可以用硝酸纤维素膜或带正电的尼纶膜，先后倾斜45度角缓缓铺于塑料膜窗口下并完全覆盖该窗口，排除任何气泡；③凝胶倾斜45度角缓缓置于塑料膜窗口上，排除凝胶与转移膜间的气泡；④安装顶框，以四个夹子对称固定，打开真空泵固定凝胶；⑤加足够的溶液1，配方为去嘌呤液，0.25M HCl，覆盖凝胶，稳定真空泵在50mbar，所有进一步的处理均在50mbar进行；⑥7min后，倾斜转迹框，拥戴手套的手指轻轻去除凝胶表面液体；⑦加足够的溶液2，配方为变性液，1.5M NaCl，0.5M NaOH，覆盖凝胶，同上，等待7min，彻底移走残留的液体；⑧加足够的溶液3，配方为中和液，1.0M Tris，1.5M NaCl，PH 7.5，覆盖凝胶，同上，等待7min，彻底移走残留的液体；⑨加溶液4，配方为转移液，20×SSC，转移液覆盖凝胶的厚度为凝胶厚度的两倍，等待30～40min，彻底移走残留的液体；⑩关闭真空泵，移走凝胶，取出膜，紫外固定5min，室温干燥。
4.根据权利要求2所述的这种并行比较微生物群落结构分子生态的监测方法，其特征是，所述的显色反应，其方法如下①在Washing Buffer，配方为0.1M马来酸，0.15M NaCl，0.3％(v/v)Tween 20，PH 7.5，中简短洗膜1～5min，然后在100ml Blocking Solution中轻摇30min；②在20ml Antibody Solution中，轻摇30min，抗体以1∶5000稀释于Blocking Solution中；③在100ml Washing Buffer洗膜两次，每次15min；④在20ml Detection Buffer，配方为0.1M Tris，0.1M NaCl，PH 9.5，20℃，中平衡2～5min，用10ml新鲜配置的显色液再暗处显色，配方为加200μL的NBT/BCIP到10ml Detection Buffer中；⑤显色完毕后，将膜侵入去离子水中以终止反应，照相或扫描记录结果。
全文摘要
一种微生物生态学领域的监测方法，具体是一种分析比较微生物群落结构的监测方法。具体如下选定一对LP－RAPD引物，长度15－24bp，(G+C)含量50％；环境样品中混合微生物总基因组DNA的提取；LP－PCR循环反应，退火温度在52℃；待测生态系统微生物混合DNA的LP－RAPD产物经1.2－1.5％琼脂糖凝胶电泳；通过Southern－Blot印迹杂交检测。本发明具有重复性高、简便、快速、灵敏的特点，可以快速、有效地同时平行分析不同生态系统的种群结构差异以及同一生态系统微生物种群结构的动态变化。
文档编号G01N21/78GK1588010SQ200410066588
公开日2005年3月2日 申请日期2004年9月23日 优先权日2004年9月23日
发明者赵立平, 魏桂芳 申请人:上海交通大学