专利名称：痕量二恶英的生物检测方法
技术领域：
本发明涉及包含有核酸的检测方法，确切的说是一种通过分子生物学方法进行的基于芳香烃受体系统的痕量二恶英的生物检测方法。
背景技术：
二恶英(dioxins)是一类毒性很强的化合物的总称，慢性毒性研究已经证明其具有极强的致癌性、致畸性、免疫毒性、生殖毒性、肝毒性等。因其对人类健康危害非常大，日益成为当前的一个研究热点。二恶英类化学物质(dioxin-type chemicals，DTCs)主要包括多氯代二苯并二恶英(polychlorinated dibenzo-p-dioxins，PCDDs)，多氯代二苯并呋喃(polychlorinated dibenzo-p-furans，PCDF)和多氯联苯(polychlorinated biphenyls，PCB)，其中只有2，3，7，8四个共平面取代位置均为氯原子的17种二恶英同族体才有毒，其中研究最多也是最典型和毒性最强的物质为2，3，7，8-四氯代二苯并二恶英(TCDD)被认为是世界上毒性最强的化合物。但由于二恶英检测和分析费用昂贵，目前我国仅能进行少量样品的检测，对二恶英造成我国食品的危害程度还不完全清楚。因此，建立一种经济、快捷的食品中二恶英检测方法日益成为目前食品卫生检测工作中的重点。
目前二恶英类化学物质检测方法的研究主要集中于色谱法、免疫法和生物检测法三大类。
尽管目前认为高分辨气相色谱与高分辨质谱联用技术(HRGC-HRMS)是目前唯一适合的分析方法，但由于化学分析方法所使用的仪器价格昂贵，试样需多步分离、净化步骤十分繁琐，这一工作在大多数实验室不能开展。
色谱学方法是目前国际公认的检测二恶英类化学物质的标准方法，尤其是高效毛细管色谱加高分辨率质谱(以选择性离子方式)。其优点可以分离混合物中的每种组分，并进行准确的定量。其缺点需要有复杂的样品前处理过程，通常需要数天；要求有精密的仪器、良好的实验环境和训练有素的操作人员；需要标准品来进行定性和定量，但目前有些标准品还不具备；一般检测一个二恶英样品需要耗时数周至一个月，而且成本昂贵；色谱法仅能反映样本的二恶英类化学物质总量，并不能反映其生物效应。
免疫学方法以其选择性好、灵敏度高，在很多方面得到了应用。检测原理为放射性碘(125I)标记的二抗与二恶英竞争性地与一抗结合，然后通过检测沉淀物中放射性的减少来定量。虽然所需时间较短，操作相对较简单，对检测人员要求相对较松；检测样品的费用也较便宜。但利用二恶英为半抗原来免疫动物获得多克隆抗体这种方法有其自身的缺陷，首先用二恶英同系物与血清白蛋白偶联免疫家兔制备的抗体只能特异性识别这种特异性的抗原或某种与其结构/抗原性非常相似的物质。一方面针对不同待测物质需要制备不同的抗体，比较繁琐不适合对二恶英污染的筛查和检测工作；另一方面某些与其结构/抗原性相似的混杂物会对其造成假阳性的干扰。其次加之由于抗原本身对免疫宿主就有毒性，在一定程度上加大了获得高效价抗体的难度。
生物学方法与色谱学方法比较，虽然不能检测二恶英类化学物质的各个成分，但它简便、快速、费用低，并且能更准确地反映二恶英类化学物质对机体的影响。但是通过检测特异基因的表达产物来反映二恶英类化学物质的量，需要将样本的抽提物与细胞共同培养数天，收集细胞、裂解细胞、离心收集上清用于检测酶活性。这种检测方法需要进行细胞培养，检测周期比较长。虽然，细胞培养难度不大，但是极容易发生污染，为了防止污染要求有清洁度比较高的专门的细胞培养室，常常需要专门的细胞培养人员参与。
中国专利1661089A公开了一种“痕量二恶英的生物检测方法”，其是将二恶英与芳香烃受体形成的复合物与特异性核酸序列结合并保护其免受核酸外切酶III和核酸酶S1的降解，然后利用核酸扩增技术检测复合物结合保护的特异核酸序列，复合物结合的核酸序列与二恶英的量程比例关系。
发明内容
本发明就是为了解决现有技术中二恶英检测和分析费用昂贵，过程复杂，耗时较长的问题，而提供一种便捷、经济、快速的痕量二恶英的生物检测方法。
本发明是基于芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AhR)在二恶英的活化作用下能够与芳香烃受体核转运蛋白(aryl hydrocarbonreceptor translocator，ARNT)特异性结合的分子机制，利用pGEX-5X-1质粒分别克隆表达ARNT和AhR的片段AhR1的融合蛋白，并用AhR1免疫家兔，然后进行抗体纯化获得专门针对AhR的特异性抗体。将ARNT的融合蛋白与含有生物活性AhR的小鼠肝细胞匀浆提取液进行温育结合，并在温育结合体系中加入不同浓度的TCDD。然后采用亲和吸附及免疫印渍(Western Blot)等方法来研究AhR与ARNT结合的程度与TCDD的剂量反应关系，以此为基础来建立快速的痕量二恶英的生物检测方法。
本发明是按以下技术方案实现的。
一种痕量二恶英的生物检测方法a.小鼠肝组织中抽提总RNA，通过逆转录PCR扩增目的基因AhR、ARNT、AhR1，酶切产物纯化后与pGEX-5X-1质粒进行连接，构建了含外源目的基因的重组质粒；b.制备感受态细胞及转化重组质粒，进行融合蛋白GST-AhR、GST-ARNT、GST-AhR1的诱导表达与纯化；c.将大量表达的ARNT全长融合蛋白GST-ARNT与从C57BL/6J纯系小鼠中提取的富含AHR的胞浆提取液在TCDD存在的条件下温育结合，得到二聚体复合物；d.利用Glutathione Sepharose 4B珠子对该二聚体复合物进行亲和吸附，用目的蛋白GST-AhR1制备的多克隆免疫血清为一抗，通过免疫印渍方法对二聚体复合物的结合情况进行检测。
所述痕量二恶英的生物检测方法，其AhR全长上游引物5′-gatgagcagcggcgccaac-3′下游引物5′-ggccggctcgagtcaactctgcaccttgctta-3′下游引物加入了Xho I的酶切位点和终止密码子TCA；ARNT全长上游引物5′-ccggccgaattcatggcggcgactacagc-3′下游引物5′-ggccggctcgagctattcggaaaagggggga-3′上游引物加入了EcoR I的酶切位点，下游引物加入了Xho I的酶切位点和终止密码子CTA；AhR1(AhR的bHLH PAS区)下游引物5′-ggccggctcgagtcagggcagcgacgtacttc-3′下游引物加入了Xho I的酶切位点和终止密码子TCA。
所述痕量二恶英的生物检测方法，其取目的蛋白GST-AhR1与等体积的弗氏完全佐剂混匀，并充分乳化，免疫家兔，得到实验所需的多克隆免疫血清。
所述痕量二恶英的生物检测方法，其酶切产物纯化后与质粒载体进行连接是将目的基因AhR、ARNT、AhR1与pGEX-5X-1质粒按3∶1的比例混合在T4 Ligase作用下室温进行。
所述痕量二恶英的生物检测方法，其向富含AhR的C57BL/6J小鼠肝细胞提取液中加入融合蛋白ARNT和不同浓度的TCDD样本，于由25mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，1.2mM乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，10％丙三醇，200mM NaCl，0.1％乙基苯基聚乙二醇(NP-40)制备的pH为7.4的结合缓冲液中在20℃振荡孵育2小时得到二聚体复合物。
本发明采用的Western Blot检测水平为5ng，由于TCDD对AhR活化和进一步与ARNT形成复合物是以等摩尔的关系进行的，由于AhR的分子量较大(约为95KD)，为TCDD的三百倍，因此通过使用专门针对AhR的特异性抗体作为一抗所作的Western Blot检测，其5ng水平的检测下限反映到TCDD则相应提高三百倍，达到pg水平。
本发明具有的优点是1.本发明基于二恶英作用的芳烃受体细胞信号传导机制，通过配基与受体、蛋白与蛋白、蛋白与特定核酸序列等生物特异性的结合实现的，因此，将显著地提高检测方法的选择性和灵敏度。
2.由于环境中存在的二恶英以其混合物形式存在，而本发明可以直接对样品中二恶英混合物的生物毒性进行综合评价，可以直接计算出毒性当量(TEQs)。
3.芳烃受体细胞检测方法的研究，因选用的组织提取液做为实验中使用的芳烃受体和芳烃受体核转位蛋白的来源，遇到困难。而利用易于保持表达蛋白生物活性的pGEX-5X-1质粒载体，在大肠杆菌中克隆表达研究所需的芳烃受体(AhR)与芳烃受体核转位蛋白(ARNT)两种蛋白质，可以为检测体系中所需的蛋白质提供一个简便稳定的来源。
因此，本发明建立的一种特异性很强的二恶英生物快速检测方法，其快速、便捷、经济的特征便于更广泛的应用于食品中痕量二恶英的筛查。
本发明非常适合日常检测与普查工作，在食品卫生监测、环境卫生监测以及职业卫生监测等领域中都有着广泛的应用前景。
图1是ARNT全长基因序列；图2是AhR全长基因序列。
具体实施例方式
一.逆转录PCR(RT-PCR)扩增目的基因1.处死小鼠，取出肝脏、迅速置于液氮中。从液氮中取出样品剪取组织，放入预冷的Trizol中，匀浆。向匀浆中加入氯仿，充分震荡混匀，静置分层。4℃，12000rpm离心15min后，将RNA所在的水相转移到无菌的Rnase-free新管中。加入异丙醇(4℃预冷)混匀，放置30min。离心10min后，小心弃去上清，沉淀用1ml 75％的乙醇洗涤2次，重复离心。用一次性吸头吸除残存的乙醇。用50μlDEPC-H2O溶解沉淀，RNA溶液储存于-70℃。
2.抽提的总RNA为模板，分别采用AhR、ARNT、AhR1引物，AhR(全长)上游引物5′-gatgagcagcggcgccaac-3′下游引物5′-ggccggctcgagtcaactctgcaccttgctta-3′下游引物加入了Xho I的酶切位点和终止密码子TCA；ARNT(全长)上游引物5′-ccggccgaattcatggcggcgactacagc-3′下游引物5′-ggccggctcgagctattcggaaaagggggga-3′上游引物加入了EcoR I的酶切位点，下游引物加入了Xho I的酶切位点和终止密码子CTA；AhR1(AhR的bHLH PAS区)下游引物5′-ggccggctcgagtcagggcagcgacgtacttc-3′下游引物加入了Xho I的酶切位点和终止密码子TCA；为了保证限制性内切酶的切割效率，在内切酶位点5′端再附加六个保护性碱基利用逆转录酶Superscipt II，合成互补DNA(cDNA)第一链，反应条件42℃ 60min，70℃ 15min。③以逆转录生成的cDNA第一链为模板，借助能够产生平末端的pfu聚合酶来进行PCR反应，93℃变性40s，58℃复性1min，72℃延伸1min，循环30次，从而使目的基因得到扩增。
二.将PCR扩增产物酶切，将酶切产物纯化后与质粒载体进行连接，从而构建含外源目的基因的表达质粒1酶切在PCR产物中加入1/10体积的乙酸钠(NaAC)溶液，混匀后加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀20min。离心15min，弃上清，用1ml 70％乙醇洗涤，再次离心15min。弃上清，真空干燥沉淀。加灭菌水，使之溶解。然后根据其浓度向管中加入两种限制性内切酶，建立酶切体系(双酶切)，37℃，酶切2h。取2μl pGEX-5X-1质粒，也加入同样的两种限制性内切酶，建立酶切体系(双酶切)37℃，酶切2h。
2纯化与连接将目的基因AhR、ARNT、AhR1与pGEX-5X-1质粒按3∶1的比例混合在T4 Ligase作用下室温进行连接。
三.制备感受态细胞及转化重组质粒
1.挑取E.Coli DH5α原菌的单克隆菌落于2ml LB培养基中，37℃过夜培养。次日将菌液稀释到80ml新鲜的LB培养基中，续振荡培养。将80ml菌液在冰上放置，使培养物冷却，离心。弃上清，用冰预冷的NaCl洗涤沉淀，重悬后离心，弃上清，用冰预冷的CaCl2重悬细菌沉淀，冰上放置20min。离心弃上清，加冰预冷的CaCl2重悬细胞，即为感受态细胞。
2.感受态细胞加连接产物，轻旋混匀。42℃水浴加热90sec后迅速转移至冰水中冷却。补加LB培养基，温育45min，取含目的DNA的菌液800μl涂于AMP(50μg/ml)固体培养基平皿上，于恒温培养箱中37℃培养12～16h。
四.融合蛋白GST-AhR、GST-ARNT、GAT-AhR1、的诱导表达与纯化挑取单菌落过夜培养。次日按1∶100稀释到新鲜的LB/AMP培养基中，37℃继续培养。达到确定的OD600值后，加IPTG(异丙基-硫代-β-D-半乳糖苷)至终浓度0.1mM，20℃诱导3h(或37℃诱导5h)，将细菌培养物离心，弃上清用少量冰预冷的MTPBS(NaCl 150mM，Na2HPO416mM，NaH2PO44mM，调pH值至7.3)洗涤细胞，离心去除洗涤液。用MTPBS重悬细胞，加PMSF(苯甲基磺酰氟)，挑加少量溶菌酶，于液氮及37℃水浴中反复冻融。挑加DNase，使细菌裂解液的粘稠度明显降低。加入Triton X-100，旋转混合。离心收集上清，加入亲和层析珠Glutathione Sepharose 4B(珠体积)，旋转结合。自然沉降去上清，珠子用预冷的MTPBS洗涤。用5mM谷胱甘肽-Tris缓冲液洗亲和层析珠，得到目的蛋白的融合蛋白。
五.制备多克隆免疫血清本发明采用的是中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所2002年发表在Cell Research上的一篇文章中介绍的免疫方法，该方法免疫全程通常为35天，与传统的免疫方法(2个月左右)相比，不仅耗时比较短，而且所获多克隆免疫血清的效价较高。选用2.5月龄、体重1.5～2.0千克的新西兰大白兔两只，适应性饲养一周后开始免疫。取目的蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混匀。用两只塑料管连接的10ml玻璃注射器反复推吸，使蛋白液体与佐剂充分乳化。剪去家兔背部脊柱两侧的长毛，用酒精消毒。然后将乳化好的蛋白与佐剂的混合物在家兔颈后背部脊柱两侧进行皮下注射，于第一天、第三天、第28天分别免疫一次。于第35天再次耳缘静脉取血1.5ml，通过Westen Blot检测抗体效价。通过颈动脉放血收集抗血清。采集的免疫兔全血经37℃凝血2h后4℃过夜，次日取出，2,000～3,000rpm离心5min，将上层血清转移至另一离心管中，56℃水浴1h以灭活补体，然后13,000rpm离心10min，此次得到的上层血清即为实验所需的多克隆抗体，将抗体分装，-20℃保存，待Western Blot中作为一抗使用。
六.从C57BL/6J纯系小鼠肝脏中提取富含AhR的胞浆提取液成年雌、雄性小鼠用颈椎脱臼法处死，取其肝脏，用150mM冰预冷的氯化钾溶液洗脱，于HEDG buffer(含25mM HEPES pH7.5，1mM EDTA，1MmDTT，10％(v/v)甘油)中匀浆，于4℃，10,000g离心20min，小心移取浮于上层的线粒体，在4℃下105,000g离心1小时，弃去沉淀，将上清分装并于-80℃保存。
七.将ARNT全长融合蛋白与AhR胞浆提取液在TCDD存在的条件下温育在C57BL/6J的AhR肝细胞提取液中加入融合蛋白ARNT和含不同浓度的TCDD(TCDD溶于二甲基亚砜，使得终浓度为0.2％二甲基亚砜)样本，于结合缓冲液(25mM HEPES，1.2mM EDTA，10％丙三醇，200mMNaCl，0.1％NP-40，pH7.4)中在20℃振荡孵育2小时得到二聚体复合物。
八.对两种蛋白质的结合情况进行检测1.向二聚体复合物中加入Glutathione Sepharose 4B珠子，4℃旋转结合60min，用5mM谷胱甘肽-Tris缓冲液洗脱蛋白。
2.将蛋白上样，走聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后正确安装转移装置，将蛋白质转移至硝酸纤维素滤膜上。
3.加入可以与目的蛋白特异性结合的一抗即多克隆免疫血清，反应后将未结合的一抗洗去；再加入连着一种酶标记的二抗，反应后将未结合的二抗洗去；最后加入显色底物，二抗上连带的酶可以将无色的底物转变成有色物质，从而识别目标蛋白。
SEQUENCE LISTING<110>天津医科大学<120>二恶英类物质的检测方法<130>DNA<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2623<212>DNA<213>ARNT<220>
<221>ARNT<222>(1)..(2623)<223>
<400>1ccatctcgac catggcggcg actacagcta acccagaaat gacatcagat gtaccatcgc60tgggtcccac cattgcttct ggaaaccctg gacctgggat tcaaggtgga ggagctgttg120tacagagggc tattaagcga cggtcagggc tggattttga tgatgaagta gaagtgaaca180ctaaattttt gagatgcgat gatgaccaga tgtgtaatga caaggagcgg tttgccaggt240cggatgatga gcagagctct gcggataaag agagacttgc cagggaaaat catagtgaaa300tagaacggcg gcgacggaac aagatgacag cttacatcac agaactgtca gacatggtac360ctacatgtag tgccctggct cgaaaaccag acaagctaac catcttacgc atggccgttt420ctcacatgaa gtccttgagg ggaactggca acacatctac tgatggctcc tacaagccat480ctttcctcac tgatcaggaa ctgaaacatt tgatcttgga ggcagcagat ggctttctgt540ttattgtctc ctgtgagact ggacgggtgg tgtatgtctc tgactcagtg actcccgttt600tgaaccagcc acagtctgaa tggttcggga gcacactgta tgatcaggtg cacccagatg660atgtggataa acttcgagag cagctctcta catcagaaaa tgccctaaca gggcgggtcc720tggatctgaa gactggaaca gtgaaaaagg aaggccagca gtcttccatg aggatgtgca780tgggctcacg aaggtcgttc atctgccgca tgaggtgtgg tactagctcc gtggaccctg840tttccatgaa tagactgagc tttttgagga acagatgcag gaatgggctt ggctctgtga900aggaaggaga acctcacttt gtggtagtcc actgcacagg ctacatcaag gcctggccac960cagcaggtgt ctccctccca gatgatgacc cagaggctgg ccaggggagc aaattctgcc1020tagtggccat tggcaggctg caggtaacta gttctcccaa ctgtacagac atgagtaaca1080tttgtcagcc aacagagttc atctcccgac acaacattga agggatattc acttttgtag1140accatcgttg tgtggctact gttggctacc agccacagga gctcttaggg aagaatattg1200tagaattttg tcatcctgaa gaccaacaac ttctaagaga cagctttcag caggtggtga1260aattaaaagg tcaggtgctg tccgtcatgt tccgattccg atctaagacc cgagaatggc1320tgtggatgag aacgagctcc tttaccttcc aaaaccctta ttcagatgaa attgagtata1380ttatctgcac caacaccaat gtgaagaact ctagccagga accacggcct acactgtcca1440acaccatccc aaggtcacaa ctaggtccga cagccaattt atccctagag atgggtacag1500ggcagctgcc atccaggcag cagcagcagc agcacacaga actggatatg gtaccaggaa1560
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<221>AhR<222>(1)..(2418)<223>
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权利要求
1.一种痕量二恶英的生物检测方法，其特征在于a.小鼠肝组织中抽提总RNA，通过逆转录PCR扩增目的基因AhR、ARNT、AhR1，酶切产物纯化后与pGEX-5X-1质粒进行连接，构建了含外源目的基因的重组质粒；b.制备感受态细胞及转化重组质粒，进行融合蛋白GST-AhR、GST-ARNT、GST-AhR1的诱导表达与纯化；c.将大量表达的ARNT全长融合蛋白GST-ARNT与从C57BL/6J纯系小鼠中提取的富含AHR的胞浆提取液在TCDD存在的条件下温育结合，得到二聚体复合物；d.利用Glutathione Sepharose 4B珠子对该二聚体复合物进行亲和吸附，用目的蛋白GST-AhR1制备的多克隆免疫血清为一抗，通过免疫印渍方法对二聚体复合物的结合情况进行检测。
2.根据权利要求1所述痕量二恶英的生物检测方法，其特征在于AhR全长上游引物 5′-gatgagcagcggcgccaac-3′下游引物 5′-ggccggctcgagtcaactctgcaccttgctta-3′下游引物加入了Xho I的酶切位点和终止密码子TCA；ARNT全长上游引物 5′-ccggccgaattcatggcggcgactacagc-3′下游引物 5′-ggccggctcgagctattcggaaaagggggga-3′上游引物加入了EcoR I的酶切位点，下游引物加入了Xho I的酶切位点和终止密码子CTA；AhR1下游引物 5′-ggccggctcgagtcagggcagcgacgtacttc-3′下游引物加入了Xho I的酶切位点和终止密码子TCA。
3.根据权利要求1所述痕量二恶英的生物检测方法，其特征在于取目的蛋白GST-AhR1与等体积的弗氏完全佐剂混匀，并充分乳化，免疫家兔，得到实验所需的多克隆免疫血清。
4.根据权利要求1所述痕量二恶英的生物检测方法，其特征在于酶切产物纯化后与质粒载体进行连接是将目的基因AhR、ARNT、AhR1与pGEX-5X-1质粒按3∶1的比例混合在T4 Ligase作用下室温进行。
5.根据权利要求1所述痕量二恶英的生物检测方法，其特征在于向富含AhR的C57BL/6J小鼠肝细胞提取液中加入融合蛋白ARNT和不同浓度的TCDD样本，于由25mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1.2mM乙二胺四乙酸二钠，10％丙三醇，200mM NaCl，0.1％乙基苯基聚乙二醇制备的pH为7.4的结合缓冲液中在20℃振荡孵育2小时得到二聚体复合物。
全文摘要
本发明公开了一种痕量二恶英的生物检测方法，属于包含有核酸的检测方法。本发明依据芳烃受体在二恶英的活化作用下与芳烃受体核转位蛋白特异性结合的分子机制，利用pGEX－5X－1质粒分别克隆表达ARNT和AhR的片段AhR 1的融合蛋白，并用AhR 1免疫家兔制备抗体；将融合蛋白ARNT与含有生物活性的AhR的鼠肝细胞浆提取液进行温育结合，加入不同浓度的TCDD。采用免疫印渍等方法研究AhR与ARNT结合的程度与TCDD的剂量反应关系。本发明方法易于操作、能节省大量的经济成本和时间成本，适合于日常检测和普查工作，在食品卫生、环境卫生以及职业卫生检测等领域有着广泛的应用前景。
文档编号G01N33/546GK101074953SQ20061001378
公开日2007年11月21日 申请日期2006年5月19日 优先权日2006年5月19日
发明者张万起, 宓怀风, 汤乃军, 沈钧, 吴蕴棠, 孙忠, 王卓, 赵娜 申请人:天津医科大学